一、亚硝基乙酰青霉胺抑制人血管平滑肌细胞增殖的实验研究（论文文献综述）
赵辉[1]（2021）在《基于黄酮醇结构的光控CO荧光给体分子的开发和光控释放研究》文中研究指明一氧化碳（CO）是体内重要的气体信号传递分子,在很多生理和病理过程中起着重要的调控作用。它们的生物效应与其在组织或细胞中的浓度、时空分布密切相关。光控CO荧光给体分子是一种特殊的光控CO释放分子（PhotoCORMs）,利用光照来实现CO的时空可控释放,并通过光解反应过程的荧光信号变化来对释放的CO进行定量和示踪。开发光控CO荧光给体分子对研究CO分子的生理病理调节功能和开发可控释放CO药物用于相关疾病治疗有重要意义。本论文基于天然产物3-羟基黄酮（黄酮醇）结构开发新型光控CO荧光给体分子,并对其光控释放反应进行初步的研究,主要包含以下两部分工作。第一部分是具有聚集诱导发光特性的光控CO荧光给体分子的设计合成和光解性能研究。通过将7-二乙胺基香豆素和3-羟基黄酮以酰胺键的方式连接,设计合成了首个具有聚集诱导发光特性的光控CO荧光给体分子2-1。该分子在PBS缓冲溶液中聚集形成纳米粒,在552 nm处产生聚集诱导发光（AIE）。光解时,解聚导致552 nm处荧光下降,随着光照时间的增加,逐渐显示出产物的香豆素荧光团在456 nm处的荧光发射峰,因此,可通过荧光信号变化示踪光解CO的释放。第二部分是包含黄酮醇结构和亚硝胺基的光控CO和一氧化氮（NO）双释放给体分子4-1的开发。在目标分子的合成中,合成了母体黄酮醇染料分子4-2以及四个中间体4-3、4-4、4-5和4-6。通过紫外光谱、荧光光谱,外加CO或NO检测荧光探针,反应液质谱等测试方法对光控CO给体分子4-2、光控NO给体分子4-4和光解补偿型CO荧光探针4-5的性能进行了初步的研究。本论文发展的光控荧光给体分子将为研究CO气体信号分子在生物体中的作用提供重要分子工具,并可能用于相关疾病治疗药物的开发。
申瑞秋,刘志明,宋俊祎,胡碧茹[2]（2021）在《具有一氧化氮释放功能的人工血管材料》文中认为背景:人工血管材料在生理水平上的一氧化氮（NO）稳定可控释放是抑制小直径人工血管内壁血栓形成的技术关键,对新型人工血管材料的研发具有重要意义。目的:梳理近年来人工血管材料的研究和应用进展,重点对NO释放型人工血管材料进行综述。方法:以"vascular graft、blood vessel、catalytic Nitric oxide、tissue engineering;人工血管,催化NO"等为检索关键词,检索CNKI、万方、谷歌学术和PubMed数据库2000年1月至2020年7月发表的相关文献,再对检索到的文献进行筛选、归纳和总结。结果与结论:一系列聚合物材料、涂层材料和纳米复合材料展现出与天然内皮组织相似的NO产生通量和释放速率,其中负载有机硒、铜离子、角蛋白、纳米贵金属等的人工血管材料显示出可用于心血管疾病治疗的巨大潜力。负载有机硒的人工血管材料催化持续时间长,生物相容性好,机械性能优良;负载铜的人工血管材料生物安全性好,抗血栓能力强;同时负载有机硒和铜离子的人工血管材料表现出长期稳定的催化能力,以及选择性的内皮细胞活性增强能力;含有角蛋白的人工血管材料具有出色的细胞相容性和功能可拓展性;其他含有催化NO生成物质的人工血管材料未来发展空间较大。但截至目前,释放NO的可植入生物材料的临床前开发或后期临床试验效果尚不明确,在NO的释放时间、对内皮细胞的影响等方面仍存在一些重要问题有待解决。
周胜男[3]（2020）在《蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究》文中研究指明论文ⅠPGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究研究背景硝酸酯类药物作为最古老的心血管药物之一,由于其起效快,作用恒定等特点,仍被广泛应用于临床冠心病的治疗。临床上常用的硝酸酯类药物包括硝酸甘油（nitroglycerin,GTN）、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯等。硝酸酯类药物通过扩张外周血管,改善心肌血液分布,抑制血小板的聚集和黏附等作用,被应用于各种类型心绞痛的治疗。然而在频繁给药及连续应用的情况下,其抗缺血作用减弱甚至消失,即产生硝酸酯类药物耐受,从而成为其临床应用的一大阻碍。硝酸酯类耐受机制的研究主要有以下学说:血容量扩张学说,巯基耗竭学说,神经激素激活学说,线粒体功能障碍学说等。由此可见,硝酸酯类药物耐受的机制是复杂而尚不明确的,探索其中可能的机理是临床应用硝酸酯类药物中亟待解决的问题。硝酸酯类药物作为外源性一氧化氮（nitricoxide,NO）供体,在体内经过生物转换作用释放NO。NO通过经典的sGC/cGMP/PKG途径介导硝酸酯类药物的扩血管效应。作为体内重要的信号分子,NO除依赖经典的sGC/cGMP/PKG途径外,还可通过参与蛋白质的巯基亚硝基化过程调节细胞功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是NO与蛋白质半胱氨酸残基中的自由巯基（-SH）共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。研究表明,蛋白质亚硝基化修饰影响蛋白质的生物活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间相互作用,从而导致蛋白质结构和功能的改变,继而影响细胞的多种病理和生理过程。在花生四烯酸代谢通路中,前列腺素H2（Prostaglandin H2,PGH2）分别在前列环素合酶（Prostacyclin synthase,PGIS）和血栓素A2合酶的催化下形成前列环素（Prostacyclin,PGI2）和血栓素 A2（Thromboxane A2,TXA2）。TXA2 通过激活血栓烷素受体（TPr）引起血管收缩,而PGI2通过其特异受体诱导血管舒张,因此PGI2和TXA2共同调节血管舒张和收缩的平衡稳态。PGIS作为PGI2生物合成的限速酶,主要分布于血管内皮细胞和平滑肌细胞。PGIS活性下降或PGI2生成减少均可导致血管平滑肌细胞舒张反应减弱而收缩反应增强,使血管扩张效应降低。有研究报道,PGIS的功能缺失是导致硝酸酯类药物耐受的机制之一。研究表明,sGC亚硝基化是主动脉平滑肌细胞对NO脱敏的机制之一,证明蛋白质亚硝基化可能是硝酸酯类交叉耐受的重要原因。我们通过蛋白质氨基酸序列对比发现,不同物种PGIS蛋白在231位和441位氨基酸位点上均存在两个半胱氨酸,使得PGIS可能成为亚硝基化修饰的可能靶点。那么,PGIS是否可被NO巯基亚硝基化修饰?PGIS亚硝基化修饰对PGIS的功能产生怎样的影响?PGIS亚硝基化修饰是否为硝酸酯类药物交叉耐受的可能原因?基于以上分析,本研究拟从体外和体内水平探究各NO供体与PGIS的巯基亚硝基化反应,观察其对血管舒张功能的影响,并进一步探究PGIS发生亚硝基化修饰的半胱氨酸位点,为临床上硝酸酯类药物耐受的研究及预防提供相应实验依据。研究目的1.研究GTN是否诱导内皮细胞中PGIS亚硝基化修饰;2.研究PGIS亚硝基化修饰是否介导血管硝酸酯类耐受3.探究预防GTN耐受的方法。研究方法1.细胞刺激和转染（1）将 0.1 μM,1 μM,10 μM,50 μM,100 μM 浓度梯度的 GTN 与 HUVECs反应8小时,观察细胞中PGIS亚硝基化修饰水平和PGIS活性及PGI2、TXA2的生成;山东大学博士学位论文（2）预先用0.3 mM的NO清除剂Carboxy-PTIO或2.5 mM亚硝基化拮抗剂NAC处理细胞0.5小时,再向细胞加入10 μMGTN刺激8小时。观察各组细胞内PGIS亚硝基化水平和活性及PGI2、TXA2的生成;（3）合成野生型 PGIS（WT-PGIS）和突变型 PGIS（MT-PGIS-C231A、C441A、C231/441A）cDNA腺病毒并感染HUVECs。细胞转染腺病毒48小时后,加入10μMGTN反应8小时。观察细胞内PGIS亚硝基化水平及Cys231和Cys441突变对PGIS活性的影响。2.重组蛋白的体外实验构建及表达野生型和突变型PGIS（WT、C23IA、C441A、C231/441A）纯化蛋白。（1）将重组人PGIS蛋白与10μM的NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP和SPNO）孵育两小时;（2）将野生型或突变型人PGIS蛋白与10 μM的GTN孵育两小时,检测各组PGIS蛋白亚硝基化修饰水平和PGIS蛋白活性。3.动物棋型建立（1）取40只8周龄SD雄鼠,随机分为以下4组:对照组,GTN组,NAC组,GTN+NAC组（每组10只）。预先给予NAC（50mg/kg/天）灌胃7天,7天后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后将大鼠处死;（2）选取60只8周龄ApoE-/-雄鼠并随机分为4组:WT-PGIS组,MT-PGIS组,WT-PGIS+GTN 组,MT-PGIS+GTN 组（每组 15 只）。尾静脉注射 WT-PGIS或MT-PGIS cDNA腺病毒,2周后,将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将小鼠处死;（3）选取60只8周龄SD雄鼠并分为以下4组:空白对照组,GTN组,GTN+阿司匹林组,GTN+贝前列素组（每组15只）。阿司匹林（10mg/kg/天）或贝前列素（200μg/kg/天）灌胃两周,而后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将大鼠处死;（4）取40只8周龄SD雄鼠,取出主动脉并制备主动脉环,将主动脉环在生理盐水或1 mM的Tranylcypromine中孵育30分钟。通过离体血管环实验观察血管对GTN和SNP的张力变化。4.免疫沉淀反应（IP）提取细胞或组织蛋白,加入PGIS抗体与蛋白裂解液4℃旋转过夜。加入Protein A/G Agarose孵育4小时后离心取上清,经过Western blot检测细胞或组织中PGIS蛋白亚硝基化水平。5.蛋白免疫印迹分析（Western blot）细胞或组织蛋白经过凝胶电泳、转膜、一抗孵育、二抗结合、ECL等步骤观察PGIS蛋白表达及其亚硝基化修饰水平。6.组织免疫荧光染色（IF）免疫荧光染色检测主动脉血管中PGIS亚硝基化修饰水平。7.大鼠离体血管张力检测分离大鼠主动脉并制备5mm的环形血管环,通过离体血管环实验检测主动脉对硝酸酯类的舒张反应性。8.PGIS活性及PGI2,TXA2含量测定PGI2含量的测定由其稳定的代谢产物6-酮-PGF1α的测定替代。用ELISA试剂盒测定细胞或组织裂解液或血清中6-酮-PGF1α的水平。由于TXA2的不稳定性,通过测定其稳定的代谢产物TXB2代表TXA2的产生。取组织或细胞裂解液,使用ELISA试剂盒进行测量。研究结果1.GTN诱导PGIS巯基亚硝基化修饰体外实验中,NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP,SPNO）均可与重组人PGIS蛋白发生巯基亚硝基化修饰;GTN使HUVECs中PGIS的巯基亚硝基化水平呈现浓度依懒性增加。