恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

一、恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析（论文文献综述）

蔡绍雨,董莹^[1]（2013）在《恶性疟原虫体外培养技术及其在生物学研究中的运用》文中进行了进一步梳理自从1912年Bass等首次报道体外培养恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,Pf）以来,学者们对体外培养恶性疟原虫的技术和营养环境优化研究从未停止过,直到1976年Trager和Haynes先后宣布疟原虫连续体外培养成功。本文对近年来疟原虫红外期体外培养技术及其改良方法,以及利用体外培养恶性疟原虫进行红外期疟原虫生物学特性超微结构、生理生化、药理学研究的进展作简要概述。

韩凯凯^[2]（2011）在《捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究》文中研究说明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫,分布较广,寄生于反刍动物第四胃,偶见于小肠,因吸血常常导致贫血、消瘦、严重时甚至死亡,对畜牧业造成重大经济损失。目前防治该病方法主要是化学药物驱虫,但由于虫体抗药性的产生以及药物残留和药物污染等问题,迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病。本文进行了捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, HcGAPDH）特性研究及其疫苗免疫保护试验；同时对捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase, HcENO）进行了生物学特性研究,克隆得到捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶基因序列并对其进行了生物信息学分析,主要工作如下：1.捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶特性的研究根据GenBank上登录的捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因EST序列（登录号为AW670737,登录长度为362bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知区和3’端未知区,从而拼接得到HcGAPDH基因的全长cDNA,然后将该序列递交GenBank（登录号为HM145749）。后经分析发现：该基因全长1303bp,含有最大开放阅读框（ORF）为1026bp,5’非翻译区（5’-UTR）长90 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长175bp。根据此基因的全长cDNA设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出约1000bp的产物,测序结果与推导出的ORF序列一致。BLAST分析后将该片段克隆到pET-28a（+）载体中,转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约38kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗,Western blot分析结果显示在38kDa处出现特异性条带。用HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗,Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达,结果在38kD处有明显条带,与推测ORF的蛋白大小无明显区别。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化活性,其最适pH值为8,最适反应温度为40℃。2.捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶虫体组织分布的研究为了研究捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, HcGAPDH）在虫体中的分布与定位情况,我们应用常规方法表达已构建好的pET28a-HcGAPDH, GE纯化柱纯化后,免疫SD大鼠制备抗血清。浓缩型S-P免疫组化3步法检测HcGAPDH抗原在捻转血矛线虫体内的分布和表达。结果发现,HcGAPDH主要定位于小肠微绒毛上皮,在其他部位则鲜见。3.捻转血矛线虫pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗的构建与体内表达情况的检测利用DNA重组技术,构建pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗。经酶切鉴定后,腿部肌肉免疫小鼠,1周后取肌肉注射部位、非注射部位组织,利用RT-PCR和Western-blot技术分别检测DNA疫苗的转录与表达情况。RT-PCR检测结果显示,小鼠注射部位肌肉所扩增出的目的条带大小约为1000bp,非注射部位中未能检测到目的条带,从而说明重组质粒在注射部位可以成功转录；VVestern blot检测结果发现,在注射部位检测到大小为38kD的目的蛋白条带,而非注射部位未能检测到目的蛋白的条带,这些结果都为下一步的动物保护性试验奠定了基础。4.