霍乱弧菌散发株耐药性遗传分析

一、霍乱弧菌散发菌株的耐药遗传分析（论文文献综述）

陈锋^[1]（2021）在《铜绿假单胞菌噬菌体对小鼠急、慢性肺炎模型的疗效探究》文中研究表明目的:从不同的外界环境中分离和纯化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）烈性噬菌体,鉴定这些噬菌体的重要生物学特性,如基因组特征、形态学特征、裂解谱和抗菌效果等,从而筛选出可用于治疗性试验的噬菌体候选株;通过构建小鼠急、慢性肺部感染模型评估噬菌体在体内的抗菌活性,为开发新型抗铜绿假单胞菌制剂提供理论基础和实验依据。方法:以铜绿假单胞菌实验室菌株PAO1、ATCC27853、PA14为宿主,通过双层琼脂平板法,分离、纯化和验证铜绿假单胞菌烈性噬菌体;纯化后的噬菌体通过聚乙二醇（polyethylene glycol 8000,PEG8000）进行颗粒浓缩,以及经氯化铯（cesium chloride,Cs Cl）密度梯度超高速离心去除噬菌体溶液中所含大量的内毒素;通过噬斑测定实验观察噬菌体在含不同细菌平板上形成的噬斑表型特征,进而测定噬菌体的裂解谱;用2%磷钨酸钾（potassium phosphotungstate）对病毒粒子进行负染色后置于透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）下观察噬菌体的微观形态特征;利用无水乙醇沉淀法制备噬菌体基因组,并送生物公司进行测序;通过监测细菌生长动力学观察噬菌体体外抗菌活性;以及利用实验室菌株PAO1和临床分离多重耐药（multi-drug resistance,MDR）铜绿假单胞菌W19和琼脂包裹的粘液型菌株FRD1构建小鼠急、慢性肺炎模型,通过检测感染小鼠肺部细菌克隆形成单位（colony-forming units,CFU）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞因子（白细胞介素（interleukin,IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α）变化,以及肺组织病理学,从多方面评估体内噬菌体疗效。结果:本次实验以PAO1和ATCC27853为宿主菌,成功地分离纯化得到4株烈性噬菌体,分别命名为HX1、MYY9、MYY16、TH15。首先,H X1和MYY9噬菌斑形态为圆形、清晰、透明;MYY16噬菌斑大小不一、形状不规则,边缘模糊中间清晰,透明度不及其他3株;TH15噬菌斑小但清晰、透明。第二,TEM观察显示:根据国际病毒分类委员会（Internatio nal Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）,TH15含有可收缩的尾部,属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,肌尾噬菌体科（Myoviridae）;其他三株含有不可收缩的短尾,属于有尾噬菌体目,短尾噬菌体科（Podovir idae）。裂解谱结果显示:HX1和MYY9最宽为87.10%,MYY16居中为70.97%,TH15最窄为58.06%。基因组测序和分析结果显示HX1和MYY9碱基序列具有高度一致性,达97.84%,两者均属于phi KMV-like噬菌体属,并与该属中其他成员高度相似。通过预测基因组中每个编码序列（coding sequences,CDS）的氨基酸产物分析结果显示:基因组中均未发现与抗生素耐药性、毒力因子编码基因或溶原性基因（如位点特异性整合酶或阻遏物）等不利于噬菌体疗法的序列。第三,体外细菌动力学实验结果表明M YY16对宿主菌的抑制作用弱于HX1和MYY9。具体来讲,即使在MOI（multiplicity of infections,感染复数）=0.000001情况下,HX1、MYY9也能有效地抑制PAO1的生长,相反,当MOI<1时,MYY16对PAO1没有明显的抑制作用。其次,HX1和MYY9均能有效抑制临床菌W19和F RD1的生长。最后,PAO1和W19用于构建小鼠急性肺炎模型,高产粘液型菌株FRD1用于小鼠慢性肺炎模型,噬菌体作用于以上两种感染模型,均能使肺部细菌CFU值下降,降低BALF中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α的合成和释放,减轻肺组织炎症应答和组织损伤。结论:本研究实验分离的铜绿假单胞菌烈性噬菌体在体内外均能很好地发挥其抗菌作用,降低感染的肺组织细菌定殖,减轻肺部炎症反应,对细菌感染有一定的治疗效果。

郭行^[2]（2020）在《鼠李糖乳杆菌LS-8中新型细菌素的挖掘及抑菌机制的研究》文中指出食品在生产、运输和贮藏过程中易受到微生物污染,导致各类安全事故频发。这些食源性致病菌会降低食品品质,甚至危及人类健康。通常解决这一问题的方法是使用化学防腐剂,但其副作用明显。因此,寻找更加安全可靠的生物来源的化学防腐剂替代品十分迫切和必要。细菌素是核糖体合成的一类具有抑菌能力的多肽,因其对有害微生物具有抑制作用而备受关注。细菌素可以减少食源性疾病传播的风险,延长产品的保质期。使用细菌素代替化学防腐剂对受体的不良影响较小,因为它们易于被蛋白酶水解,并且分解产物无毒无害。最重要的是,细菌素可通过多种方式杀死细菌,而不易使目标细菌产生耐药性。随着社会的发展,科技的进步,更多的新型细菌素将被发现。但传统的细菌素分离纯化方法耗时长,不确定性高。并且由于细菌素种类繁多,性质差异明显,因此并没有固定的纯化方式,使得获得细菌素的成本较高。所以新型细菌素的发现已从传统的活性筛选方式转变为基因组数据分析的方式,以消除遗漏的隐患,使科研人员可以更有效、更方便地大规模挖掘细菌素。四川泡菜是中国传统食品,特别是在川渝地区被广泛食用。本研究中所使用的鼠李糖乳杆菌LS-8是从中国传统四川泡菜中分离得到的,之前的研究确定了其胞外分泌蛋白具有良好的抑菌能力,因此将该菌株作为此次研究的重点。本试验通过将基因组和多肽组信息进行整合,在遗传水平上挖掘潜在的细菌素,并在大肠杆菌表达系统中进行异源表达。随后对选定的细菌素进行稳定性及抑菌机制的研究。具体研究内容和主要结果如下:（1）鼠李糖乳杆菌LS-8的生长在模拟口腔消化和胃消化的环境中受到抑制,在小肠消化环境中不受影响,说明该菌株对α-淀粉酶、酸性环境和胃蛋白酶敏感,但对胰蛋白酶和胆盐不敏感。通过硫酸铵饱和度和吸附解吸p H的优化得到抑菌蛋白最佳提取条件（90%饱和度的硫酸铵,吸附p H为5.85,解吸p H为1.95）,并制备蛋白粗样进行质谱检测。经过四个数据库的比对后共匹配到215个无重复的多肽序列,其中使用APD3（抗菌肽数据库）鉴定出25个多肽序列,有21个来源于硫酸铵沉淀法所得蛋白,4个来源于p H吸附解吸法。