体内实验中,Western blot及组织免疫荧光实验显示,GTN使主动脉组织中PGIS巯基亚硝基化水平显着升高。山东大学博士学位论文2.GTN抑制PGIS活性及PG12的合成体内实验与体外实验结果均显示:GTN使PGIS活性明显降低,使前列腺素代谢向PGI2方向转化减少,PGI2代谢产物6-酮-PGF1α生成减少。3.PTIO和NAG阻断GTN诱导的PGIS亚硝基化及对PG IS活性的抑制PTIO及NAC均可显着降低HUVECs和主动脉中由GTN所诱导的PGIS巯基亚硝基化水平。PTIO及NAC均可阻断GTN对PGIS活性的抑制,使6-酮-PGF1α和PGI2的生成增加,证明PGIS活性的降低可能为PGIS亚硝基化修饰所介导。4.蛋白质巯基亚硝基化导致GTN耐受体内实验中,NAC干预组的大鼠血管环恢复对GTN的舒张反应,抑制了GTN耐受,证明蛋白质的巯基亚硝基化是GTN耐药的重要影响因素。5.GTN诱导的PGIS巯基亚硝基化位于231及441号半胱氨酸位点体外实验中,分别突变Cys231或Cys441后PGIS亚硝基化反应减弱,而Cys231及Cys441均突变后PGIS亚硝基化水平明显减弱。体内试验中,尾静脉注射野生型及突变型PGIS cDNA腺病毒,结果显示突变C231/C441显着抑制了GTN对主动脉组织中PGIS的亚硝基化修饰。6.Cys231/Cys441突变抑制了 GTN诱导的PGIS活性下降及PG 12合成减少与GTN+WT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成明显下降相比,GTN+MT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成增加,且前列腺素代谢向PGI2方向转化增加,向TXA2方向转化减少。7.PGIS的231及441号半胱氨酸位点突变改善硝酸酯类交叉耐受离体血管环实验显示,Cys231/Cys441突变可明显改善血管环对于GTN、SNP和SNAP的舒张反应。8.阿司匹林和贝前列素对硝酸酯类交叉耐受的影响离体血管环实验显示,贝前列素和阿司匹林可明显改善主动脉环对GTN、SNP和SNAP的浓度依赖性舒张反应。9.Tranylcypromine 对 GTN 耐受的影响离体血管环实验显示,Tranylcypromine可使血管对GTN和SNP的浓度依赖性舒张反应显着减弱。结论1.GTN诱导PGIS的Cys231和Cys441位点亚硝基化修饰;2.GTN通过PGIS亚硝基化修饰使PGIS活性下降,PGI2生成减少;3.PGIS亚硝基化修饰介导体内硝酸酯类交叉耐受;4.应用阿司匹林和贝前列素可改善硝酸酯类交叉耐受。论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究研究背景糖尿病（diabetesmellitus,DM）是血管动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的重要危险因素之一。钙化作为糖尿病动脉粥样硬化（diabetic atherosclerosis,DA）最常见的并发症之一,一度被认为是不良心血管事件的独立预测因子,与斑块进展和不稳定性有密切关系。血管钙化是受血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型转换驱动的一个主动调节过程,VSMCs向成骨细胞表型转化以及VSMCs中骨矿物羟基磷灰石和基质囊泡的形成是血管钙化的核心事件。研究发现高糖可通过诱导成骨细胞结合因子和成骨细胞转录因子的表达,促进VSMCs转化为成骨样细胞,从而加速DA斑块内膜钙化的发生发展。尽管高糖促进VSMCs钙化的作用己被普遍认可,而其中的相关机制并不十分明确。腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）是一种异源三聚体丝/苏氨酸蛋白激酶,由α（α1,α2）催化亚基与β（β1,β2）和γ（γ1,γ2,γ3）调节亚基组成,负责调节代谢和能量的平衡。β亚基C-端区域同源性较高,为连接α与γ亚基的桥梁。β亚基的CBM区域为糖原结合结构域,可能参与糖原对AMPK的调节作用。此外,β亚基还含有豆蔻酰化和磷酸化位点,参与调节AMPK活性和亚细胞定位。β1在肝脏中高表达,在骨骼肌中低表达;β2则相反。而在大部分细胞中主要以α1、β1、γ1异构体为主。本课题组前期实验显示,在高糖刺激下,VSMCs中AMPKβ1蛋白表达显着下降。多项研究表明,AMPK可负向调节斑块钙化进程,AMPK激活剂AICAR和二甲双胍均可抑制体外VSMCs钙化。那么AMPKβ1是否在高糖诱导的VSMCs钙化中发挥调节作用?而高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达降低是通过什么机制导致?两者是否存在关联?这些问题尚未被研究者重视及探究。蛋白质巯基亚硝基化修饰是指游离的一氧化氮（nitricoxide,NO）与蛋白质内的半胱氨酸自由巯基共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。蛋白质亚硝基化修饰可影响蛋白质稳定性、活性、亚细胞定位和蛋白质间的相互作用,进而参与多种病理和生理过程。有研究表明,Western blot和PCR实验均证实在糖尿病模型大鼠中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达显着增加,NO产生增加。那么高糖诱导下AMPKβ1的降低是否由增加的NO与AMPKβ1的亚硝基化修饰导致?综上分析,本研究拟通过高糖和β-甘油磷酸诱导人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HAMSCs）钙化,研究高糖诱导下AMPKβ 1蛋白表达降低的相关机制及AMPKβ1对高糖促进的VSMCs钙化的影响,为临床上预防和治疗血管钙化提供实验依据。研究目的1.研究高糖刺激是否诱导AMPKβ1亚硝基化修饰;2.构建并转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒,研究AMPKβ1亚硝基化修饰对高糖促进VSMCs钙化的影响及相关机制。研究方法1.细胞刺激与转染取6-8代HASMCs进行细胞实验,分别将5.5 mM及30 mM的葡萄糖溶液作为正常糖（NG）和高糖（HG）刺激。（1）将HG溶液分别按照0,6,12,24,48,72小时的时间梯度加入六孔板内,Western blot及RT-PCR分别检测AMPKβ1和iNOS的蛋白和mRNA表达水平;在10ng/ml白细胞介素-1β（IL-1β）孵育下,分别于0,6,12,24,48,72小时的时间梯度下加入HG,用一氧化氮检测试剂盒测定细胞内NO的生成;（2）分别将终浓度为0.2mM的Carboxy-PTIO,100 μM的 1400W或0.4μM的MG132预处理HASMCs2小时,而后加入高糖刺激。24小时后收集细胞,检测AMPKβ1的蛋白表达及亚硝基化水平;（3）研究高糖刺激对HASMCs钙化的影响。向培养基中加入10 mmol/的β-甘油磷酸（β-GP）以诱导细胞钙化。将实验分为以下四组:NG,NG+β-GP,HG,HG+β-GP,检测各组细胞的钙化水平;（4）将AMPKβ1过表达腺病毒转染HASMCs中,实验分四组:正常糖+空载体组（NG+Vector）,正常糖+AMPKβ1过表达组（NG+AMPKβ1）,高糖+空载体组（HG+Vector）,高糖+AMPKβ1过表达组（HG+AMPKβ1）,各组均加入10 mM β-GP诱导钙化,反应结束后收集细胞并检测各组细胞的钙化水平;（5）将野生型AMPKβ1 和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173A、MT-AMPKβ1-C223A及MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,转染成功后加入HG和10 mM β-GP诱导钙化,检测AMPKβ1亚硝基化水平及细胞钙化水平。（6）野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,24小时高糖刺激后检测细胞中AMPKβ1蛋白泛素化水平。2.生物素转化法（Biotin switch）用蛋白裂解液提取细胞蛋白,通过封闭游离巯基、Biotin标记、纯化Biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot实验检测AMPKβ1的亚硝基化水平。3.免疫沉淀反应（IP）提取细胞蛋白,加入AMPKβ1抗体（1:50稀释度）与蛋白裂解液4度旋转过夜。加入Protein A/GAgorose并孵育4小时,离心取上清即得到AMPKβ1蛋白-抗体-珠子复合体。Western blot检测AMPKβ1的泛素化水平。4.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取HASMCs中的总蛋白,检测iNOS、AMPKβ1和Runx2的蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCR（qRT-PGR）收集高糖刺激后的HASMCs并提取细胞内总RNA,检测AMPKβ1和iNOS的mRNA水平。6.茜素红染色4%的多聚甲醛固定细胞后,用茜素红染色液将六孔板内的细胞进行染色30分钟,PBS洗涤3次后置于显微镜下观察。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解细胞后,离心取上清并按照试剂盒说明测定细胞中的钙含量。8.碱性磷酸酶活性测定根据碱性磷酸酶试剂盒说明测定细胞中碱性磷酸酶活性。9.一扬化氮含量测定用一氧化氮检测试剂盒测定细胞中一氧化氮的含量。研究结果1.高糖刺激使HASMCs中AMPK β 1表达降低而i N0S表达增加HASMCs与HG溶液按时间梯度孵育,Western blot及qRT-PCR结果显示,随着时间递增,HASMCs中AMPKβ1蛋白表达逐渐下降,mRNA水平无显着变化;iNOS蛋白及mRNA水平均逐渐增加,细胞裂解液中NO含量逐渐增加。2.离糖诱导AMPK β 1中Cys173和Cys223位点亚硝基化修饰与放线菌酮刺激下的AMPKβ1降解速率相比,HG可明显增加HASMCs中AMPKβ1的降解速率,证明高糖诱导下AMPKβ1表达下降是由蛋白质降解增加所致。Biotinswitch实验显示,HG刺激下AMPKβ1的亚硝基化水平明显升高,并可被PTIO和1400W抑制。Cys173和（或）Cys223位点突变后,可明显减弱高糖诱导的AMPKβ1的亚硝基化水平。3.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统促使AMPK β1降解Cys173及Cys223的突变显着抑制高糖诱导的AMPKβ1泛素化水平的升高。MG132可逆转高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降。4.高糖促进HASMCs钙化与对照组相比,高糖刺激可明显提高HASMCs中Runx2表达,碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量。