捻转血矛线虫pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗的免疫保护性试验使用DNA疫苗pVAX1-HcGAPDH,对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验。健康山羊15只,随机分成3组,每组5只。一组免疫100μg pVAX1-HcGAPDH,其他两组为不攻虫对照组和攻虫对照组。在试验山羊的背部皮下多点注射免疫,两个对照组用1m1PBS代替DNA疫苗,一共免疫两次,中间间隔2周。第二次免疫14天后,疫苗免疫组和攻虫对照组山羊口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫。从攻虫后22至34天,每隔一天收集粪便,虫卵计数。攻虫后35天,屠宰山羊并剖解皱胃,分离雌雄虫体,进行成虫计数。同时,采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法,测定了所有试验山羊血清特异性IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中特异性IgA浓度。在免疫前、首免后14d、二免后14d、攻虫后14d和杀羊前对以下指标进行检测：利用ELISA试剂盒检测血清细胞因子（IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22）的浓度变化；利用流式细胞术检测了所有试验山羊外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞的变化；利用全自动电子血细胞分析仪对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测。结果显示,DNA疫苗pVAX1-HcGAPDH免疫山羊后,ELISA检测结果表明血清IgG在首免后14天达到较高水平,二免后抗体水平进一步升高；血清IgA在免疫后出现较高水平的滴度,同时杀羊后发现胃粘膜组织匀浆具有较高的滴度,免疫后山羊CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞水平显着高于不攻虫对照组,同时细胞因子检测免疫组IL-4水平上升显着,IFN-γ、TGF-β、IL-22变化规律性不明显。分析试验山羊血细胞发现,免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显着高于不攻虫对照组。5000条捻转血矛线虫三期幼虫攻击试验山羊后,免疫组虫卵减少率为34.9%,雌虫、雄虫和成虫总数减少率分别为39.23%,36.03%和37.73%,说明pVAX1-HcGAPDH对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定效果。5.捻转血矛线虫烯醇化酶特性的研究根据GenBank上登录的捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase）基因EST序列（登录号为BF422728,登录长度为482bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知区和3’端未知区,从而拼接得到Enolase基因的全长cDNA。分析发现：该基因全长1583bp,含有最大开放阅读框（ORF）为1305bp,5’非翻译区（5’-UTR）长62 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长21 6bp。根据Enolase基因的全长cDNA设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出约1300bp的产物,将该片段克隆到pET-28a（+）载体中,转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约49kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗,Western blot结果显示在49kDa处出现特异性条带。HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗,用Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达,结果在49kDa处有明显条带,与推测ORF的蛋白大小近似。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性,其最适pH值为7。6.捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶的生物信息学分析根据GenBank上登录的捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase, HcPGK）基因EST序列（登录号为CB192372,登录长度为584bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知序列和3’端未知序列,从而拼接得到PGK基因的全长cDNA。利用生物信息学网站的各种在线分析工具,对其进行分析发现：该基因全长1584bp,最大开放阅读框（ORF）为1254 bp,5’非翻译区（5’-UTR）长95 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长235 bp。该基因编码417个氨基酸,相对分子量理论预测值为44,594 Da。存在多个潜在的生物活性功能位点,蛋白的理化性质稳定。有17个主要的B细胞抗原表位,这些为下步研究奠定了基础。