（2）提取鼠李糖乳杆菌LS-8的基因组DNA,并在Illumina Novaseq平台测序,通过对开放阅读框的功能注释,对蛋白、脂质和糖类水解及利用的分析,对物种进化的研究得出结论:鼠李糖乳杆菌LS-8基因组中有2835个蛋白编码基因,GO（Gene Ontology）注释显示50.04%的基因为三大分类中的生物过程分类,KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注释显示有96.86%的基因参与了代谢通路,但还有37.21%的蛋白编码基因未得到COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）功能注释。另外,鼠李糖乳杆菌LS-8可利用的营养物质广泛、细胞代谢活跃、环境适应力强。通过对鼠李糖乳杆菌物种进化情况分析可知,其基因组遗传稳定,突变重组的基因少,未发生大规模插入、缺失和倒位等现象。（3）通过anti SMASH和BAGEL4挖掘软件对鼠李糖乳杆菌LS-8基因组序列进行分析,发现了5个与细菌素相关的基因簇。随后将未标注功能的多肽序列与基因组比对,挖掘出16个潜在细菌素序列。使用Ex PASy对这些序列的理化性质进行预测,序列分子量从7840.41 Da到49323.06 Da不等。除p H4和S75外,其他序列稳定性良好。在使用Prot Scale预测序列亲疏水性时发现S81和S137具有强疏水性。而TMpred预测的穿膜结构显示S68,S81,S109和S137有较强的穿膜能力。所有序列中仅有四个序列存在信号肽。二级结构和三级结构预测到仅p H25中不含有α螺旋结构。S81和S137中BFP<0的比例最高,说明这两个序列的稳定性较好。（4）使用大肠杆菌BL21（DE3）表达系统对16个潜在细菌素序列进行异源表达并制备蛋白粗样。以大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌验证其中14个序列的表达蛋白具有抑菌活性,这些序列分别是p H4、p H23、p H25、p H35、p H45、S7、S58、S68、S75、S79、S81、S93、S109和S137。从中选择p H25、S68、S81和S137四个细菌素作为后期研究的重点,并对它们进行表达条件的优化,最终优化条件分别为0.6 mg/m L Kana,OD600=0.45,116.81μg/m L IPTG;0.8 mg/m L Kana,OD600=0.40,95.32μg/m L IPTG;0.6 mg/m L Kana,OD600=0.35,71.49μg/m L IPTG和0.6 mg/m L Kana,OD600=0.40,95.32μg/m L IPTG。通过对19种革兰氏阴性菌（G-）和10种革兰氏阳性菌（G+）的抑菌试验可知这四个序列具有广谱抑菌性,且对革兰氏阴性菌的效果好于革兰氏阳性菌。（5）通过透析、阳离子交换色谱法、反相高效液相色谱法对四个细菌素进行纯化,在液相谱图中收集有抑菌能力的单峰,并冻干浓缩后进行LC-MS/MS鉴定,从多肽片段覆盖度可知抑菌蛋白已成功克隆表达,并得到了较为完整且纯度较高的细菌素蛋白。纯化后四个细菌素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌的MIC范围是5.38到19.84μg/ml。傅里叶变换红外光谱显示四个细菌素均为含有不饱和键的蛋白质,其中p H25含有芳香环,S68具有芳基酮,S81的结构中出现了不饱和C=C双键,而S137存在炔烃结构。使用3×MIC的细菌素处理致病菌48 h内菌体无生长迹象,说明四个细菌素都具有强效抑菌甚至杀菌作用。另外,四个细菌素对于表达载体具有自我杀灭能力,其中p H25抑制表达载体生长的能力最差,S137最强。（6）四个细菌素（p H25、S68、S81和S137）对紫外照射及温度变化均不敏感。抑菌能力在酸性和中性条件下不会受到影响,在碱性条件下略有降低,其中S68的活性丧失最为明显。四个细菌素对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感。3%Na Cl和Fe2+会对p H25的抑菌能力存在影响。S81对Ca2+敏感,而Zn2+、Mn2+、甲醇、丙酮和SDS均会破坏四个细菌素的稳定性。Tween-20和Tween-40会降低p H25抑制金黄色葡萄球菌的能力,但正丁醇可增强p H25的抑菌效果。p H25对VC敏感,而VE会对S137的稳定性造成影响。S137在各种低温环境下都能展现良好的稳定性。根据稳定性试验结果,可将四个新型细菌素的整体稳定性进行排序:p H25

梁昊^[3]（2019）在《弯曲菌快速检测及基因组水平遗传特征分析》文中指出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌（Campylobacter jejuni and Campylobacter coli）属于嗜热微需氧的革兰氏阴性菌,定植于牛、羊、猪等家畜,鸡、鸭、火鸡等家禽以及乌鸦、鸽子等鸟类的肠道中,在家畜、家禽等相关食品和饮水中也广泛存在。弯曲菌是引发食源性及疾病常见的病原菌,感染后还可出现严重的并发症如格林-巴利综合征等自身免疫损伤相关的疾病。弯曲菌的不依赖分离培养的检测,可对引起腹泻、食物中毒的病原体进行快速的确认,可以有效的开展公共卫生应急工作,推动疾病防控的发展。目前国内外不依赖培养的检测主要是核酸检测和抗体检测为主,为获得核酸检测和分离培养的一致性和差异性,本研究对北京顺义食源性疾病主动监测网中的腹泻病人标本对分离培养结果和四重荧光定量PCR结果进行了比较。从全基因组水平上对空、结肠弯曲菌进行遗传学的研究,可以使我们更加清楚的了解该物种的致病、耐药、传播和进化等与疾病控制密切相关特征,更好的开展对该病原菌的控制和应急工作。此外,限制修饰系统对包括弯曲菌在内的多种病原菌DNA片段的水平转移有所影响,对弯曲菌的种群结构形成和进化有重要意义。本研究对采集于中国不同地区、不同宿主来源的139株空肠弯曲菌和77株结肠弯曲菌进行了全基因组测序,分析其基因组的多态性和种群结构,主要从以下几个方面进行分析:空、结肠弯曲菌基因组遗传多样性和遗传特征;空、结肠弯曲菌的系统发育特点、重组特征和种群结构;空、结肠弯曲菌限制修饰系统遗传特征及与种群结构的相关性。第一部分:空、结肠弯曲菌快速分子检测与分离培养比较分析弯曲菌是引起细菌性腹泻病最常见的病原之一。为了建立一种有效的、不依赖于分离培养的腹泻病人粪便中弯曲菌感染快速筛查,本研究对北京市食源性疾病主动监测网收集的190份腹泻患者粪便样品分别进行了四重荧光定量PCR法检测与基于滤膜法（被认为是最有效的分离方法）的分离培养。本研究中多重荧光定量PCR技术可对弯曲菌属、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌进行同时检测和鉴定。通过增菌后的滤膜法分离培养,共获得23株（12.1%,23/190）弯曲菌（20株空肠弯曲菌和3株结肠弯曲菌）,而荧光定量PCR检出阳性标本31份（16.3%,31/190）,其中21份空肠弯曲菌、8份结肠弯曲菌和2份仅仅显示弯曲菌属阳性的标本)。通过比较,结果显示荧光定量PCR方法比滤膜法更灵敏（16.3比12.1%,p=0.021）。在分离培养到菌株的样品中,PCR检测阳性率为95.7%（22/23）。Kappa一致性分析结果显示两种方法一致性较好（kappa=0.785,p<0.05）。