5.AMPKβ1与HASMCs钙化呈负相关AMPKβ1过表达可显着降低HASMCs中钙含量、Runx2的表达及ALP活性,证明AMPKβ1参与高糖刺激下HASMCs钙化进程且负向调节高糖刺激的HASMCs 钙化。6.AMPKβ 1亚硝基化对HASMCs钙化的影响与对照组相比,PTIO及NAC均可抑制高糖诱导的HASMCs钙化水平的升高。在HG刺激HASMCs的钙化中,与WT-AMPKβ1转染组相比,Cys173和（或）Cys223的突变可使细胞Runx2表达水平、钙含量测定和茜素红染色明显降低。7.亚硝基化通过降低AMPK β 1稳定性影响HASMCs钙化与对照组相比,MG132可明显下调HG诱导下HASMCs内Runx2蛋白表达。结论1.高糖通过促进iNOS/NO产生介导AMPKβ1中Cys173和Cys223位点发生疏基亚硝基化修饰;2.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统介导高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降;3.AMPK|β1亚硝基化促进高糖刺激下HASMCs的钙化。论文Ⅲ AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究研究背景血管钙化（vascularcalcification,VC）是动脉粥样硬化和糖尿病血管病变的并发症,是不良心血管事件的独立预测因子。血管钙化是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）在钙化调节因子的诱导下分化为成骨样细胞,并伴随磷酸钙羟基磷灰石晶体沉积在细胞外基质的过程。根据位置不同,血管钙化主要分为两种类型:动脉粥样硬化性内膜钙化和与糖尿病、慢性肾病等相关的中膜钙化。动脉粥样硬化钙化主要位于在血管内膜,随着病变进展可累及中膜。研究表明血管钙化的形成是一个涉及多因素、多系统控制的主动调节过程,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、脂质代谢紊乱、高血糖等。多项研究证实,高血糖是促进VC发生发展的重要因素之一,然而其中的具体机制尚不清楚。我们研究表明,AMPKβl亚硝基化修饰促进高糖诱导下HASMCs钙化,然而AMPKβ1亚硝基化修饰在体内水平对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及相关机制尚未被研究。本研究拟通过构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型研究AMPKβ1亚硝基化修饰对斑块内膜钙化的影响,为临床上预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化提供实验依据。研究目的1.研究AMPKβ1亚硝基化修饰促进高糖刺激下HASMCs钙化的机制;2.建立糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,通过转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒研究AMPKβ1亚硝基化对斑块内膜钙化的影响及其机制。研究方法1.细胞模型（1）将野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1 cDNA腺病毒转染HASMCs,加入高糖和10 mM β-甘油磷酸刺激,Western blot检测p-AKT及AKT蛋白表达;（2）HASMCs与10nmol/L胰岛素孵育2小时后,转染AMPKβ1过表达和对照病毒并加入高糖和10 mM β-甘油磷酸诱导钙化,Western blot检测p-AKT、AKT和Runx2蛋白表达。2.动物模型的建立（1）糖尿病小鼠模型的建立:将链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）按60mg/kg的量连续5天腹腔注射打入小鼠体内。血糖≥16.7mmol/L视为造模成功。（2）构建并转染 WT-AMPKβ1 和 MT-AMPK-C173/223A cDNA 腺病毒。建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型并给与高脂喂养。2月后尾静脉注射WT-AMPKβ1或MT-AMPKβ1 cDNA腺病毒,继续饲养1个月后取材。3.体重及血液学指标的检测测量实验前后小鼠体重并用酶学法检测血清标本中血糖及血脂水平。4.组织学检测留取实验小鼠主动脉和心脏标本并制备成组织匀浆,一部分检测AMPKβ1亚硝基化水平和Runx2、p-AKT及AMPKβ1的蛋白表达,一部分检测主动脉中钙含量。制备主动脉根部冰冻切片,免疫组织化学染色方法检测斑块中Runx2和p-AKT的表达水平。5.生物素转化法（Biotin switch）提取主动脉组织蛋白,通过封闭游离巯基、biotin标记和纯化biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot检测AMPKβ1的亚硝基化水平。6.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取细胞或主动脉组织中的总蛋白并检测AMPKβ1、Runx2和p-AKT的蛋白表达水平。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解主动脉组织,离心取上清后并按照试剂盒说明测定组织的钙含量。8.免疫组织化学染色将主动脉根部冰冻切片进行免疫组织化学染色以测定其中Runx2和p-AKT的表达水平。研究结果1.实验小鼠基本情况各组小鼠间体重及血脂水平无显着性差异。糖尿病组小鼠空腹血糖水平与对照组间有显着差异。2.AKT激活剂-胰岛素对AMPK β 1调节的HASMCs钙化的影响HASMCs钙化中,高糖刺激可显着提高AKT活性。与AMPKβ1过表达组中p-AKT和Runx2的低水平相比,胰岛素可显着提高AMPKβ1过表达HASMCs中p-AKT和Runx2的表达水平,证明AMPKβ1通过AKT/Runx2通路调节HASMCs 钙化。3.AMPK β 1亚硝基化修饰通过调节AKT活性影响HASMCs钙化Cys173和Cys223的突变可显着降低高糖诱导HASMCs钙化中AKT活性。4.AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠斑块钙化的影响Western blot、组织切片免疫组化及主动脉钙含量检测显示,Cys173和Cys223突变可显着降低主动脉组织中p-AKT和Runx2蛋白表达及斑块中钙化水平。结论1.AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT/Runx2通路活性促进高糖诱导的HASMCs 钙化;2.糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠中,AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT活性促使斑块内膜钙化水平升高。
范永鸿[4]（2019）在《具有手性的NO催化释放型血管支架涂层的构建与应用研究》文中提出心血管支架是治疗冠状动脉粥样硬化的有效方法之一,但是长期服役过程中支架内晚期血栓、再狭窄和新生动脉粥样硬化等并发症严重影响了支架的临床应用效果。大量研究表明,血管支架表面粗糙度、拓扑形貌、电荷性质、化学成分、官能团种类以及亲疏水性等条件对其血液相容性、细胞相容性有非常重要的影响,并在此研究基础上设计了大量物理和化学手段对血管支架进行表面改性。但血管支架材料表面手性对其血液相容性和细胞相容性的影响还鲜有报道。本文首先研究了材料表面手性赖氨酸与酒石酸分子的固定对抗凝血和血管细胞增殖行为的影响,并随后引入生物活性分子NO和铜离子,与手性协同作用构建具有抗凝抗增生与促内皮化能力的多功能血管支架涂层。论文主要内容如下:（1）氧化钛表面手性赖氨酸与酒石酸分子的固定与生物相容性研究。首先将手性赖氨酸分子或酒石酸分子（以己二胺桥接）通过聚多巴胺涂层固定在氧化钛表面,并随后研究了该手性表面的理化性质和生物学性能。材料学表征结果表明赖氨酸和酒石酸分子的手性对固定量以及材料表面的亲疏水性、化学成分、粗糙度、表面形貌等理化性质没有明显影响;对蛋白吸附行为的研究发现固定L-赖氨酸分子的表面比固定D-赖氨酸分子的表面具有更大的白蛋白与纤维蛋白原吸附,且纤维蛋白原的变性量更高;固定L-酒石酸比固定D-酒石酸的表面白蛋白和纤维蛋白原的吸附更少,但纤维蛋白原变性更加明显;血小板粘附与激活研究表明,固定L-赖氨酸比固定D-赖氨酸分子的表面血小板黏附与激活更加严重,而固定L-酒石酸分子的表面虽然血小板粘附比固定D-酒石酸分子的表面更少,但激活更为严重;细胞粘附与增殖评价发现,固定L-赖氨酸的表面比固定D-赖氨酸的表面更有利于内皮细胞与平滑肌细胞的粘附、增殖与迁移。（2）NO催化释放与手性协同作用构建抗凝、促内皮与抗增生功能化表面。将具有催化活性的手性硒代胱氨酸分子固定在材料表面,利用NO释放与手性协同作用构建具有选择性促进内皮细胞而抑制平滑肌细胞生长的抗凝血表面。研究表明,L-和D-硒代胱氨酸分子在表面的固定量没有明显差异,材料表面的理化性质也几乎没有区别;但催化释放NO的结果表明,固定L-硒代胱氨酸分子的表面在同等条件下具有更高的NO催化释放速率;血小板黏附与激活实验发现,体外添加供体的情况下,固定L-硒代胱氨酸的表面具有更好的抗血小板能力;随后的细胞评价结果表明,未添加供体时,固定L-硒代胱氨酸分子的表面无选择地促进内皮细胞与平滑肌细胞的增殖,但添加NO供体以后,该表面能够选择性促进内皮细胞黏附、增殖与迁移而抑制平滑肌细胞的生长。（3）通过固定含铜金属有机骨架化合物纳米颗粒构建具有催化释放NO与铜离子缓释功能的血管支架涂层。利用聚多巴胺涂层固定兼具NO催化和铜离子释放功能的含铜金属有机骨架化合物纳米颗粒,通过NO与铜离子释放协同作用构建抗凝、促内皮与抗平滑肌增生的血管支架涂层。研究表明,固定含铜金属有机骨架化合物的涂层具有合适的NO催化释放速率,能够有效抑制血小板的粘附与激活;且涂层缓慢释放的铜离子与NO协同作用,选择性促进内皮细胞增殖与迁移而抑制平滑肌细胞生长,同时对炎症反应也具有一定调控作用;动物体内植入实验表明,该涂层改性后的样品具有促进内皮化、抑制内膜增生的能力。（4）手性与NO催化生成和铜离子释放协同作用构建抗凝促内皮的血管支架涂层的探索。基于表面手性对支架材料生物相容性影响的研究结果,本研究进一步提出利用手性协同NO催化释放与铜离子缓释构建抗凝、促内皮与抗增生涂层的初步设想。在固定含铜金属有机骨架化合物纳米颗粒的基础上,在涂层表面引入手性赖氨酸分子,得到具有NO催化和铜离子缓释功能的手性表面。该手性表面保持了较好的抗血小板激活的能力,并且手性协同NO催化生成和铜离子释放进一步促进了内皮细胞的粘附与增殖。但是,表面固定手性赖氨酸分子后涂层的NO催化活性明显降低,不利于实现抗平滑肌细胞增生的功能,因而该修饰方法还需要进一步改进。综上,本文在研究表面手性对血管支架材料生物相容性影响的的基础上,利用手性与生物活性分子NO和铜离子生理学功能的协同作用,设计构建了具有抗凝、促内皮与抗平滑肌增生的多功能改性涂层,有效提高了血管支架的生物相容性。本文不仅为材料表面的生物相容性研究提供了新的线索,也为血管支架的表面改性提供了新的思路。