方强^[3]（2010）在《间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究》文中指出研究背景:疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传染病,也是一个严重影响我国人民健康的重要问题。间日疟虽然病死率低于恶性疟,但流行范围更为广泛,我国的疟疾流行亦以间日疟为主。而且,间日疟的危害一直被低估,相应的研究也落后于恶性疟,有必要加强间日疟防治的研究。疟疾诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节,现有的病原学和分子生物学的诊断方法已不适应疟疾现场防治的需要。以检测疟原虫特异性抗原为诊断靶标的快速免疫诊断方法已在疟疾现场防治中得以应用并取得良好效果。但现有的疟疾快速免疫诊断方法尚不能特异性诊断间日疟,间日疟的现场防治中亟需间日疟特异性快速免疫诊断方法。建立cDNA文库,筛选调取功能性基因是一种成熟的发现功能基因（包括诊断靶标、疫苗候选分子等）的策略,目前尚无高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库,因此,建立高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库对筛选调取包括间日疟特异性诊断靶标在内的功能基因,促进我国疟疾防治工作具有重要意义。谷氨酸脱氢酶（GDH）为疟原虫糖酵解中的关键酶,是一个潜在的诊断靶标,已建立的恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（PfGDH）快速免疫诊断方法已显示了较满意的效果。但间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（PvGDH）尚未见报道。因此,克隆表达PvGDH,并制备抗PvGDH特异性单抗,可为进一步研制以PvGDH为诊断靶标的间日疟原虫特异性快速免疫诊断试剂奠定基础,从而为间日疟防治提供有力工具。第一部分红内期间日疟原虫全长cDNA文库的构建与鉴定目的:构建中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。方法:自未经治疗的确诊间日疟患者静脉采血,滤过去除白细胞后浓集含虫红细胞,提取总RNA,RT-PCR法逆转录合成cDNA第一链,LD-PCR合成cDNA第二链及双链cDNA,经蛋白酶K消化、Sfi I酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经Sfi I酶切的质粒载体连接,转化入DH5α感受态细胞。测定文库的库容和重组率。随机挑选48个菌落,以M13+-引物进行PCR,鉴定插入cDNA片段大小。结果:构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库原始库容为1.14×106,重组率为97.2%。重组子插入cDNA片段大小为9002500bp之间。结论:成功构建了中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。第二部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达目的:克隆表达间日疟原虫谷氨酸脱氢酶。方法:根据推测的PvGDH编码基因设计特异性引物,采用PCR自构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库扩增PvGDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定后,亚克隆至pCOLDⅡ载体进行表达。通过ELISA和Western-blot检测正常人血清、间日疟患者血清、恶性疟患者血清与rPvGDH的免疫反应性;以表达的rPvGDH免疫小鼠制备抗血清,通过ELISA检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;并以Western-blot检测抗血清与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。结果:PCR产物电泳结果显示所克隆的基因约为1450bp,基因测序结果显示克隆的基因为1442bp,与GenBank间日疟原虫Sal-I株基因组测序预测PvGDH编码基因有3个碱基差异,但编码氨基酸无差异,无内含子。经原核表达获得可溶性的PvGDH重组蛋白（rPvGDH）,可为间日疟患者血清和恶性疟患者血清所识别,而不能被正常人血清识别。制备的PvGDH抗血清可以识别rPvGDH、间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原,而不能识别正常红细胞抗原。结论:成功克隆了PvGDH,并表达了具有免疫学活性的rPvGDH。第三部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶线性B细胞表位的预测与鉴定目的:预测并鉴定PvGDH线性B细胞表位。方法:利用生物信息软件分析PvGDH、PfGDH序列,预测PvGDH、PfGDH线性B细胞表位,并比较分析,预测特异性PvGDH线性B细胞表位;合成预测PvGDH线性B细胞表位肽,免疫小鼠,制备抗血清;通过ELISA和Western-blot检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;通过Western-blot检测抗血清与与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。结果:预测出1个特异性PvGDH线性B细胞表位;该预测表位肽抗血清可以识别rPvGDH和间日疟原虫抗原,而不能识别恶性疟原虫抗原和正常红细胞抗原。结论:预测并鉴定成功1个特异性PvGDH线性B细胞表位。第四部分抗PvGDH单克隆抗体研究目的:分别通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽制备抗PvGDH单抗。方法:分别利用rPvGDH和PvGDH预测表位肽作为免疫原免疫小鼠,制备抗PvGDH单克隆抗体,并检测制备的单抗的滴度和抗体亚类;通过ELISA和Western-blot检测制备的单抗与rPvGDH的免疫反应性。结果:通过rPvGDH制备了4株单抗,通过PvGDH预测表位肽制备6株单抗,抗体滴度均大于1:2430;通过PvGDH预测表位肽制备的单抗中有2株抗体亚类为IgG1,其余均为IgG2b。10株单抗均可有效识别rPvGDH。结论:成功地通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽2种方法制备得到10株抗PvGDH单抗。