与分离培养方法相比,多重荧光定量PCR方法的结果灵敏、快速。本研究表明,该多重荧光PCR可用于弯曲菌感染的监测,也可用于分离培养前对样品的筛选。本文首次对我国腹泻患者粪便标本中弯曲菌的培养和多重荧光定量PCR方法进行了比较研究,与过去研究相比,本研究中采用了多重荧光PCR的方法,使得检测更为快捷,且与分离培养方法一致性较好。第二部分空、结肠弯曲菌基因组水平遗传特征分析本研究对中国139株空肠弯曲菌和77株结肠弯曲菌在Illumina Hiseq进行了全基因组测序。将基因组通过SOAP denovo软件组装后,使用Mummer、Roary等分析软件和分析流程处理后,获得空肠弯曲菌检测到6294个泛基因、1011个核心基因、0～162个各菌株特异基因和112.917个SNPs;在结肠弯曲菌中,检测到6406个泛基因、1183个核心基因、0～175个各菌株特异基因和83.212个SNPs。基于SNPs的构建了空、结肠弯曲菌系统发育树。其中,空肠弯曲菌整个种群分为了 33个clade和20株无clade聚集的菌株,格林-巴利综合征患者来源菌株主要分布在4个种群中,与家畜来源的菌株有更近的遗传相似性。结肠弯曲菌有三个主要的clade,没有明显的来源和地域聚集。对空、结肠弯曲菌通过毒力基因数据库VFBD（the virulence factor database）在空、结肠弯曲菌中分别鉴定出51和50个保守的共有毒力基因,主要功能包括黏附、侵袭、毒素相关基因和鞭毛合成相关蛋白。而与细菌表面结构CPS和LOS相关的基因则表现出高多样性分布,可能与菌株对于环境的适应相关、不同的宿主。在空、结肠弯曲菌中均含有完整的Ⅳ型分泌系统和Ⅵ型分泌系统,含有Ⅳ型分泌系统的菌株较少分别只有1株和2株。在空肠弯曲菌中接近一半的菌株（44.6%）包含Ⅵ型分泌系统且分布有一定聚集性,主要分布在鸡来源谱系的菌株中,在家畜来源的菌株中极少携带该分泌系统;结肠弯曲菌中有32.4%的菌株含有Ⅵ型分泌系统。对弯曲菌泌系统的遗传学研究为了解弯曲菌的致病性、毒力和分泌机制提供了有效途径。通过将空、结肠弯曲菌基因组与耐药基因库CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）使用工具 the Resistance Gene Identifier（RGI）软件进行比对,获得了空、结肠弯曲菌的耐药谱分布,总共检测出7个大类17种耐药基因。耐药基因的分布还可能与菌株的生态位有关,空肠弯曲菌种oxa-184基因在禽类谱系中鸟类来源菌株中高度集中分布,同样在其他谱系中也有少量的发现,提示鸟类和禽类可能是弯曲菌重要的传播媒介;在空肠弯曲菌中氨基糖苷类、大环内酯类的耐药基因分布率显着高于空肠弯曲菌,导致了结肠弯曲菌种群的高耐药率。第三部分空、结肠弯曲菌限制修饰系统遗传特征及与种群结构的相关性为获得空、结肠弯曲菌的限制修饰系统的遗传特征和与种群结构的相关性,首先,本研究中通过 REBASE（the Restriction Enzyme Database）数据库,提取了所有基因组中的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制修饰系统相关的限制性内切酶基因和甲基化酶基因。然后,通过各种限制修饰系统在种群中的分布获得其遗传特点。本研究中从三个方面来评估各修饰系统对种群结构的影响:重组分布的差异、附属基因组、特异基因的差异和附属基因组中外源性基因的差异。关于基因的内外源性,我们是通过核心基因组的GC含量来确定一个参考值范围做外定义。分析的结果显示,空肠弯曲菌的绝大部分系统发育同一分支内菌株的限制修饰系统组合模式高度保守且不同分支菌株的限制修饰系统之间显示出高度的相异性,此外,通过对附属基因、重组和外源性基因获得方面的分析结果,提示空肠弯曲菌种群结构的形成与限制修饰系统呈现出高度的相关性:空肠弯曲菌的多克隆化高多样性的种群结构特征可能与限制修饰系统的高多样性相关。在限制修饰系统对于菌株的限制和修饰作用方面,基因组之间的差异分析结果显示Ⅰ型限制修饰系统呈现出更多的“限制性”,非己的DNA基因片段更容易被切掉,而Ⅲ型限制修饰系统呈现出更多的“修饰性”,对于重组片段可能有更大的包容。结肠弯曲菌的限制修饰系统在整个物种内都比较保守,没有很高的多样性,可能与结肠弯曲菌高克隆化低多样性的种群结构特征相关。

岂晓鑫^[4]（2018）在《1950-2009年动物源沙门菌的分型、耐药性及致病性研究》文中进行了进一步梳理沙门菌（Salmonella）是全球范围内常见的食源性致病菌,可广泛感染哺乳类、鸟类、爬行动物、两栖动物等。人类可由多种途径感染,其中通过畜禽产品是最主要的感染途径。沙门菌分型复杂,目前仅根据血清型方法可初步分为近2600种血清型,但由于分型血清价格较高、影响分型试验的因素多,其应用于揭示病原菌之间关系时存在较大缺陷。随着分子生物学发展,将血清分型与分子分型相结合可极大提高对沙门菌分型的准确性。随着抗菌药物的应用,在抗生素的选择压力下,沙门菌耐药菌株不断增多,超级耐药菌株的发现更给公共卫生提出了新的挑战。本文研究了我国1950～2009年间60株动物源沙门菌分离株的血清型、MLST分型分布情况,并对样品进行了耐药性检测和致病性研究,建立了相应的基础数据库,为沙门菌的检测、追踪溯源和防控提供基本信息。（1）本研究中60株动物源沙门菌,其中鸡源分离株33株（55%）,猪源分离株25株（41.67%）,马源分离株2株（3.33%）;血清型分型共分为7个血清型,其中猪霍乱沙门菌（Salmonella choleraesuis）、肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis）和鸡白痢沙门菌（SalmonellaPullorum）三种血清型分离率位于前三位,分别占总菌株数的31.67%（19/60）、26.67%（16/60）和21.67%（13/60）,其余鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）、马流产沙门菌（Salmonella Abortusequi）、田纳西沙门菌（Salmonella Tennessensis）和印第安纳沙门菌（Salmonella Indiana）分别为 10%（6/60）、3.33%（2/60）、3.33%（2/60）和 3.33%（2/60）。血清型具有明显的时代特征,1950-1969年猪作为畜牧业中主要的养殖动物所受重视程度较高,分离的沙门菌血清型以猪霍乱沙门菌为主（12/20）,而鼠伤寒沙门菌（2/20）、鸡白痢沙门菌（4/20）和肠炎沙门菌（2/20）均有分离;1970-1989年分离的沙门菌血清型猪霍乱沙门菌（7/20）与鸡白痢沙门菌（7/20）比例相同,除鼠伤寒沙门菌（4/20）外,还分离到了马流产沙门菌（2/20）;1990-2009年我国畜禽养殖出现了集约化养殖的趋势,分离的沙门菌绝大多数是禽源沙门菌,血清型主要是肠炎沙门菌（14/20）,此外还分离到田纳西沙门菌（2/20）和印第安纳沙门菌（2/20）。