郭倩如[5]（2019）在《基于微纳米结构及表面化学构建多功能心血管支架表面及其生物相容性研究》文中提出介入治疗作为心血管疾病最主要的临床治疗手段,其疗效令人瞩目,但仍面临着一些困扰,如:晚期血栓和支架内再狭窄等问题。大量研究表明引发此问题的主要原因是受损内皮细胞的形态和功能改变导致炎症、凝血和增生等的发生。由于血管内皮层可以产生和分泌大量活性物质,所以它在维持血管稳态中发挥着关键作用,其中一氧化氮（NO）作为内皮最重要的介质,具有抗凝血、抗平滑肌增生和抑制炎症反应等多重功效,是心血管系统中重要的信号传递分子,在调节心血管的生理机能以及维持血管内皮的正常功能中占据重要地位。细胞存在于以细胞外基质（ECM）为主要成分的复杂微环境中,其微纳米结构以及生化信号可以调节细胞的粘附、取向、增殖与迁移等行为,因此构建兼备抗凝血和抑制内膜增生功能的理想支架表面的策略是促进健康和功能性内皮的修复与再生,从而实现支架表面再内皮化及血管重塑。本文致力于通过仿ECM的形貌结构与功能,构建一种兼具物理诱导以及表面化学诱导的多功能表面,基于细胞对拓扑结构的“接触诱导”响应以及对生物化学信号的响应促进内皮细胞功能性修复,调控平滑肌细胞以及血小板的功能,以实现长期有效的治愈。本文分别从微米尺度和纳米尺度两个方面并结合化学因素进行了生物相容性的研究。本文首先从微米尺度研究了多巴胺介导的NO对血小板、内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）及其竞争生长的综合影响。通过射频磁控溅射技术在微沟槽（1?m×1?m）图案化表面沉积一层二氧化钛（TiO2）薄膜,并基于多巴胺自聚合的特性以及与氨基发生迈克尔加成与席夫碱反应的能力,通过酚羟基与Ti键间的强配位作用将聚多巴胺介导的硒代胱胺（SeCA）固定到二氧化钛微图案材料表面,构建了微米尺度形貌线索与生化线索相结合的多功能表面,进而研究了微米沟槽及化学成分对细胞生长行为的影响。扫描电子显微镜（SEM）结果证明材料表面成功制备出了微沟槽,原子力显微镜（AFM）、水接触角和Zeta电位分别衡量了改性前后材料表面微观形貌、亲疏水性能以及电位变化,X射线光电子能谱（XPS）的化学元素组成结果表明PDA/SeCA成功接枝到了TiO2表面。ECs和SMCs的细胞相容性评价以及竞争粘附试验证明微米尺度下改性的材料具有高效调控细胞生长取向的能力,并且在促进ECs粘附与增殖行为的同时又可以抑制SMCs粘附与增殖行为。ECs的钙粘蛋白与肌动蛋白染色结果显示基底形貌是细胞排列和伸长的主要决定因素。通过一氧化氮分析仪检测了PDA/SeCA改性样催化释放NO的能力,血小板cGMP合成量的显着增加也进一步验证了该结果,并且血小板粘附与激活实验结果进一步表明了具有一氧化氮释放功能的微图形化改性表面可以抑制血小板粘附、聚集与激活,具有优异的抗凝血活性。本文接下来从纳米尺度研究NO及整合素配体REDV对血液相容性以及内皮细胞生长行为的综合影响。利用（RADA）4肽的自组装特性在316L不锈钢（316L SS）表面分别构建（RADA）4-REDV、（RADA）4-U和同时含有（RADA）4-REDV和（RADA）4-U多肽的双层纳米纤维涂层,形成纳米尺度形貌线索与生化线索相结合的多功能表面,研究了基于纳米纤维表面化学成分对细胞生长行为及血液相容性的影响。SEM结果显示材料表面成功制备出了纳米纤维,水接触角衡量了改性前后材料表面亲水性能,并通过质谱（MS）和傅里叶红外光谱（FTIR）结果证明利用自组装技术可以在基底表面成功沉积纳米纤维涂层。ECs的粘附、增殖和迁移实验验证了具有（RADA）4-REDV多肽的涂层能够特异性识别内皮细胞,具有良好的细胞相容性,并且当（RADA）4-REDV多肽含量为20%时其增殖与迁移速率最佳。一氧化氮速率分析结果证明（RADA）4-U的NO催化释放速率与其含量呈正相关,并且表面进一步接枝（RADA）4-REDV后速率也不受影响。半体内循环动物实验验证了自组装多肽纳米纤维涂层,特别是（RADA）4-REDV@（RADA）4-U纳米纤维涂层,具有优异的抗凝血性能及维持血流畅通的良好潜能。综上所述,本研究基于微/纳米尺度进行表面化学改性所得心血管材料,可以结合物理诱导与化学诱导共同促进内皮细胞的粘附,抑制血小板的粘附与激活,为仿生心血支架的进一步研究以及心血管疾病的彻底治愈提供了新的策略与理论支持。此外,如果可以在表面化学的基础上合理组合微沟槽与纳米纤维,在一定的条件下可能会创造出更高度仿生的细胞微环境。
顾皓[6]（2017）在《具有纤溶活性的多功能血液接触材料表面》文中研究指明血液接触材料的植入所引起的血栓形成是导致其功能丧失的主要原因之一。一直以来,研究者们致力于设计出一种能够长期使用并具有良好生物相容性的血液接触材料。随着对生物材料表面改性的深入研究,研究者通过制备“生物惰性”和“生物活性”表面这两种策略来改善材料的血液相容性,并对这两种策略进行了较为深入的探索。“生物惰性”和“生物活性”两种策略的共同使用往往能够更大程度地改善材料的血液相容性,但截至目前,我们仍然无法获得一个真正意义上的血液相容性材料表面。对于心血管植入材料,不仅需要抑制血栓在材料表面的形成,还需要解决由平滑肌细胞增殖所造成的内膜增生的问题。通过合理设计,构建具有多种生物功能的抗血栓表面有望成为解决该问题的一个有效途径。针对上述思路,本论文首先将传统的“抑制血栓形成”策略与“溶解初生血栓”策略（构建纤溶活性表面）相结合,初步研究这两种策略共同改性材料表面所带来的优势及面临的主要问题,从而推动基于纤溶活性的多功能血液接触材料表面的构建。其次,针对多种生物活性分子改性材料表面无法控制生物分子之间的相对数量以及多步化学键合的改性方法可能会影响到生物分子活性等问题,利用共价键与主客体相互作用通过两步法共同改性材料表面,不仅能够控制生物活性分子之间相对数量,还能保证其生物活性。本论文旨在探索并设计一系列于短期及长期均能保持良好抗血栓功能及防止再狭窄发生的血液接触材料表面。主要研究内容如下:（一）将亲水性单体甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（OEGMA）与乙烯基赖氨酸单体（LysMA）,通过一步接枝共聚的方法引入到乙烯基功能化的聚氨酯（PU）表面（PU-POL）,在保持表面原有纤溶活性的基础上,通过共价键结合的方式引入了硒代胱胺生物活性分子,所制备的PU-POL-Se表面能够在7天内稳定催化亚硝基谷胱甘肽（GSNO）释放NO（平均速率0.61 × 10-10 mo1 cm-2 min-1）,与健康的内皮细胞层释放NO的速率（0.5×10-10-4.0×10-10mol cm-2 min-1）相近。通过将纤溶功能和NO释放功能相结合,材料表面不仅能够溶解初生血栓、抑制血小板的黏附,还能够通过抑制平滑肌细胞的黏附以降低内膜增生的发生率。（二）将亲水性单体甲基丙烯酸-2-羟乙酯（HEMA）及甲基丙烯酸金刚烷甲醇酯单体（AdaMA）通过一步接枝共聚的方法引入到乙烯基功能化的PU表面（PU-PHA）,然后通过共价键结合的方式固定生物活性分子硒代胱胺赋予改性表面催化释放NO的功能,所合成的PU-PHA-Se表面具有排斥非特异性蛋白质吸附、抑制人脐静脉平滑肌细胞（HUVSMCs）黏附及增殖以及血小板黏附及激活的功能。更为重要的是,该表面还可通过主客体相互作用进一步结合不同功能的生物活性分子。通过主客体相互作用将ε-赖氨酸修饰的CD（CD-L）固定至PU-PHA-Se表面后,得到的PU-PHA-Se/CD-L表面具有较好的纤溶活性,能够在25 min内溶解初生血栓。这种策略通过主客体相互作用引入纤溶功能,有效避免了材料表面ε-赖氨酸组分的损失,Plg在PU-PHA-Se/CD-L表面的吸附量（165ng/cm2）远高于PU-POL-Se表面的吸附量（60ng/cm2）。而通过主客体相互作用将磺酸修饰的CD（CD-S）固定至PU-PHA-Se表面后,得到的PU-PHA-Se/CD-S表面还具有优异的抗凝血能力、抑制HUVSMCs的黏附及增殖和促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）黏附及增殖的能力。上述工作为多功能材料表面的构建提供了新的方法,解决了不同生物分子同时改性材料表面所遇到的分子之间竞争作用及无法控制数量比例的问题。（三）将HEMA、LysMA及AdaMA单体通过一步接枝共聚的方法引入乙烯基功能化的PU表面,再将CD-S通过主客体相互作用固定至PU-PHLA表面,所制备的PU-PHLA/CD-S表面能够于血浆中选择性吸附Plg（吸附量为200 ng/cm2）,表现出较好的抗凝血性能（相较于PU表面的PRT时间延长14 min）和纤溶活性。该策略在促进材料表面内皮化（HUVECs在材料表面48 h的生长数量相较于PU表面提高130%）的同时抑制平滑肌细胞在材料表面的黏附及增殖（诱导HUVSMCs在材料表面的皱缩型表达）,并且能够抑制血小板在材料表面的黏附,构建了一种兼具抗凝血、纤溶活性、促进内皮化及抑制平滑肌细胞增殖的材料表面。（四）通过层层组装法（Layer-by-layerassembly,LBL）将对苯乙烯磺酸钠（SS）与AdaMA的共聚物（P（SS-co-Ada））和壳聚糖共同改性模型基材金表面,最后通过主客体相互作用将CD-L固定至材料表面,所得到的Au-LBL/CD-L表面不仅具有优异的抗凝血性能和纤溶活性,还对血管细胞的生长具有选择性（HUVECs在材料表面生长48 h后的活性相较于Au表面提高90%,HUVSMCs在材料表面生长48 h的活性相较于Au表面下降59%）,并表现出一定的杀菌功能（使大肠杆菌表面皱缩死亡）。该法具有普适性强、操作简单及反应条件温和等优点,不仅适用模型基材,还可进一步应用于多种生物医用材料表面。
王园园[7]（2016）在《双重修饰的小口径人工血管的快速内皮化》文中研究指明小口径人工血管应用失败的主要原因是血栓和由内膜增生造成的再狭窄,解决这两个问题的最有效方法是加速小口径人工血管移植后的内皮化。一氧化氮（NO）能够抑制血小板的黏附和活化以及平滑肌细胞的增殖,有助于预防急性血栓和内膜增生,同时促进内皮细胞的生长和迁移,加速血液接触材料的内皮化。人体血液中存在NO供体,它们可以被特定的催化剂加速分解并释放NO。REDV（Arg-Glu-Asp-Val）是一种来自于细胞外基质的四肽,它可以选择性地促进内皮细胞的黏附,而不会吸附其它细胞。本文制备了一种双重修饰的小口径人工血管并对其快速内皮化能力进行了考察,首先利用静电纺丝制备了聚己内酯血管基质材料并对其进行了改性修饰,将能催化NO生成的催化剂—硒代聚乙烯亚胺（SePEI）和接枝有REDV的透明质酸（HA）通过层层自组装技术负载到基质材料表面,然后对材料的性能和生物功能进行了表征和考察。通过扫描电子显微镜观察了层层自组装和负载REDV前后材料的微观形貌,发现静电纺丝材料和修饰后的材料均具有良好的纤维形态和高孔隙率。通过荧光显微镜观察和X射线光电子能谱分析证明REDV成功负载到基质材料上。水接触角的测试结果显示SePEI和HA的层层自组装及REDV的负载在一定程度上改善了PCL基质材料的亲水性。NO催化生成实验结果表明负载SePEI的材料具有良好的催化NO生成能力。成纤维细胞增殖实验表明,引入SePEI、HA和REDV的血管材料细胞相容性良好。在内皮细胞黏附实验中,负载REDV的材料上内皮细胞数量明显高于其他组。在内皮细胞和平滑肌细胞共培养实验中,双重修饰的材料在促进内皮细胞黏附的同时抑制了平滑肌细胞的黏附和铺展,提高了内皮细胞/平滑肌细胞比例。最后通过体内原位移植实验考察了双重修饰的血管的通畅性和内皮化情况,结果显示本研究设计的血管具有良好的快速内皮化能力,内皮层覆盖比例高,内皮细胞形态接近天然血管内皮细胞。综上所述,本课题制备的双重修饰的人工血管具有良好的抗凝血性和生物功能,能够为小口径人工血管的构建和改性提供新的思路。