李雪平,杨亚明,董莹^[4]（2009）在《疟疾诊断试剂盒的研究进展》文中指出

单志新,余新炳,马长玲,徐劲,吴忠道,陈守义,胡旭初^[5]（2004）在《恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序》文中指出目的克隆、测定恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）成熟疟原虫感染红细胞表面抗原（MESA）基因序列,并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫Palo-alto株MESA基因已知序列,设计合成四对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段,分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列,拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1/HN株MESA基因片段,酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明,FCC1/HN株MESA全基因编码区长4102bp,A+T含量为72.11%,G+C含量为27.89%,有1个内含子;编码1323个氨基酸残基,分子量为154470u。序列分析表明,FCC1/HN株与Palo-alto、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性,序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析,有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1/HN株MESA基因序列。FCC1/HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。

单志新,余新炳,徐劲,吴忠道,马长玲,李学荣^[6]（2002）在《3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析》文中提出目的 测定我国恶性疟原虫海南株 （FCC1/ HN）谷氨酸富集蛋白 （GARP）、丝氨酸重复抗原 （SERA）和裂殖子表面蛋白 1（MSA1）基因序列 ,并进行序列分析。 方法 采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。 结果 恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 （S）残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。 结论 了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的?

单志新,余新炳,李学荣,马长玲,徐劲,罗树红,吴忠道^[7]（2002）在《恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析》文中指出目的 测定恶性疟原虫海南 （FCC1/HN）株裂殖子顶端膜抗原 1（AMA - 1）基因和Pfs2 30基因序列 ,并分别进行序列分析。方法 根据AMA - 1基因已知序列合成一对引物 ,用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增AMA - 1基因 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3 -AMA - 1。根据Pfs2 30基因已知序列合成七对引物 ,分 7段从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs2 30基因 ,并分别将扩增片段插入pMD - 18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定克隆的AMA -1、Pfs2 30基因序列 ,应用DNAstar软件辅助进行序列分析和同源性比较。结果 PCR扩增得到恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1和Pfs2 30基因片段。恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1基因全长 186 9bp ,无内含子 ,编码 6 2 2个氨基酸残基 ,不存在氨基酸重复序列 ,相对分子量约 72 0 4 5kDa ;Pfs2 30基因全长 94 35bp ,无内含子 ,编码 314 4个氨基酸残基 ,分子量为36 4 36kDa。恶性疟原虫FCC1/HN株与FC2 7、7G8、CAMP、FCR3、Thai -Tn、3D7、FVO、KF1916、CMP1、HB3、K1和V1株AMA - 1的同源性在 94 9%以上 ,各株间有 5 3个位置相同的氨基酸残基替代位点 ,并且发生替代的氨基酸残基具二态性。FCC1/HN株分别比 3D7、7G8株Pfs2 30抗原多 9、10个氨基酸残基 ,三个分离株有 2 8个氨基酸替换?

单志新,余新炳^[8]（2002）在《恶性疟原虫红内期Pf332抗原基因未知序列的测定及分析》文中研究表明测定恶性疟原虫红内期Pf332抗原 （Ag332 ）基因的未知序列 ,并进行序列分析 .根据非洲恶性疟原虫Palo alto株Pf332基因的G1片段序列 ,设计 1对引物 ,从中国恶性疟原虫海南株 （FCC1 HN）基因组DNA中扩增出P332 1片段 .Pf332基因中经常出现SVTEEI短肽的编码序列 ,据此分别设计非特异的正、反义寡核苷酸引物 （NSP1、NSP2 ） ,应用低严谨PCR（LSPCR）分别扩增出P332 1邻近的未知序列片段P332 up1和P332 dow1.根据恶性疟原虫Palo alto株Pf332基因G1片段上、下游的G9和C1片段序列以及测定的P332 up1和P332 dow1序列 ,分别设计 2对特异引物继续扩增邻近的未知序列片段P332 up2和P332 dow2 .根据P332 dow2片段的 3’端序列 ,设计 2条特异引物分别与非特异引物NSP2行LSPCR和巢式PCR ,扩增出P332 dow2邻近的未知序列片段P332 dow3.对获得的Pf332基因片段进行序列测定 ,并用分子生物学软件辅助进行序列分析 .序列测定和拼接结果显示 ,共获得了连续 6 14 4bp的恶性疟原虫FCC1 HN株Pf332基因序列 .序列分析表明 ,所获得的 614 4bp序列位于Pf332基因的编码区内 ,不含内含子 ,编码 2 0 4 8个氨基酸残基 ,包含 5个氨基酸残基重复区 .对恶性疟原虫FCC1 HN株Pf332基因 6 14 4bp序列的测定和分析 ,为获得Pf332全基因