MLST分型共有9个ST型,ST68、ST11、ST92所占比例较高,分别为30%（18/60）,26.67%（16/60）和15%（9/60）,其余各菌株ST 型所占比例为 ST19:10%（6/60）、ST132:6.67%（4/60）、ST17、ST251和 ST319 均为3.33%（2/60）、ST139:1.67%（1/60）。MLST分型结果与血清型分型结果对应性良好,ST11为肠炎沙门菌、ST17为印弟安那沙门菌、ST92和ST132为鸡白痢沙门菌、ST319为田纳西沙门菌、ST68和ST139为猪霍乱沙门菌、ST19为鼠伤寒沙门菌、ST251为马流产沙门菌。此外试验结果显示MLST分型能力要略高于血清学分型方法,可以一定程度的区分分离株,在同一血清型内不同分离株间进一步分析其系统进化和亲缘关系。（2）本研究中沙门菌样本对氨苄西林（AM）、多西环素（DOX）、四环素（TE）和磺胺异恶唑（SF）药敏试验结果呈现双峰式分布,耐药菌株与敏感菌株MIC分布相对集中;超过30%的菌株对多黏菌素（CL）低敏,所有菌株对美罗培南（MEM）高敏。由于阿莫西林/克拉维酸（A/C）、庆大霉素（GM）、大观霉素（SPF）、氧氟沙星（OFL）、恩诺沙星（ENR）和复方新诺明（SXT）这6种抗生素的抑菌效果较好,其耐药菌株比例均小于5%,头孢噻呋（CEF）、氟苯尼考（FFC）和头孢他啶（CAZ）的抑菌效果稍弱,分别有11.67%、8.33%和6.67%的菌株对其耐药。按照菌株分离时间统计,1950-1959年间分离的沙门菌对药物敏感性很高,仅有1株细菌对DOX处于中介值,其余菌株对15种抗生素均敏感;1960-1969年间菌株对CAZ、GM、SPF和CL敏感的菌株有所减少,有4株菌株对SPF处于中介值,有2株分离株对CL耐药;1970-1989年间分离的沙门菌对DOX、GM、SPF和CL均有耐药菌株的产生,总体上处于中介值以上的菌株数量上与60年代差别不大;1990-1999年间,沙门菌耐药性突然增强,超过50%的菌株对AM、TE、SF和CL产生了耐药性,60%的菌株对ENR的药敏性处于中介值;2000-2009年间分离的沙门菌株中,超过了 50%的菌株对AM、SF、TE、DOX、CL和CEF产生耐药性,并且对除美罗培南外的14种抗生素均有耐药菌株的产生。本研究中有23株沙门菌对抗生素耐药,其中5株沙门菌仅对1种抗生素产生耐药性;18株沙门菌对2种及以上抗生素产生耐药性;4重、5重耐药菌株所占比例较大,分别有9株（50%）、6株（33.33%）。对抗生素耐药谱分析共有12个耐药谱,其中AM-TE-DOX-SF为主导耐药谱,所占比例为22.22%,50%的沙门菌仅有1种耐药谱。根据菌株分离时间分析其耐药谱,1990年代主导耐药谱为AM-TE-SF-CL和AM-TE-DOX-SF,2000年代主导耐药谱为AM-TE-DOX-SF-CL,其次为AM-TE-DOX-SF。综合分析各耐药谱发现,共有12株沙门菌含有AM-TE-SF耐药组合,占所有多重耐药菌株的66.67%,该组合应已成为一个固定耐药谱。本研究针对磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和喹诺酮类的耐药基因分别应用14对引物进行检测,其中sul2、blaTEM和tet（A）等3种耐药基因检出量较高,分别占被检样品的76.19%、71.43%和61.90%,aac（6）-1b和floR占23.81%,aacC4和t t（G）占 19.05%,blaOX4 占 14.29%,blaCMY、blaPSE、blaSHV、catA1、qnrA 和qnrB等6种基因未被检出,耐11种以上的两种耐药菌均检出携带有blaOXA、aacC4、aac（6）-1b、floR和tet（A）,此基因组合可能是其成为超级耐药克隆的主要原因。（3）本研究中选用ICR小鼠作为实验动物,建立统一的动物模型,可快速对不同动物源的沙门菌致病性进行比对。根据研究结果,60株沙门菌对ICR小鼠ID50的致病菌量主要集中于107CFU,占总菌株的41.67%,1960-1989年分离菌株ID50致病菌量集中在108CFU,占该时间段分离菌株的50%,2000-2009年间分离的沙门菌毒力最强,ID50中位数为1.41×107,1960-1969年分离的沙门菌毒力最弱,中位数为12.28×107,比较各年代沙门菌菌株间标准差发现其波动幅度较大,表明不同年代菌株间致病性差异明显。研究不同血清型沙门菌的致病性发现,印第安纳沙门菌致病最强,ID50为106CFU,其次为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,ID50为107CFU,猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌、马流产沙门菌和田纳西沙门菌ID50为108CFU。相同血清型不同菌株比较,鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、田纳西沙门菌和印第安纳沙门菌各菌株ID50相近,猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌和马流产沙门菌差异显着;分析沙门菌ST型与致病性关系,ST139致病性最强,ID50为4.4×106 CFU,其次为 ST17 菌株,ID50 菌量为 9×106CFU,ST19、ST11 和 ST92 菌株.ID50 菌量为 107CFU,ST68、ST132、ST251 和 ST319 的 ID50 菌量为 108CFU。比较各 ST 型菌株致病性标准差,ST19、ST11、ST132、ST17和ST319 5种ST型菌株标准差均小于5,菌株间致病性差异不显着,ST68、ST92和ST251标准差约等于10,差异显着。以上结果表明致病性与血清型/ST型存在相互对应关系,血清型/ST型不同,致病性也有差异,同型菌株间的差异程度与致病性强弱无关,仅与型特异性相关。本研究中共22株沙门菌具有耐药性,其中1株超级耐药菌（耐药种类12种）致病性最强,ID50为7×105CFU,其他多重耐药菌株（耐药种类>2）ID50的Med均在107 CFU,1株双重耐药的菌株ID50为1.2×109 CFU,其余仅对一种抗生素有耐药的菌株的ID50为108CFU。基于本研究,我们推断沙门菌耐药性增强能够促进其致病性。结论:（1）研究中60株动物源致病性沙门菌共有7个血清型9个ST型,血清学分型结果与MLST分型结果进行对应比较,大多ST型均可与血清型有比较固定的对应关系,沙门菌分型结果与分离年代有明显相关性。（2）样本中对AM、TE、DOX、SF和CL等五种抗生素产生耐药性的菌株分离率较高,形成一个AM-TE-SF耐药谱（分离率为66.67%）。耐药基因检测方面,blaTEM、sul2和tet（A）等3种耐药基因检出量较高。（3）沙门菌致病性为型特异性特征,仅与沙门菌的血清型/ST型相关。耐药性与致病性关系有待进一步研究证实。