马雯奂,韩丹,方伟蓉,李运曼[8]（2016）在《一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中的调节作用及相关治疗药物研究进展》文中研究指明一氧化氮（NO）是体内调节心血管系统功能的重要信号分子,在血管收舒、血小板活性调节、细胞增殖凋亡、氧化应激及炎症反应等过程中发挥了不可或缺的作用。在心肌缺血再灌注过程中,随着一氧化氮合成酶表达和NO底物水平的动态变化,NO生成的时间和产量均会发生变化,导致其作用具有两面性。综述NO的产生与作用、在心肌缺血再灌注损伤中的作用和影响因素以及相关治疗药物及作用机制的研究进展,为心肌缺血再灌注损伤的有效治疗和进一步研究提供参考。
薛丽[9]（2012）在《乙醛脱氢酶2在乙醇对内皮细胞保护中的作用及其机制研究》文中指出背景大量流行病学资料表明,适量饮酒有保护心血管系统的作用,可降低冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病,coronary artery disease, CAD）的发生率及病死率。早期研究多认为酒中的非乙醇活性成分起到了重要作用,后来研究发现乙醇对心血管系统起主要保护作用。实验室研究发现,低剂量乙醇可通过激活腺苷受体依赖的PI3K-Akt通路增强脐静脉内皮细胞内内皮型一氧化氮合酶（edothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达及活性,并增加一氧化氮（nitric oxide, NO）生成及释放。然而,乙醇作为一种外源性的小分子有机化合物,可通过自由扩散进入细胞内进行代谢,经由酒精代谢系统进行代谢时可伴随产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）。活性氧对内皮细胞eNOS有双面作用,并取决于ROS的水平。大量活性氧可通过eNOS脱偶联或者拮抗其上游调节分子来抑制eNOS活性,导致内皮细胞功能紊乱；而少量活性氧可以增强eNOS的活性。而在乙醇干预时的ROS水平取决于抗氧化体系的拮抗作用。近来研究发现,ALDH2不仅代谢乙醛,还可通过氧化丙二醛（malondialdehyde, MDA）和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）等毒性醛类物质来发挥间接抗氧化作用,拮抗ROS生成。多项研究结果表明调控ALDH2表达和活性可以影响机体细胞对氧化应激的应答。ALDH2活性可在转录、转录后调节与修饰、翻译和翻译后修饰不同水平上进行调节。尤其是,ALDH2活性可受乙酰化修饰的调控,其可被线粒体SIRT3直接脱乙酰化而导致酶活性下降。SIRT3具有依赖NAD+的组蛋白脱乙酰基酶活性,位于线粒体基质中,可以通过调控线粒体蛋白乙酰化水平触发一系列细胞适应性改变来应答代谢应激。SIRT3活性对细胞内NAD+/NADH比值变化十分敏感,呈正相关。有意思的是,乙醇代谢会导致NAD+/NADH比值下降,因此很有可能抑制SIRT3活性。因此,我们提出以下假说：乙醇可通过增强ALDH2酶活性来调节细胞内ROS水平,进而影响乙醇增强eNOS活性的作用；且SIRT3依赖的乙酰化修饰作用可能参与乙醇对ALDH2活性的调控过程。依赖于SIRT3的ALDH2乙酰化修饰可能是乙醇保护作用的重要机制,是防治动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）疾病的新靶点。方法1.细胞培养与处理：培养人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells, HAECs）,使用内皮细胞培养基进行培养。待细胞生长融合至80-90%时,用不同浓度的乙醇刺激不同时间；用P13K抑制剂或外源性NAD预处理细胞时,先用试剂预处理细胞24小时后,再用乙醇继续孵育30分钟；2. siRNA和质粒转染：用特异性siRNA对细胞ALDH2和SIRT3进行抑制,用构建好的SIRT3过表达质粒提高细胞内SIRT3表达。首先用脂质体与siRNA/质粒形成复合物,后转染入HAECs。转染后的细胞用／不用ROS清除剂预处理后,再加入乙醇继续孵育；3.实时定量RT-PCR检测：使用Trizol试剂提取细胞RNA,逆转录成cDNA后使用SYBR Green进行实时定量RT-PCR。基因的相对表达量采用2-△△ct计算。4. Western blotting检测：使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,使用Western blotting检测方法从蛋白水平检测用于检测HAECs中ALDH2、eNOS、p-eNOS、 Akt、p-Akt、PI3K、SIRT3、4-HNE等蛋白的表达量。5.免疫共沉淀：用裂解液提取细胞总蛋白,加入抗体和蛋白A/G琼脂糖吸附球共同孵育4℃过夜进行免疫沉淀,高速离心将琼脂糖球去除并吸取上清液进行后续Western blotting检测。6.内皮细胞eNOS活性检测：应用eNOS检测试剂盒来分析细胞eNOS的活性,在激发波长495nm,发射波长515nm下进行吸光度测量。eNOS相对活性用实验组与对照组的活性比值来表示。7.线粒体ALDH2酶活性检测：提取细胞线粒体,线粒体ALDH2活性是通过在酶标仪上监测A340nm下NAD+转化为NADH的含量变化所得。ALDH2酶活性单位为nmol/mg/min。8.线粒体SIRT3活性检测：采用SIRT3活性荧光定量检测试剂盒检测,在激发光340nm和发射光440nm检测荧光值。SIRT3相对活性是实验组与对照组的活性比值来表示。9.细胞内ROS水平检测：应用DCFH-DA荧光探针对细胞内活性氧簇进行标记,后在流式细胞仪上进行检测。10.线粒体NAD+/NADH比值检测：细胞收集后提取线粒体,采用NAD+/NADH比值检测试剂盒进行检测,分别在450nm处读取NADt和NADH数值。NAD+/NADH比值计算式为：[NADt-NADH]/NADH。结果1.乙醇对内皮细胞eNOS活性的作用呈剂量依赖性：在不同浓度乙醇处理细胞30min后,随乙醇浓度增加,内皮细胞eNOS活性逐渐升高,在20mM乙醇作用下达到最高峰（1.67倍,P<0.001）,而后随乙醇浓度增加eNOS活性逐渐下降,至100mM乙醇作用时回到基线水平。乙醇对eNOS活性调控呈时间依赖性：在乙醇作用5min后,内皮细胞eNOS活性即开始升高,在30min后达最大值,之后逐渐下降,且在乙醇作用120min后,内皮细胞eNOS活性仍然显着高于对照组（P<0.001）；2.20mM乙醇作用30min后可使p-eNOS和p-Akt蛋白表达明显增加,与乙醇对eNOS活性的作用趋势一致,且乙醇的这一作用可被P13K抑制剂拮抗,提示乙醇是通过激活PI3K/Akt通路提高内皮细胞eNOS活性的；3. ALDH2的活性在乙醇刺激下呈时间依赖性改变：乙醇处理后15min,内皮细胞ALDH2活性即开始明显增加,并在30min达到最大值（1.65倍,P<0.001）,但随后即迅速下降,但对ALDH2mRNA和蛋白表达没有影响；4. ALDH2siRNA抑制内皮细胞ALDH2表达后,可拮抗乙醇增加Akt和eNOS活性的作用；5.20mM乙醇对细胞内ROS含量没有影响。而在ALDH2siRNA预孵育的细胞中发现,乙醇干预细胞后ROS含量明显升高66%。且ROS清除剂（NAC和DTT）可拮抗ALDH2siRNA对乙醇内皮保护的抑制作用；6.乙酰化ALDH2蛋白表达变化与乙醇刺激呈时间依赖性。乙醇处理后15min,内皮细胞乙酰化ALDH2蛋白表达即开始明显增加,并在30min达到峰值（P<0.001）,但随后即明显下降,与ALDH2活性变化趋势一致；7.20mM乙醇处理15min后SIRT3活性即下降,在30min时下降最为明显,然后随时间增加又逐渐恢复到基线水平。且过表达SIRT3可以抵抗乙醇上调ALDH2乙酰化和活性的作用；8. SIRT3过表达的内皮细胞受乙醇刺激后,ROS水平明显增加。且乙醇激活Akt和eNOS的作用也被SIRT3过表达质粒所抑制；9.乙醇处理内皮细胞15min后NAD+/NADH比值显着下降,在30min时下降达最低值。外源性NAD干预下,乙醇抑制SIRT3活性的作用明显减弱,且可抑制乙醇上调ALDH2和eNOS活性的作用。结论1.乙醇通过激活PI3K-Akt通路提高eNOS活性；2.乙醇可上调ALDH2活性；3. ALDH2是一种内源性抗氧化应激因子,使细胞在乙醇处理后保持氧化还原状态稳定,从而使乙醇增强eNOS活性的作用顺利实现；4.乙醇通过降低SIRT3活性,上调ALDH2乙酰化水平和活性；5.乙醇通过降低NAD+/NADH比值抑制SIRT3活性。背景内皮衰老是导致动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）发生发展的重要原因。内皮细胞衰老是正常血管随增龄发生的自然现象,同时伴随端粒缩短和端粒酶活性下降,亦称为复制性衰老,是老年人发生AS的主要原因。适量饮酒可以有效预防老年人AS疾病的发生,降低冠心病发病率、死亡率和全因死亡率,具有延缓衰老,延长人类寿命的作用。因此本实验着重研究饮酒抗衰老的作用机制,来探讨防治AS新的靶分子蛋白。一些研究发现,低剂量乙醇可以提高静息内皮细胞eNOS活性,增加NO释放。既然乙醇可以增强静息内皮细胞eNOS的活性,那么乙醇的这一作用机制很可能也存在于衰老内皮细胞中。且以往一项研究表明,适量乙醇摄入可以抵抗增龄相关的认知功能障碍,提示乙醇可以影响衰老进程。SIRT1是一类调控生物体寿命的重要蛋白,属于第三类组蛋白去乙酰化酶。它可以与染色质、转录因子、转录共调控因子和非组蛋白底物相互作用,通过去酰化作用调节细胞生存、衰老、凋亡等发生发展等一系列生理病理过程。SIRT1作为一个重要的细胞内调控蛋白,其自身的表达和活性不仅受基因表达的调控,还受细胞内NAD+/NADH比值、氧化应激、翻译后修饰和SIRT1核-浆穿梭变化影响。论文I中已证实适量乙醇可快速上调NAD+/NADH比值而影响SIRT3活性,由于SIRT1与SIRT3同源性较高,催化活性域的氨基酸序列同源性可达89%,故乙醇很有可能也会影响SIRT1的生物学功能。我们前期研究发现这乙醇增强静息内皮细胞eNOS活性的作用可被乙醇诱导的高活性乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase2, ALDH2）所调控,ALDH2起到“分子开关”作用。那么,乙醇是否可通过调控ALDH2影响内皮衰老,目前还无相关报道。线粒体ALDH2是一种酒精代谢关键酶,在心血管系统表达丰富。流行病学研究发现高活性的ALDH2可能会预防AS的发生发展。