单志新,余新炳,徐劲,陈守义,李学荣^[9]（2002）在《恶性疟原虫海南株MESA基因的序列分析》文中提出

李林海^[10]（2002）在《恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及产物抗原活性研究》文中提出疟疾是广泛流行于热带、亚热带及温带边缘的一种重要虫媒传染病，极大地威胁着人类的健康。疟疾的早期诊断和早期正规治疗是WHO和我国疟疾控制的研究重点，其意义在于不仅能够降低重症病人和死亡的发生，还能防止其传播，延缓疟原虫对抗疟药产生抗性。疟疾流行区由于熟练镜检技术人员及设备缺乏，仅依靠传统厚薄血膜镜检法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要。八十年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术（分子杂交，PCR、套式PCR、荧光定量PCR等），显示了较高的敏感性和特异性，可以对疟原虫的感染作出早期快速诊断，但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，难以在基层推广应用。近年来以检测疟原虫合成并分泌的特异性抗原为基础的免疫学方法，尤其是以单抗为基础的Dipstick技术，由于其操作简便、快速，结果易于判定，已成为疟疾诊断研究的发展方向。目前疟原虫相对特异的富组氨酸蛋白Ⅱ（HRPⅡ）和乳酸脱氢酶（LDH）正被应用于疟疾的诊断，现场评估显示出了较好的效果。 近年来研究揭示，疟原虫GDH同脊椎动物组织的GDH在理化、生物学特性及酶学方面有较大差异，如疟原虫GDH活性不受嘌呤核苷酸（GTP、ADP）的影响，而脊椎动物组织的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；疟原虫GDH特异地以辅酶Ⅱ为其辅酶，而脊椎动物组织的GDH可以辅酶Ⅰ或Ⅱ作为辅酶。临床和实验研究证据表明，疟原虫比其宿主细胞更易受氧化压力影响，因此参与巯基代谢及参与还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生的脱氢酶对于疟原虫免受宿主体内氧化剂损伤及维持生存起着极其重要的作用。疟原虫GDH被认为是NADPH生成的主要来源，而且更为重要的是，宿主红细胞内没有此酶（GDH—NADP+）。另外， 李林海：恶付疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及产物抗原活性研究免疫学研究初步表明疟原虫GDH可能具有一定的种、属特异性。近两年有人通过在疟疾感染者血浆和疟原虫培养上清中利用变形杆菌GDH交叉抗体检测该抗原或测定该酶活性来诊断恶性疟原虫感染，取得了较满意的结果，提示该酶有望成为一种疟疾新型诊断分子。同时，由于疟原虫GDH也仅山活虫体产生，血液中GDHp的水平与虫体血症呈平行相关，因此还可用之来监测感染过程和抗疟药物的治疗效果。 本研究利用PCR技术钓取了恶性疟原虫海南株OCC／n们谷氨酸脱氢酶编码基因，克隆入pGEX－4T＊表达载体，测定的序列与恶性疟原虫Thailand株GDH基因序列进行比较，其推导的氨基酸序列与不同物种的GDH序列进行同源性分析，以探讨恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDHpfl独特的理化、生物学及酶学特性的分于机制。并在大肠杆菌 BLZI中进行了诱导表达，纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，运用ELISA、Western．blot进行抗原性分析，为下一步筛选单抗用于GDH免疫胶体金诊断试剂仰ICA）盒的研制奠定基础。 结果显示，利用PCR技术成功地钓取了编码我国恶性疟原虫海南株oCC lffl：N)谷氨酸脱氢酶的基因序列。将GDHpf基因克隆到pG职－4T上表达质粒，经PCR、限制性酶切分析等鉴定，构建了PGEX－GDH重组表达质粒，首次测定了编码我国恶性疟原虫海南株历CC l／HN)谷氨酸脱氢酶编码基因的全序列，大小为1413hp，无内含子。恶性疟原虫海南株GDH基因与Thailand株GDH基因相比，两者同源性高达99．86O，仅存在2个点突变，且均为同义突变，两者推导的氨基酸序列完全相同，说明该基因在不同的恶性疟原虫株之间高度保守。同源性分析结果表明，恶性疟原虫海南株GDH氨基酸序列与人的GDH同工酶、蓝氏贾第鞭毛虫、克鲁氏锥虫和细菌GDH相比，同源性较低，即使与BLAST检索出的具有最高同源性的蓝氏贾第鞭毛虫相比，也仅有57．90％的氨基酸残基相同，因此，疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。 重组质粒在大肠杆菌中表达出GDHpf与谷眯甘肽S－转移酶（GST）的融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，重组蛋白分子量约为66KDa，表达量约占菌体总蛋白的 13石％，用鼠抗恶性疟原虫免疫血清对表达产物进行Western－blot分析，发现特异性区带出现在66kDa处，表明该蛋白确实是所要表达的GST融合蛋白。进一步用制备电泳法纯化 －3－ 第一军医大学硕士学位论文的表达产物免疫小鼠制备免疫血清，ELISA和Western七＊ 分析表明该兔疫血清能与恶性疟原虫和间日疟原虫49ica处的虫源蛋白起反应，而与刚地弓形虫、日本血吸虫及未感染的红细胞不发生交叉反应，说明重组蛋臼中包含有所需的抗原表位且具有良好的抗原活性。这就为下一步筛选单抗用于GDH免疫胶体金诊断试剂（GICA）盒的研制奠定了基础。