潘军航^[5]（2015）在《浙江沿海创伤弧菌的分布特征及其种群结构研究》文中提出创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种存在于海产品中的革兰氏阴性嗜盐性细菌,如虾、鱼、牡蛎和蛤蜊等,它广泛布于全球河口、海洋和沿海环境中。该菌于1976年在美国首次确认,是美国因食用海产品而致死病例的首要病因,每年有40多个报告的死亡病例。世界范围内许多沿海国家都报道了因创伤弧菌感染而导致急性肠胃炎、原发性败血症,或经伤口感染引起的蜂窝组织炎等,严重的需要截肢甚至死亡。浙江省是我国该类病例报道最早,发生最多的地区。创伤弧菌引起的感染事件多发生于气温较高的月份里,一般认为是因食用或处理污染了创伤弧菌的海产品而引起的。浙江沿海盛产各类海产品,且当地居民素有生食或半生食海产品的习惯,该机会致病菌对于患有肝炎、肝硬化、高血压、免疫抑制等免疫力低下或缺陷的人群具有潜在的公共健康威胁。本研究通过对市售海水产品中创伤弧菌的污染情况的监测,对创伤弧菌感染临床分离株的检测及其分子特征的分析,研究不同来源创伤弧菌的毒力特征及其分子遗传关系,解析浙江地区创伤弧菌的污染情况,为食品安全风险评估以及监测预警和分子溯源提供了数据。获得的主要研究结果如下：（1）通过对舟山、杭州等市售海产品中创伤弧菌的污染情况监测,发现创伤弧菌的污染情况比较严重,在夏季海产品中创伤弧菌的阳性检出率和污染浓度是最高的,其中毛蚶、虾和牡蛎中的阳性率较高。分离的菌株存在遗传多样性,分离到了生物1型和生物2型的菌株。其基因型分布广泛,vcg C-16S rRNA B型是主要型别,提示具有致病潜力。药敏结果显示分离菌株对多数抗生素均敏感,但对氨基糖苷类和头孢类部分抗生素显示出耐药性。（2）通过对食源性疾病病例的监测开展创伤弧菌的筛查,检出3株胃肠道感染的创伤弧菌,均为生物1型和vcg C-16S rRNA B基因型,药敏结果显示均对妥布霉素具有耐药性。同时监测发现存在创伤弧菌与副溶血性弧菌共同感染的情况。（3）从伤口感染创伤弧菌的一病例中分离出一株新MLST型菌株,命名为ST136型,为生物1型和vcg C-16S rRNA B基因型,药敏结果显示其对头孢唑啉和头孢替坦中度耐性。（4）通过MLVA、MLST和PFGE等不同分子分型方法对不同来源的创伤弧菌开展了分子分型比对分析,结果表明各种分子分型方法间各有优劣。PFGE是分子分型的金标准,但创伤弧菌试验中存在DNA降解的情况。在Not Ⅰ酶切条件下Simpson分辨指数D值为1,在Sfi Ⅰ酶切条件下D值为0.998。同时结果表明PFGE优先采用Sfi Ⅰ酶切方法,Not Ⅰ作为备选酶切选项,同时结合分离菌株的相关流行病学信息,可作为研究创伤弧菌感染和传播途径有力工具。MLVA分子分型的D值为0.994,显示出良好的分型效果,可用于流行性病学的调查和溯源分析。MLST分型的D值为0.983,可用于创伤弧菌种群结构和遗传关系的研究。（5）通过对我国北京、上海、广东、浙江和福建等地区虾中分离和临床分离的61株创伤弧菌开展MLST分析,获得了46个新ST型,显示出丰富的遗传多样性,同时也解析了其种群结构、系统发生和菌株间的遗传关系。综上所述,浙江省相关市售海水产品中创伤弧菌污染情况较严重,且毒力基因型菌株占到了多数。尽管直接导致的相关病例相对较少,但这不能排除因菌株间基因重组而产生新的强毒力菌株的可能,本文的研究结果将为我们更好地了解和预防创伤弧菌可能导致的感染奠定了坚实的基础。

韩海红^[6]（2015）在《生食贝类中副溶血性弧菌污染水平调查、定量风险评估和分离菌株特征分析》文中研究说明副溶血性弧菌是世界范围内与海产品消费相关的重要致病菌,由其引起的典型疾病是胃肠炎。中国的数据显示,副溶血性弧菌是引起细菌性食源性疾病的首要病原体。由于贝类的滤食作用,贝类中可富集大量的副溶血性弧菌,从而带来食源性感染风险。本研究调查了中国六个省份生食贝类中副溶血性弧菌的定量污染数据；基于定量数据,建立了从养殖场到餐桌全过程中副溶血性弧菌在生食贝类中消长规律的数学模型,结合剂量-反应关系,描述因生食贝类而摄入致病性副溶血性弧菌的致病概率及发病人数；针对副溶血性弧菌分离株,分析其生化、基因、耐药和分子分型特征。一、生食贝类中副溶血性弧菌污染水平总副溶血性弧菌的阳性率和污染水平分别是70.6%和44.6MPN/g。总副溶血性弧菌的污染水平从北向南有明显的地区趋势,辽宁最低,从低到高依次为山东、福建、浙江、四川,最高的为广西。总副溶血性弧菌的污染水平有明显季节趋势,以夏秋季最高。总副溶血性弧菌的污染水平在牡蛎和毛蚶间无显着性差异。在三个采样环节中,养殖场的污染水平最高,零售市场次之,餐饮市场最低,差异有显着性。25.1%的餐饮市场的总副溶血性弧菌污染水平超过了《GB 29921》中针对水产制品的副溶血性弧菌限量值1,000MPN/g。致病性副溶血性弧菌的阳性率和污染水平分别是26.7%和0.5MPN/g。致病性副溶血性弧菌阳性样品的污染水平呈现出明显的地区和季节趋势。致病性副溶血性弧菌地区趋势与总副溶血性弧菌相反,辽宁最高,广西最低。致病性副溶血性弧菌阳性样品的污染水平以夏季最高、冬季次之,最低为春季。毛蚶的致病性副溶血性弧菌阳性样品的污染水平高于牡蛎。在三个采样环节中,致病性副溶血性弧菌的污染水平为餐饮市场最高,零售市场次之,养殖场最低。二、生食贝类中副溶血性弧菌风险评估本研究以养殖阶段副溶血性弧菌的实际污染数据为起点,进行了冷链评估和常温评估。本研究评估了贝类经冷链流通后的副溶血性弧菌生食风险。冷链评估的结果显示：家庭食用时副溶血性弧菌的污染水平高于养殖阶段；每餐食用风险广西最低,为2.36×10-5,其它三地均为10.4；结合四地的人口学数据,每年食用风险广西最低,每年平均有323人发病,山东最高,每年平均有4942人发病。符合标准《GB 29921》限量要求的四地每餐食用风险均为10-6,每年食用风险均少于100人,标准保护水平均为87%以上。常温评估结果显示：常温流通后,家庭食用时的副溶血性弧菌污染水平高于冷链评估；每餐食用风险高于冷链评估；每年食用风险高于冷链评估。常温评估的标准保护水平均为98%以上。冷链评估南海广西的每餐食用风险的敏感性分析发现了8个风险因素,按照相关性从大到小依次排列为气温>牡蛎消费克数>冷却时间>运输时间>初始污染水平（Cp）>生食概率>致病性VP阳性率>总VP阳性率。南海广西的初始污染水平位列风险因素的第5位,相关系数为0.21,而致病性VP阳性率和总VP阳性率与每餐食用风险的相关性仅为0.02和0.01。三、副溶血性弧菌分离菌株特征分析利用API 20E和VITEK 2 GN两个生化鉴定系统进行副溶血性弧菌的生化试验,结果显示：临床株和环境株有显着性差异的四项生化是dSOR、SUCT、AMY和1LATk.八项共同生化项目中,有三项结果一致,分别是ONPG/BGAL、H2S和SAC；其余五项生化结果不一致,其中GLU/OFF、CIT和LDC等三项生化有显着性差异。菌株OMP基因阳性率为100%。其中临床株tdh阳性率为89.25%,trh基因均为阴性；88株环境株中有1株tdh阳性、1株trh阳性。临床株T3SS2阳性率为98.92%,环境株有1株阳性。临床株PGS阳性率为96.77%,环境株为67.05%。ERIC结果显示：临床株阳性率为88.17%,高于环境株的10.23%。9株环境株SXT阳性。副溶血性弧菌对八种抗生素的耐药谱大致相同,多数菌株表现为对氨苄西林耐药及中介。其氨苄西林MIC值的几何均数大于耐药标准。四株菌表现为多重耐药／中介,出现了复方新诺明耐药、庆大霉素中介、四环素中介等表型。相比PFGE, ERIC-PCR和REP-PCR的优点是更加快速便捷,适合用于大量菌株的分型分析。本研究结果显示,ERIC-PCR和REP-PCR都具有一定的分型能力,能够用于副溶血性弧菌的分子分型。ERIC-PCR的扩增条带更多,而分型的群数较少；REP-PCR的扩增条带数量较少,而分型能力更强。来自不同样品种类、采样环节和采样地点的菌株经两种方法分型后都有较高的相似系数,说明副溶血性弧菌在环境中存在优势污染菌株。