国内外陆续有研究表明,ALDH2具有拮抗衰老的作用。我们前期研究已证实ALDH2是一种内源性抗氧化应激因子。而氧化应激学说是衰老机制理论的重要组成部分,尤其是可影响SIRT1功能,故ALDH2可能是通过抗氧化应激来影响SIRT1功能,进而发挥抑制衰老的作用,是防治AS的新靶点。因此我们提出如下假说：乙醇具有延缓内皮复制性衰老的作用,且SIRT1与ALDH2这两种抗衰老蛋白均可能在此过程中发挥重要介导作用；低剂量乙醇可能通过上调ALDH2活性诱导SIRT1生物学功能增强,进而延缓内皮衰老、拮抗AS发生与发展。方法1.细胞培养与处理：培养人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells, HAECs）,使用内皮细胞培养基在37℃和5%CO2孵育箱内进行培养。2.构建HAECs复制性衰老模型：采用连续传代方法构建内皮细胞复制性衰老模型,每一代细胞传代前均行细胞数目检测,计算群体倍增水平（population doubling level, PDL）。本实验中发现PDL22细胞继续培养后会进入衰老状态,故将PDL22作为本实验的衰老模型。3.乙醇处理衰老细胞：待衰老细胞生长融合至85%左右时,饥饿24h后用不同浓度乙醇（OmM,5mM,20mM,50mM,100mM）处理6天。4.细胞活性检测：采用CCK-8试剂盒进行检测,在450nnm处测定吸光度值。5.p-半乳糖苷酶染色：对细胞进行p-半乳糖苷酶染色,衰老细胞呈现蓝染,并在光学显微镜下计数染色阳性细胞数目。6. BrdU增殖检测：BrdU可代替胸腺嘧啶掺入到新合成的DNA中,用免疫细胞化学法标记BrdU,并在酶标仪上450nm处读取吸光度值来检测细胞增殖能力。7. siRNA和质粒转染：用特异性siRNA对细胞ALDH2和SIRT1进行抑制,用ALDH2表达质粒和特异性定位核／胞质的SIRT1过表达质粒分别提高细胞内ALDH2和核／胞质内SIRT1表达。首先用脂质体与siRNA/质粒形成复合物,后转染入HAECs。转染后的细胞再加入乙醇继续孵育；8.实时定量RT-PCR检测：使用Trizol试剂提取细胞RNA,逆转录成cDNA后使用SYBR Green进行实时定量RT-PCR。基因的相对表达量采用2-△△ct的计算方法。9. Western blotting检测：使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,使用Western blotting检测方法从蛋白水平检测用于检测细胞中ALDH2、eNOS、SIRT1等蛋白的表达量。10.内皮细胞eNOS活性检测：应用eNOS检测试剂盒来分析细胞eNOS的活性,在激发波长495nm,发射波长515nm下进行吸光度测量。eNOS相对活性是用实验组与对照组的活性比值来表示的。11.线粒体ALDH2酶活性检测：提取细胞线粒体,线粒体ALDH2活性是通过在酶标仪上监测A340nm下NAD+转化为NADH的含量变化所得。ALDH2酶活性单位为nmol/mg/min。12.免疫荧光染色：细胞培养终止后,用一抗反应液进行孵育,随后用荧光标记的二抗进行处理,最后用含DAPI的防淬灭封片剂封片在免疫共聚焦显微镜下观察。结果1.通过对HAECs细胞株连续传代培养,根据细胞形态学、SA-β-gal衰老染色、BrdU增殖检测、细胞活性等指标变化表明,PDL8细胞属于年轻细胞,而PDL22细胞开始进入衰老状态；2.衰老细胞中eNOS蛋白、mRNA表达和活性均明显下降,表明内皮复制性衰老伴随内皮功能下降；3.通过检测不同浓度（0mM、5mM、20mM、50mM、100mM）乙醇处理6天后细胞细胞衰老表型的变化,结果显示20mM乙醇有延缓内皮衰老的作用,5mM乙醇对内皮衰老表型改变不大,而50Mm和100mM乙醇明显降低细胞数目；4.20mM乙醇可增加衰老内皮细胞内eNOS mRNA和蛋白表达,并增强其活性,进一步证实20mM乙醇有改善衰老内皮细胞功能的作用；5. SIRT1在衰老细胞内的分布发生明显变化：与年轻PDL8细胞相比,衰老细胞内SIRT1在核内蛋白表达明显下降,而在胞质中表达增强,但是SIRT1的总蛋白量没有发生改变,即SIRT1发生了核浆转位；6.通过特异性过表达衰老细胞内核/胞质SIRT1发现,定位核而非胞质的SIRT1具有抵抗内皮细胞复制性衰老的作用；7.20mM乙醇可增强衰老内皮细胞内SIRT1在核中的表达,抑制其在胞浆中的蛋白表达,即乙醇有抑制衰老内皮细胞SIRT1核浆转位的作用；进一步应用SIRT1siRNA特异性抑制其表达后,乙醇延缓内皮衰老的作用明显削弱；8.与年轻细胞相比,衰老细胞内ALDH2蛋白、mRNA表达和活性明显下降,提示在内皮细胞复制性衰老进程中,ALDH2表达和活性明显下降；9.应用ALDH2过表达质粒转染PDL22细胞后6天,结果表明ALDH2过表达可明显延缓HAECs复制性衰老并改善内皮功能；10.20mM乙醇可增加衰老内皮细胞内ALDH2mRNA和蛋白表达,并增强其活性；应用ALDH2特异性siRNA转染PDL22细胞来抑制其表达后,结果发现乙醇延缓内皮衰老的作用明显减弱；11.ALDH2特异性siRNA转染PDL22细胞后再用乙醇孵育,结果发现乙醇抑制SIRT1核浆转位的作用明显削弱。结论1.成功建立HAECs复制性衰老模型；2.乙醇具有延缓HAECs复制性衰老并增强衰老内皮细胞功能的作用；3. HAECs复制性衰老伴随SIRT1核浆转位,乙醇可通过抑制SIRT1核浆转位来延缓HAECs复制性衰老；4. HAECs复制性衰老伴随ALDH2表达和活性下降,乙醇可通过增强ALDH2表达和活性来延缓HAECs复制性衰老；5.乙醇可通过增强ALDH2表达和活性,来抑制SIRT1核浆转位,ALDH2-SIRT1通路可能是乙醇延缓内皮衰老的重要分子机制。
陈颖,季晖,赖宜生[10]（2009）在《一氧化氮供体型化合物的抗肿瘤作用研究进展》文中研究表明综述一氧化氮供体抗肿瘤作用机制的实验研究新进展,分类介绍一氧化氮供体型化合物及其抗肿瘤活性。一氧化氮供体可通过靶向释放一氧化氮,直接杀伤肿瘤细胞,提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性,增强免疫系统作用,削弱肿瘤细胞侵袭能力,并抑制其转移,从而发挥抗肿瘤作用。
二、亚硝基乙酰青霉胺抑制人血管平滑肌细胞增殖的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、亚硝基乙酰青霉胺抑制人血管平滑肌细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
（1）基于黄酮醇结构的光控CO荧光给体分子的开发和光控释放研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 一氧化碳的生物学意义 |
| 1.2 有机光控CO给体分子 |
| 1.2.1 基于不饱和环二酮光解反应的光控CO给体分子 |
| 1.2.2 基于羧酸光解反应的光控CO给体分子 |
| 1.2.3 基于羟基黄酮光解反应的光控CO给体分子 |
| 1.3 光化学生物学应用简介 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 具有聚集诱导发光特性的光控一氧化碳给体分子的开发 |
| 2.1 课题背景和设计思路 |
| 2.2 光控CO荧光给体分子2-1的合成路线 |
| 2.3 实验结果及讨论 |
| 2.3.1 光控CO给体分子2-1随光照时间变化的紫外可见吸收光谱 |
| 2.3.2 光控CO给体分子2-1随光照时间变化的荧光光谱 |
| 2.3.3 光控CO给体分子2-1在不同溶剂中的荧光光谱 |
| 2.3.4 光控CO给体分子2-1光照前后的动态散射图 |
| 2.3.5 验证光控CO给体分子2-1释放CO能力 |
| 2.3.6 光控CO给体分子2-1的反应动力学实验 |
| 2.3.7 光解产物2-1P的质谱验证 |
| 2.4 本章小结和讨论 |
| 2.5 实验部分 |
| 2.5.1 仪器和原料 |
| 2.5.2 光控CO给体分子2-1的合成与结构表征 |
| 2.5.3 光谱测试条件 |
| 第3章 前言 |
| 3.1 一氧化氮的生物学意义 |
| 3.2 有机光控NO给体分子 |
| 3.2.1 N-亚硝胺类光控NO给体分子 |
| 3.2.2 偶氮二醇烯盐类光控NO给体分子 |
| 3.2.3 O-取代的硝基苯及其衍生物类光控NO给体分子 |
| 3.3 一氧化碳和一氧化氮的相互作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 光控一氧化碳和一氧化氮双释放荧光给体分子的开发 |
| 4.1 课题背景与设计思路 |
| 4.2 合成路线 |
| 4.2.1 光控CO给体分子4-2的合成 |
| 4.2.2 光控NO给体分子4-4的合成 |
| 4.2.3 光解补偿型CO探针4-5的合成 |
| 4.2.4 光控CO、NO双释放给体分子4-6的合成 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 光控CO给体分子4-2的光解反应研究 |
| 4.3.2 光控NO给体分子4-4的光解反应研究 |
| 4.3.3 光解补偿型CO探针4-5的研究 |
| 4.3.4 化合物4-4和4-6的脱保护 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 实验部分 |
| 4.5.1 实验仪器和原料 |
| 4.5.2 化合物的合成与结构表征 |
| 4.5.3 光谱测试部分 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）具有一氧化氮释放功能的人工血管材料（论文提纲范文）
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 NO的心血管生理功能 |
| 2.2 负载有催化NO释放物质的人工血管材料 |
| 2.2.1 负载有机硒的人工血管材料 |
| 2.2.2 负载铜的人工血管材料 |
| 2.2.3 同时负载有机硒和铜离子的人工血管材料 |
| 2.2.4 含有角蛋白的人工血管材料 |
| 2.2.5 其他含有催化NO生成物质的人工血管材料 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（3）蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ PGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅲ AMPKβ1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（4）具有手性的NO催化释放型血管支架涂层的构建与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 心血管支架及其表面改性 |
| 1.2.1 动脉粥样硬化的发生与治疗 |
| 1.2.2 血管支架的发展与应用 |
| 1.2.3 血管支架的表面改性策略 |
| 1.3 材料表面手性与生物相容性 |
| 1.3.1 材料表面手性与蛋白吸附 |