二、恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）

（1）恶性疟原虫体外培养技术及其在生物学研究中的运用（论文提纲范文）

（2）捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究（论文提纲范文）

（3）间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究（论文提纲范文）

（4）疟疾诊断试剂盒的研究进展（论文提纲范文）

（6）3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析（论文提纲范文）

（7）恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析（论文提纲范文）

（8）恶性疟原虫红内期Pf332抗原基因未知序列的测定及分析（论文提纲范文）

（9）恶性疟原虫海南株MESA基因的序列分析（论文提纲范文）

（10）恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及产物抗原活性研究（论文提纲范文）

四、恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析（论文参考文献）

• [1]恶性疟原虫体外培养技术及其在生物学研究中的运用[J]. 蔡绍雨,董莹. 中国病原生物学杂志, 2013(04)
• [2]捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究[D]. 韩凯凯. 南京农业大学, 2011(06)
• [3]间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究[D]. 方强. 苏州大学, 2010(10)
• [4]疟疾诊断试剂盒的研究进展[J]. 李雪平,杨亚明,董莹. 检验医学与临床, 2009(01)
• [5]恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序[J]. 单志新,余新炳,马长玲,徐劲,吴忠道,陈守义,胡旭初. 热带医学杂志, 2004(06)
• [6]3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析[J]. 单志新,余新炳,徐劲,吴忠道,马长玲,李学荣. 中国寄生虫病防治杂志, 2002(06)
• [7]恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析[J]. 单志新,余新炳,李学荣,马长玲,徐劲,罗树红,吴忠道. 中国人兽共患病杂志, 2002(05)
• [8]恶性疟原虫红内期Pf332抗原基因未知序列的测定及分析[J]. 单志新,余新炳. 中国生物化学与分子生物学报, 2002(04)
• [9]恶性疟原虫海南株MESA基因的序列分析[J]. 单志新,余新炳,徐劲,陈守义,李学荣. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2002(03)
• [10]恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及产物抗原活性研究[D]. 李林海. 第一军医大学, 2002(01)