王瑞莲^[7]（2014）在《广州市海珠区感染性腹泻的病原学分析》文中进行了进一步梳理感染性腹泻是一种由病原微生物引起的,以腹泻为主要表现的胃肠炎症候群,其中病原微生物主要由细菌、病毒与寄生虫等微生物组成。在我国39种法定传染病中,腹泻发病率高居首位。夏秋季是腹泻的高发季节,但中国南方广州由于温暖潮湿的气候特征,冬春季腹泻病也很常见,而完整的病原谱调查并不多见。作为感染性腹泻病原谱监测平台的哨点医院之一,我们建立了腹泻病原谱监测的技术平台,采用了多种先进的检测技术,如质谱技术鉴定细菌、胶体金免疫层析技术检测轮状病毒抗原和腺病毒抗原以及实时荧光定量PCR技术检测诺如病毒等。本研究通过检测广州市海珠区冬春季腹泻的病原菌及病毒的基因型,以及时了解该地区感染性腹泻的病原谱特征。此外,我们对一些逐渐变得重要的、临床上尚未引起足够重视的病原进行了深入研究,包括：弯曲菌感染患者粪便常规结果的分析、气单胞菌属的进一步鉴定和药敏试验以及病毒的基因分析等等。在进行前一部分研究工作时,我们发现部分严重的腹泻患者一直未找到病源,综合分析其临床资料和查阅有关腹泻的最新进展,怀疑部分患者可能感染了艰难梭菌,因此开展了酶联免疫荧光技术检测艰难梭菌A&B毒素的相关工作,综合分析艰难梭菌A&B毒素阳性患者的临床资料,了解艰难梭菌在腹泻患者中的感染情况,为临床诊治和预防提供依据。本研究分为以下两个章节：第一章广州市海珠区冬春季感染性腹泻的病原学分析南方医科大学珠江医院作为腹泻症候群监测的哨点医院之一,我们收集2012年11月到2013年5月来院就诊的腹泻患者的粪便,通过问卷调查和查阅病历的方式了解病人的基本信息、临床信息以及标本采集情况等,共收集标本290例,其中70例住院和220例门诊,年龄中位数为25个月。按照传染病监测技术平台的要求,监测范围包括细菌病原谱和病毒病原谱。首先,对符合要求的腹泻粪便标本按照腹泻监测平台的要求进行病原菌培养、粪便常规的检查和隐血试验、免疫层析方法检测轮状病毒抗原和腺病毒抗原,同时用冻存管保存5g或5m1左右的粪便于-80℃冰箱；其次,综合分析各平板的菌落情况,挑取多个可疑菌落利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行鉴定；最后,根据鉴定结果,用血清学试验加以确证；气单胞菌属则用其他辅助试验鉴定到种；对-80℃冰箱保存的标本统一用实时荧光PCR进行诺如病毒的检测,并提取病毒阳性标本的核酸利用测序的方法进行基因分型。从腹泻人群分析,以发育情况为标准分为6个年龄组,即婴儿期组、幼儿期组、童年期组、青春期组、成年期组以及老年期组,其中婴儿期组的腹泻人群在所有腹泻人群中所占比重最高而青春期组最低。从腹泻的病原谱分析,腹泻病原总阳性率54.48%（158/290）,其中细菌总阳性率为20.67%（60/290）病毒总阳性率36.90%（107/290）,混合感染阳性率7.59%（22/290）。病毒总阳性率明显高于细菌总阳性率,各种类型混合感染的阳性率和粪便常规检查结果均没有显着差异。在所检出的病原菌中,沙门菌44.78%（30/67）的构成比居首位,其次为弯曲菌属28.36%（19/67）和气单胞菌属14.93%（10/67）,未检测到霍乱弧菌、副溶血性弧菌以及拟态弧菌；在所检出的病毒中,轮状病毒构成比54.86%（62/113）；其次为诺如病毒39.82%（45/113）,其中以诺如病毒II更常见；最后为肠道腺病毒4.42%（5/113）。从年龄的角度分析,未成年人细菌的阳性率高于成年人,其中未成年人弯曲菌阳性率明显高于成年人；但未成年人病毒感染的阳性率与成年人之间没有显着差异。从性别的角度分析,男性患者病毒的阳性率高于女性；但男性患者细菌的阳性率与女性之间没有显着差异。从月份的角度分析,细菌阳性率最高在4月份,最低在1月份；病毒阳性率最高在1月份,最低在5月份。对本次病原谱排列前三的病原进一步的分析显示：对于细菌而言,首先对沙门菌,增加了血清学试验和药物敏感试验,结果显示目前引起腹泻28例是A群沙门菌,2例为B群沙门菌,尚未发现其他菌群的沙门菌。28株复苏成功的沙门菌药物敏感试验结果显示,28株沙门菌对2种抗生素完全耐药,占总的抗生素的8.70%；对12种抗生素部分耐药,占52.17%；剩余的9种抗生素完全敏感,占39.13%；28株沙门菌全存在多重耐药的情况；对于弯曲菌,详细分析了弯曲菌感染患者的临床特征,结果显示弯曲菌感染所引起的腹泻粪便中红细胞、白细胞以及隐血试验等三个项目的阳性率明显高于其它细菌引起的腹泻,主要原因是该细菌本身培养的特殊性,较容易被忽略以致于患者未能得到及时有效的治疗所致。10例气单胞菌属结合辅助试验鉴定到种,分别为4株温和气单胞菌,2株嗜水气单胞菌、4株豚鼠气单胞菌,药物敏感试验显示在21种抗生素中,10株气单胞菌对3种抗生素完全耐药,占14.29%：对6种抗生素部分耐药,占28.57%；剩余12种抗生素完全敏感,占41.86%；10株气单胞菌也都存在多重耐药的情况。对于病毒而言,G1P8型轮状病毒是本研究地区的优势株,与G9P8、G2P4和G3P8共占轮状病毒阳性标本的91.94%,其中国内尚未报道G9P4型；GII.4型诺如病毒是最常见的流行株,还发现GI.1、GI.3、GI.4、 GI.6、GI.2、GII.14、GII.G-12型共7种其它基因型,其中国内尚未报道GI.6、GII.g-12型。第二章艰难梭菌在腹泻患者中感染情况的调查从2013年7月到2013年12月,通过问卷调查和查阅病历的方式了解病人的基本信息、临床信息等情况,共收集来院就诊腹泻患者标本137例,其中94例住院和43例门诊；男性84例,女性53例；年龄最大的是85岁,最小的是11天,年龄中位数22岁。当发生腹泻时,首先考虑是常见的病原菌引起的。根据第一章的研究结果显示沙门菌是本次腹泻监测最常见的病原菌,同时该菌因其检测方法简单而能在普通实验室常规开展,故在进行艰难梭菌感染监测之前首先对所有检测的标本先进行沙门菌的筛查。排除沙门菌感染的临床病例,利用酶联荧光免疫分析技术对剩余的标本进行艰难梭菌A&B毒素的检测,结果为8例阳性,对这8例艰难梭菌A&B毒素检测阳性的标本利用加热富集芽孢的方法进行艰难梭菌培养,方法如下：在70℃温浴30分钟后离心,取沉渣接种于厌氧平板后放入装有厌氧产气剂的厌氧袋培养,48小时后进行观察,将培养结果与艰难梭菌A&B毒素的结果进行比较。在收集137例标本中,其中66例儿童,46例青年和25例老人。经筛查,7例为沙门菌阳性。