| 1.3.2 材料表面手性与细胞行为 |
| 1.3.3 手性生物界面材料 |
| 1.4 生物信号分子NO及其应用 |
| 1.4.1 NO的生物学功能与NO供体 |
| 1.4.2 NO释放型材料 |
| 1.4.3 NO催化释放型材料 |
| 1.5 金属有机骨架化合物 |
| 1.5.1 金属有机骨架化合物简介 |
| 1.5.2 金属有机骨架化合物在生物医学上的应用 |
| 1.5.3 金属有机骨架化合物与NO催化释放 |
| 1.6 铜离子与血管支架表面改性 |
| 1.6.1 铜的生理作用 |
| 1.6.2 铜离子与NO催化释放 |
| 1.6.3 铜与血管支架表面改性 |
| 1.7 聚多巴胺涂层在材料表面改性中的应用 |
| 1.7.1 贻贝粘附蛋白与聚多巴胺涂层 |
| 1.7.2 聚多巴胺涂层在生物材料表面改性中的应用 |
| 1.8 课题的研究目的与意义、主要内容及技术路线 |
| 1.8.1 课题的提出、目的及意义 |
| 1.8.2 研究内容及技术路线 |
| 第2章 氧化钛表面手性赖氨酸与酒石酸分子的固定及生物相容性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 氧化钛薄膜的制备和手性分子的固定与表征 |
| 2.2.1 材料的制备 |
| 2.2.2 材料学表征 |
| 2.2.3 结果与分析 |
| 2.3 表面手性对血液相容性的影响 |
| 2.3.1 手性表面典型血浆蛋白的吸附 |
| 2.3.2 血小板黏附与激活评价 |
| 2.4 细胞相容性评价 |
| 2.4.1 血管内皮细胞与平滑肌细胞粘附与增殖 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 NO催化释放与手性协同作用构建抗凝、促内皮与抗增生血管支架表面 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 手性硒代胱胺酸分子的固定与表征 |
| 3.2.1 材料的制备 |
| 3.2.2 材料学表征 |
| 3.2.3 结果与分析 |
| 3.3 蛋白吸附与NO催化释放行为研究 |
| 3.3.1 实验方法 |
| 3.3.2 结果与讨论 |
| 3.4 血小板黏附与激活行为研究 |
| 3.4.1 实验方法 |
| 3.4.2 结果与讨论 |
| 3.5 细胞相容性研究 |
| 3.5.1 实验方法 |
| 3.5.2 结果与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 纳米Cu-MOFs的固定与手性分子修饰构建多功能血管支架涂层 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 Cu-MOFs纳米颗粒的合成与固定 |
| 4.2.1 Cu-MOFs的合成与表征 |
| 4.2.2 纳米Cu-MOFs的固定与表征 |
| 4.3 NO催化释放与铜离子缓释 |
| 4.3.1 实验方法 |
| 4.3.2 结果与讨论 |
| 4.4 血液相容性研究 |
| 4.4.1 实验方法 |
| 4.4.2 结果与讨论 |
| 4.5 细胞相容性研究 |
| 4.5.1 实验方法 |
| 4.5.2 结果与讨论 |
| 4.6 表面的手性分子修饰 |
| 4.6.1 样品的制备 |
| 4.6.2 NO催化释放 |
| 4.6.3 血小板粘附与激活 |
| 4.6.4 ECs的培养 |
| 4.7体内植入实验 |
| 4.7.1 实验方法 |
| 4.7.2 结果与讨论 |
| 4.8 NO与 Cu离子的协同作用机制分析 |
| 4.8.1 涂层的抗凝机制 |
| 4.8.2 NO与 Cu离子在抗平滑肌增生与促进再内皮化中的协同作用 |
| 4.9 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及科研成果 |
| 一、发表的主要论文 |
| 二、参加的国际会议 |
| 三、完成的专利 |
| 四、主持/参加的科研项目 |
（5）基于微纳米结构及表面化学构建多功能心血管支架表面及其生物相容性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 心血管疾病及动脉粥样硬化 |
| 1.1.2 心血管疾病的介入治疗及其存在的问题 |
| 1.2 内皮化 |
| 1.2.1 血管内皮的结构与功能 |
| 1.2.2 再内皮化方法 |
| 1.2.3 一氧化氮(NO) |
| 1.2.4 REDV肽 |
| 1.3 表面微图形对细胞行为的影响 |
| 1.3.1 微图形简介及相关技术 |
| 1.3.2 微图形对细胞行为的影响 |
| 1.3.3 表面微图形在血管组织工程中的应用 |
| 1.4 纳米纤维及其对细胞行为的影响 |
| 1.4.1 纳米纤维及相关技术 |
| 1.4.2 纳米纤维对细胞行为的影响 |
| 1.4.3 纳米纤维在血管组织工程中的应用 |
| 1.5 选题意义及研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究方案和内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第2章 基于表面化学构建具有一氧化氮释放功能的微图案化表面的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 具有一氧化氮释放功能的微图案化涂层制备 |
| 2.2.1 微图案的制备 |
| 2.2.2 微沟槽化二氧化钛薄膜的制备 |
| 2.2.3 一氧化氮释放涂层的构建 |
| 2.3 微图形化涂层的材料学表征及生物学表征 |
| 2.3.1 扫描电子显微镜(SEM)检测 |
| 2.3.2 原子力显微镜(AFM)检测 |
| 2.3.3 静态表面水接触角检测 |
| 2.3.4 Zeta电位检测 |
| 2.3.5 X射线光电子能谱(XPS)检测 |
| 2.3.6 NO催化释放速度检测 |
| 2.3.7 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养 |
| 2.3.8 HUVECs的评价 |
| 2.3.9 人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)培养 |
| 2.3.10 HUASMCs的评价 |
| 2.3.11 HUVECs和 HUASMCs共培养 |
| 2.3.12 血小板粘附与激活实验 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 扫描电子显微镜(SEM)检测 |
| 2.4.2 原子力显微镜(AFM)检测 |
| 2.4.3 表面水接触角检测 |
| 2.4.4 Zeta电位 |
| 2.4.5 X射线光电子能谱(XPS)检测 |
| 2.4.6 NO催化释放速度检测 |
| 2.4.7 HUVECs粘附与增殖 |
| 2.4.8 HUVECs钙粘蛋白与肌动蛋白染色 |
| 2.4.9 HUASMCs粘附与增殖 |
| 2.4.10 HUVECs和 HUASMCs共培养 |
| 2.4.11 血小板粘附与激活实验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 自组装多肽纳米纤维膜的制备及生物相容性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 (RADA)_4-REDV自组装纳米纤维的制备工艺的探讨 |
| 3.2.1 (RADA)_4-REDV薄膜的制备 |
| 3.2.2 涂层的表征 |
| 3.2.3 实验结果与讨论 |
| 3.3 (RADA)_4-U自组装纳米纤维的制备工艺的探讨 |
| 3.3.1 (RADA)_4-U薄膜的制备 |
| 3.3.2 涂层的表征 |
| 3.3.3 实验结果与讨论 |
| 3.4 (RADA)_4-REDV@(RADA)_4-U自组装纳米纤维的制备工艺 |
| 3.5 涂层的材料学表征及生物学表征 |
| 3.5.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR) |
| 3.5.2 扫描电子显微镜(SEM) |
| 3.5.3 原子力显微镜(AFM) |
| 3.5.4 表面水接触角 |
| 3.5.5 NO催化释放速度 |
| 3.5.6 HUVECs粘附与增殖 |
| 3.5.7半体内动物实验 |
| 3.6 实验结果与讨论 |
| 3.6.1 表面形貌 |
| 3.6.2 傅里叶变换红外光谱(FTIR) |
| 3.6.3 表面水接触角(WCA) |
| 3.6.4 NO催化释放速度 |
| 3.6.5半体内动物实验 |
| 3.7 本章小结 |
| 结论 |
| 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 |
（6）具有纤溶活性的多功能血液接触材料表面（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血液接触材料概论 |
| 1.2 材料表面血栓的形成 |
| 1.3 抗血栓材料研究现状 |
| 1.3.1 生物惰性表面的构建 |
| 1.3.2 生物活性表面的构建 |
| 1.3.3 表面内皮化 |
| 1.4 多种功能分子共同改性制备多功能抗血栓表面 |
| 1.4.1 “生物活性”与“生物惰性”功能相结合 |
| 1.4.2 多种“生物活性”功能相结合 |
| 1.5 课题的提出 |
| 第2章 具有纤溶活性及原位催化释放一氧化氮功能的聚氨酯材料表面 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 化学试剂及仪器 |
| 2.2.2 LysMA的合成 |
| 2.2.3 PU-POL-Se表面的制备 |
| 2.2.4 分析测试 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PU-POL-Se表面的制备及表征 |
| 2.3.2 蛋白质吸附测试 |
| 2.3.3 血栓溶解实验 |
| 2.3.4 体外催化释放NO测试 |
| 2.3.5 HUVSMCs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 2.3.6 血小板黏附实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 通过分步固定策略制备具有催化释放一氧化氮及类肝素或纤溶功能的多功能表面 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 化学试剂及仪器 |
| 3.2.2 AdaMA的合成 |
| 3.2.3 CD衍生物的合成 |
| 3.2.4 PU-PHLA/CD-S表面的制备 |
| 3.2.5 分析测试 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PU-PHA-Se/CD-L及PU-PHA-Se/CD-S表面的制备及表征 |