排除7例检出沙门菌的标本,对剩余的130例粪便标本利用酶联荧光免疫分析技术检测艰难梭菌A&B毒素,共检出8例阳性,阳性率为6.15%。8例阳性标本的临床资料分析显示,2例来自消化科,2例来自血液科,2例来自儿科门诊,1例来自肾内科还有1例来自器官移植,科室分布较分散。阳性病例按年龄段分布为儿童3例、中青年3例、老年人2例,以上三组人群的阳性率粪便粪便为4.76%,6.82%和8.70%,经过统计学分析,三类人群的阳性率无显着性差异。对这8例标本的培养结果显示,8例毒素阳性的标本中,6例培养出艰难梭菌,2例未检测到艰难梭菌；8例中有6例的结果一致,酶联免疫荧光法和培养的比对结果良好,进一步体会了艰难梭菌进行厌氧培养对技术和人员等的高标准高要求。相比之下,酶联免疫荧光法更适合临床常规开展。小结根据以上两章节研究结果,小结如下：1、从腹泻的病原谱分析。病原总阳性率和细菌阳性率高于国内的相关报道,其可能原因是本研究采用了先进的质谱鉴定技术；病毒的阳性率高于细菌的阳性率。在所检出的细菌中,前三位分别为沙门菌、弯曲菌和气单胞菌；在所检出病毒中,前三位分别为轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒。2、从腹泻的流行病学分析。针对易感人群,婴儿期组腹泻人群所占比重最大,青春期组则最低。针对性别而言,男性的病毒阳性率高于女性,但细菌阳性率没有显着差异；针对年龄而言,未成年组的细菌阳性率高于成年组而病毒阳性率没有显着差异；针对月份而言,细菌阳性率最高在4月份最低在1月份而病毒阳性率最高在1月份最低在5月份。3、细菌病原谱的新特点。第一、人兽共患病原菌——弯曲菌在未成年组中的阳性率比成年组较高,弯曲菌腹泻患者的粪便常规结果较其他类型腹泻患者严重,建议腹泻未成年人中常规开展弯曲菌的检测工作。第二、人兽共患病原菌——气单胞菌引起的腹泻位居第三位,在感染写腹泻病原菌中处于主要的病原菌,但因所引起的临床症状不严重,较容易被忽视。4、病毒病原谱的新特点。对于轮状病毒而言,G1P8、G9P8、G2P4和G3P8共占轮状病毒阳性标本的91.94%,并发现了国内尚未报道的G9P4型；对于诺如病毒而言,GII.4型诺如病毒是最常见的流行株,还发现7种其它基因型,其中国内尚未报道GI.6、GII.g-12型。5、药物敏感试验的新变化。第一、本次所检测的28株沙门菌和10株气单胞菌全部出现多重耐药。第二、两种细菌对碳青霉烯类、头孢四代、喹诺酮类以及氨基糖苷类所代表的抗生素均完全敏感。第三、沙门菌的耐药情况比气单胞菌严峻。6、艰难梭菌感染易感人群发生的变化。在重点关注住院患者时也要重视社区门诊患者；在关注老年人群时不能忽略儿童艰难梭菌感染相关性腹泻的监测；艰难梭菌感染引起的腹泻患者来自医院多个不同科室,提示艰难梭菌感染可以发生于各种不同疾病不同人群。7、艰难梭菌感染新的检测技术。与培养的方法相比,酶联免疫荧光技术检测艰难梭菌A和（或）B毒素简单、快速、敏感性较高,更适合对腹泻患者进行艰难梭菌感染的筛查。

胡婧^[8]（2013）在《Rep-PCR对牛舍环境中产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌溯源的研究》文中研究说明各种细菌性疾病对畜牧业的发展十分有害，致病性细菌是动物舍环境污染的主要因素之一。产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌为牛舍环境中的主要致病菌，这两种细菌分布较广，且易产生耐药性。Rep-PCR基因指纹图谱微生物源追踪技术具有分辨力高、稳定性好、简便快速、易于解释等优点。本研究通过Rep-PCR方法，来分析牛舍环境中不同来源的产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的同源性，为控制与干预产毒素大肠杆菌和沙门氏菌提供依据，也为建立牛场养殖环境的监测管理体系提供理论基础。首先采取黑龙江省4个牛场12个牛舍的空气、饮用水、饲料、垫土和粪便样品共976份，对采集的样品进行大肠杆菌和沙门氏菌的分离培养，用PCR方法鉴定产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌，阳性分离株做药物敏感试验。其次将阳性分离株进行Rep-PCR扩增，形成DNA指纹图谱，鉴定不同采样点的产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌遗传相似性。同时对牛舍中病死牛和牛腹泻事件中分离的产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌进行耐药性检测和溯源分析，确定其来源。结果显示976份样品中分离出153株产肠毒素大肠杆菌和42株沙门氏菌，检出率分别为15.7%和4.3%。所有产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌对利福平、克林霉素、阿莫西林完全耐药。产肠毒素大肠杆菌的高度敏感药物为氯霉素、氟哌酸、卡那霉素、依诺沙星、氧氟沙星，沙门氏菌的高度敏感药物为氟哌酸、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、壮观霉素、依诺沙星、氧氟沙星和头孢吡肟。Rep-PCR结果显示，牛舍空气中分离到的部分产肠毒素大肠杆菌与牛舍粪便分离的相似性可达90%以上；水中的分离株与来自空气、粪便和垫土中的相似性可达90%以上；饲料中的分离株与空气、粪便和垫土中的相似性可达90%以上；垫土中分离的产肠毒素大肠杆菌与空气、粪便分离的相似性可达90%以上。Rep-PCR结果显示，牛舍空气中分离到的部分沙门氏菌与牛舍粪便分离的相似性可达90%以上；牛舍水中的分离株与空气、饲料和粪便中的相似性可达90%以上；牛舍饲料中分离的沙门氏菌与空气和垫土中分离的相似性可达90%以上。从牛舍病死牛和牛腹泻事件中分离了3株产肠毒素大肠杆菌和1株沙门氏菌，3株产肠毒素大肠杆菌对红霉素、青霉素、利福平、克林霉素、阿莫西林完全耐药；1株沙门氏菌对四环素、红霉素、青霉素、利福平、庆大霉素、克林霉素、阿莫西林均完全耐药。Rep-PCR结果显示，1株产肠毒素大肠杆菌来源不确定，另两株分别来自水和垫土，沙门氏菌来源于饲料。综上所述，Rep-PCR方法对菌株有较好的判别结果，可作为研究产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌来源和传播途径的有力工具，为牛舍环境微生物溯源体系的建立提供了可行的方法。