| 3.3.2 蛋白质吸附测试 |
| 3.3.3 血栓溶解实验 |
| 3.3.4 血浆复钙化时间实验 |
| 3.3.5 体外催化释放NO测试 |
| 3.3.6 HUVSMCs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 3.3.7 HUVECs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 3.3.8 血小板黏附实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 具有纤溶活性、促进内皮细胞生长及抑制平滑肌细胞黏附的多功能聚氨酯材料表面 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 化学试剂及仪器 |
| 4.2.2 LysMA的合成 |
| 4.2.3 AdaMA的合成 |
| 4.2.4 CD-S衍生物的合成 |
| 4.2.5 PU-PHLA/CD-S表面的制备 |
| 4.2.6 分析测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PU-PHLA/CD-S表面的制备及表征 |
| 4.3.2 蛋白质吸附测试 |
| 4.3.3 血浆复钙化时间实验 |
| 4.3.4 血栓溶解实验 |
| 4.3.5 HUVECs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 4.3.6 HUVSMCs在材料表面的黏附实验 |
| 4.3.7 血小板黏附实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 利用层层组装和主客体相互作用制备具有纤溶活性、血管细胞选择性及抗菌活性的多功能表面 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 化学试剂及仪器 |
| 5.2.2 P(SSNa-co-Ada)的合成 |
| 5.2.3 CD-L的合成 |
| 5.2.4 Au-LBL/CD-L表面的制备 |
| 5.2.5 分析测试 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 Au-LBL/CD-L表面的制备及表征 |
| 5.3.2 蛋白质吸附测试 |
| 5.3.3 血浆复钙化时间实验 |
| 5.3.4 血栓溶解实验 |
| 5.3.5 HUVECs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 5.3.6 HUVSMCs在材料表面的黏附及增殖实验 |
| 5.3.7 材料表面细菌黏附及抗菌实验 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 博士论文工作期间科研成果与奖励 |
| 致谢 |
（7）双重修饰的小口径人工血管的快速内皮化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第一节 人工血管的研究背景 |
| 第二节 血管移植物的研究历史及现状 |
| 1.2.1 天然生物血管 |
| 1.2.2 合成血管 |
| 1.2.3 组织工程血管 |
| 1.2.3.1 种子细胞 |
| 1.2.3.2 支架材料 |
| 1.2.3.3 生物信号分子 |
| 1.2.4 组织诱导性血管 |
| 第三节 人工血管制备技术 |
| 1.3.1 多孔支架加工 |
| 1.3.2 表面改性和修饰 |
| 第四节 小口径人工血管快速内皮化研究的意义和策略 |
| 1.4.1 小口径人工血管快速内皮化研究的意义 |
| 1.4.2 血管内皮细胞的生理功能 |
| 1.4.3 小口径人工血管快速内皮化策略 |
| 1.4.4 一氧化氮释放/生成材料在小口径人工血管快速内皮化中的应用研究 |
| 1.4.4.1 一氧化氮的生理功能 |
| 1.4.4.2 一氧化氮释放材料在小口径人工血管快速内皮化中的应用研究 |
| 1.4.4.3 一氧化氮生成材料在小口径人工血管快速内皮化中的应用研究 |
| 1.4.5 细胞外基质衍生多肽在小口径人工血管快速内皮化中的应用研究 |
| 第五节 课题的提出 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 材料与试剂 |
| 第二节 仪器 |
| 第三节 主要试剂配制 |
| 2.3.1 缓冲液的配制 |
| 2.3.2 层层自组装所用溶液的配制 |
| 2.3.3 细胞实验相关试剂和培养基的配制 |
| 2.3.4 动物实验相关试剂的配制 |
| 第四节 实验部分 |
| 2.4.1 静电纺丝膜材料的制备 |
| 2.4.2 静电纺丝血管支架的制备 |
| 2.4.3 3,3’-联硒二丙酸的合成 |
| 2.4.4 硒代聚乙烯亚胺的合成 |
| 2.4.5 透明质酸-REDV的合成 |
| 2.4.6 异硫氰酸荧光素标记REDV |
| 2.4.7 静电纺丝膜材料的层层自组装修饰 |
| 2.4.8 静电纺丝血管支架的层层自组装修饰 |
| 2.4.9 X射线光电子能谱测试 |
| 2.4.10 静态水接触角测试 |
| 2.4.11 拉伸力学测试 |
| 2.4.12 爆破压测试 |
| 2.4.13 体外催化一氧化氮释放实验 |
| 2.4.14 成纤维细胞增殖实验 |
| 2.4.15 内皮细胞黏附实验 |
| 2.4.16 内皮细胞和平滑肌细胞共培养实验 |
| 2.4.17 原位移植实验 |
| 2.4.18 多普勒超声检测 |
| 2.4.19 体式显微镜及扫描电子显微镜观察 |
| 2.4.20 H&E染色 |
| 2.4.21 免疫荧光染色 |
| 2.4.22 统计分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 第一节 材料的制备与表征 |
| 3.1.1 静电纺丝纤维膜的微观形貌 |
| 3.1.2 荧光标记REDV并层层自组装修饰后纤维膜的微观形貌 |
| 3.1.3 静电纺丝血管支架的微观形貌 |
| 3.1.4 SeDPA的结构表征 |
| 3.1.5 SePEI的结构表征 |
| 3.1.6 表面元素分析 |
| 3.1.7 材料亲水性 |
| 3.1.8 材料力学性能 |
| 3.1.9 材料催化GSNO生成NO的能力 |
| 第二节 细胞实验 |
| 3.2.1 材料细胞相容性 |
| 3.2.2 内皮细胞黏附 |
| 3.2.3 内皮细胞和平滑肌细胞共培养 |
| 第三节 体内实验 |
| 3.3.1 血管通畅率 |
| 3.3.2 血管内腔面形貌（体视显微镜观察结果） |
| 3.3.3 血管内腔面形貌（扫描电子显微镜观察结果） |
| 3.3.4 血管内皮化情况 |
| 第四章 总结与展望 |
| 第一节 全文总结 |
| 第二节 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中的调节作用及相关治疗药物研究进展（论文提纲范文）
| 1 一氧化氮的产生与作用 |
| 1.1 酶途径 |
| 1.1.1底物L-精氨酸 |
| 1.1.2一氧化氮合成酶 |
| 1.2 非酶途径 |
| 2 心肌缺血再灌注损伤的机制 |
| 3 一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中的作用 |
| 3.1 舒张血管 |
| 3.1 抑制血小板聚集 |
| 3.3 影响细胞凋亡 |
| 3.4 影响细胞炎症反应 |
| 3.5 影响细胞氧化应激 |
| 4 一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中作用的影响因素 |
| 4.1 心肌缺血期 |
| 4.2 心肌缺血再灌注早期 |
| 4.3 心肌缺血再灌注后期 |
| 5 用于心肌缺血再灌注损伤的一氧化氮相关治疗药物及其作用机制 |
| 5.1 一氧化氮供体 |
| 5.1.1有机硝酸酯 |
| 5.1.2硝普钠 |
| 5.1.3 NO-亲核复合物 |
| 5.1.4 S-亚硝基硫醇 |
| 5.2 一氧化氮合成酶调节剂 |
| 5.2.1一氧化氮合成酶诱导剂 |
| 5.2.2一氧化氮合成酶抑制剂 |
| 5.3 一氧化氮合成底物及相关药物 |
| 5.4 其他 |
| 6 结语与展望 |
（9）乙醛脱氢酶2在乙醇对内皮细胞保护中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ |
| ALDH2在乙醇对内皮细胞保护中的作用及其机制研究 中文摘要 英文摘要 符号说明 前言 材料和方法 结果 讨论 结论 附图 参考文献 论文Ⅱ |
| ALDH2介导乙醇延缓内皮衰老的作用 中文摘要 英文摘要 符号说明 前言 材料和方法 结果 讨论 结论 附图 参考文献 致谢 攻读博士学位期间发表的论文目录 学位论文评阅及答辩情况表 外文论文 |
（10）一氧化氮供体型化合物的抗肿瘤作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 NO供体的抗肿瘤作用机制 |
| 2 NO供体型化合物种类及其抗肿瘤活性 |
| 2.1 有机硝酸酯 |
| 2.2 硝普盐 |
| 2.3 S-亚硝基硫醇 |
| 2.3.1 S-亚硝基-N-乙酰青霉胺 |
| 2.3.2 糖基化S-亚硝基-N-乙酰青霉胺 |
| 2.3.3 S-亚硝基谷胱甘肽 |
| 2.4 偶氮二醇盐 |
| 2.4.1 离子型偶氮二醇盐 |
| 2.4.2 O2取代的偶氮二醇盐 |
| 3 结语 |
四、亚硝基乙酰青霉胺抑制人血管平滑肌细胞增殖的实验研究（论文参考文献）
- [1]基于黄酮醇结构的光控CO荧光给体分子的开发和光控释放研究[D]. 赵辉. 华东理工大学, 2021(08)
- [2]具有一氧化氮释放功能的人工血管材料[J]. 申瑞秋,刘志明,宋俊祎,胡碧茹. 中国组织工程研究, 2021(28)
- [3]蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究[D]. 周胜男. 山东大学, 2020(10)
- [4]具有手性的NO催化释放型血管支架涂层的构建与应用研究[D]. 范永鸿. 西南交通大学, 2019
- [5]基于微纳米结构及表面化学构建多功能心血管支架表面及其生物相容性研究[D]. 郭倩如. 西南交通大学, 2019(04)
- [6]具有纤溶活性的多功能血液接触材料表面[D]. 顾皓. 苏州大学, 2017(01)
- [7]双重修饰的小口径人工血管的快速内皮化[D]. 王园园. 南开大学, 2016(03)
- [8]一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中的调节作用及相关治疗药物研究进展[J]. 马雯奂,韩丹,方伟蓉,李运曼. 药学进展, 2016(02)
- [9]乙醛脱氢酶2在乙醇对内皮细胞保护中的作用及其机制研究[D]. 薛丽. 山东大学, 2012(12)
- [10]一氧化氮供体型化合物的抗肿瘤作用研究进展[J]. 陈颖,季晖,赖宜生. 药学进展, 2009(10)