王芳^[9]（2011）在《副溶血性弧菌分离株毒力相关基因分布特征及脉冲场凝胶电泳分型》文中指出副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐菌,是我国沿海地区引发食源性疾病的重要病原菌,能引起散发性和地方流行性的胃肠炎暴发。副溶血性弧菌在我国沿海地区和部分内陆地区引发食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势,已高居微生物性食物中毒首位。致病性副溶血弧菌能够产生耐热性直接溶血素（TDH）、TDH相关溶血素（TRH）,或两者均产生。该菌不仅通过海产品而且通过淡水产品及其他食物进行流行传播。尽管目前该菌的致病机理还不清楚,但是一些公认的与毒力相关的基因已被证实。且由于传统的生化分型和血清学分型不能有效的进行同源性分析,而基于DNA结构研究的PFGE方法在微生物鉴定中具有很好的分型力、分辨力、可重复性、可比性、灵敏性。因此本研究系统地调查了中国大陆的副溶血性弧菌,特别是高致病性菌株毒力相关基因的分布情况,并对分离株的耐药谱特征进行分析；同时应用脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）对不同来源的副溶血性弧菌分离株进行分子分型研究,以了解中国大陆副溶血性弧菌分离株的PFGE遗传谱系分布以及菌株间的同源性,并结合毒力相关基因的结果,分析分离株的毒力特征,以期为制定防治副溶血性弧菌导致食源性疾病策略提供预警、监测和控制依据。研究中,首先对2008～2010年分离自上海、浙江、福建、广东、江苏的233株副溶血性弧菌分离株进行毒力相关基因的检测,结果显示：223株分离株中,致病株（tdh+或trh+）有118株,占总菌数的52.9%,其中tdh基因携带率为48.9%,trh携带率为4.0%；高致病性菌株（tdh+和toxRS/new+）94株,占总菌数的42.2%；orf8、MTase.HU-α和VP2905在所有菌株中的概率分别为42.6%、43.0%、41.7%和43.0%。临床分离株中检出高致病株和致病株的概率要显着高于食品分离株。在94株高致病株中,orf8、MTase.HU-α和VP2905的阳性率分别为97.8%、97.8%、96.8%和96.8%,表明orf8、MTase.HU-α和VP2905可作为高致病株的独特基因。对来自江苏、浙江和上海的177份人源株和139株食源株的耐药性分析显示,在7种抗生素中,对氨苄青霉素（AM）、链霉素（SM）和卡那霉素（KM）的耐药率分别为57%、40.5%和25.3%,而对诺氟沙星（NOR）、氯霉素（CM）、复方新诺明（SXT）和四环素（TE）的耐药率仅分别为0.3%、0.3%、0.9%和1.6%,结果表明副溶血弧菌菌株的耐药性不严重。177株人源株对四环素、卡那霉素和氨苄青霉素的耐药率要高于食源株,而对链霉素、诺氟沙星、复方新诺明和氯霉素的耐药率要低于食源株。高致病株、致病株和非致病株均对链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素出现较高的耐药率,且对三种抗生素耐药性程度不同。高致病株对多数治疗致病性弧菌感染的药物敏感,耐药现象不严重；与国际上认为高致病株具有相同的耐药谱且对氨苄青霉素全部耐药不同,本研究的高致病株对氨苄青霉素只是多数耐药,耐药率为58.4%。对141株江苏、上海、浙江、福建和广东的副溶血性弧菌分离株进行PFGE研究,结果显示可分型菌株数为119株,分型率为84.4%。经PFGE电泳获得108种带型,所得的PFGE图谱分为五种遗传谱系：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ,各谱系所含菌株比率分别为14.3%、25.2%、15.1%、13.4%和31.9%,表明中国大陆的副溶血性弧菌分离株主要分布在谱系Ⅱ和Ⅴ中。不同地区分离株的PFGE分析结果显示,扬州分离株集中在Ⅱ和Ⅴ,浙江分离株集中在Ⅰ中,其余地区分离株的分布相对集中,均有各自的优势谱系。不同分离时间的PFGE分析结果显示,2006、2007、2008、2009和2010年分离株分别主要分布在谱系Ⅳ、Ⅴ、Ⅴ、Ⅰ和Ⅲ中,各年代的分离株均有各自的主要谱系。不同源分离株的PFGE分析结果显示,人源株主要分布在谱系Ⅱ和Ⅴ,食品分离株相对集中在谱系Ⅴ。这些结果说明中国大陆副溶血性弧菌分离株的分离地区、分离时间及不同宿主源与PFGE遗传谱系有一定的相关性。不同遗传谱系分离株对7种抗生素的耐药性分析显示,各谱系不存在对氯霉素、复方新诺明和诺氟沙星耐药的菌株,对四环素耐药的菌株仅分布在谱系Ⅰ和Ⅱ中,对链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素耐药的菌株分布较均衡,无显着性差异,说明PFGE谱系与耐药性无明显相关性。分子分型研究表明,PFGE可作为研究副溶血性弧菌传播途径、分子流行病学及溯源的有力工具。对扬州地区分离株的PFGE分析结果表明,9组细菌的PFGE带型相同,遗传系数为100%,部分菌株之间同源性很高（>80%）,提示在食品的销售、消费、运输等过程中,该菌可通过水平传播、交叉污染的方式向人类传播,引发食源性疾病。不同PFGE副溶血性弧菌的毒力相关基因分析表明,中国大陆的副溶血性弧菌高致病株、致病株及非致病株都有各自独特的谱系,高致病株主要存在于谱系Ⅰ和Ⅴ中；两种致病株（tdh阳性株和trh阳性株）分布规律不同,其中tdh阳性致病株主要分布在谱系Ⅰ中,trh阳性致病株主要分布在Ⅱ和Ⅲ中；非致病株主要分布在谱系Ⅳ中,分布呈现明显的差异性,且携带orf8、MTase、（?）HU-α和VP2905基因的菌株的PFGE谱系分布规律与高致病株一致,进一步说明了orf8、MTase、HU-α和VP2905是高致病株的标记基因。PFGE与MLST分型的比较分析显示,两种分型方法具有高度的一致性,PFGE可作为该菌分子分型的金标准,分辨率高于MLST。高致病株的原始序列型ST-3以及CC3复合体的其他成员只分布在谱系Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ中,谱系Ⅱ和Ⅴ是高致病株的优势谱系。大多数高致病株的PFGE型别是一致的,且高致病株的始祖菌的PFGE谱系与高致病株的PFGE带型相同或谱系相同。

魏鲁予^[10]（2010）在《致奶牛乳房炎木糖葡萄球菌部分生物学特性及Ⅰ类整合子检测》文中认为本研究从新疆北疆地区部分奶牛场临床型奶牛乳房炎乳样中分离的65株木糖葡萄球菌,采用常规生理生化鉴定、梅里埃生化鉴定系统鉴定和木糖葡萄球菌16SrRNA分子生物学鉴定筛选出60株木糖葡萄球菌,对分离的木糖葡萄球菌进行了致病性试验,药敏试验,及木糖葡萄球菌携带的I类整合子的PCR检测,分析了木糖葡萄球菌耐药表型与所携带的I类整合子之间的相关性。结果如下：1.被测菌株血浆凝固酶均为阴性,耐热核酸酶阴性,过氧化氢酶及甘露醇发酵为阳性,8株分离菌出现β-溶血,5株对小白鼠有致病性。2.对筛选出的木糖葡萄球菌进行16SrRNA基因PCR检测,有60株扩增出与目的片段相同的片段,选取典型的片段回收测序,经测序,在NCBI中比对,同源性在98.97%以上。3.木糖葡萄球菌耐药率较高的抗生素包括磺胺嘧啶钠（100%）,青霉素钾（93.3%）、庆大霉素（90%）、四环素（90%）、硫酸链霉素（86.7%）,敏感度较高的为阿米卡星（6.7%）、恩诺沙星（10%）。试验菌主要对氨基糖苷类,青霉素类,四环素类,磺胺类抗生素表现耐药性。4.本研究对新疆北疆地区分离的木糖葡萄球菌I类整合酶基因及其耐药基因盒进行了检测,分析了菌株携带整合子与其耐药表型的相关性,结果发现,I类整合子阳性菌株的耐药率明显高于阴性菌株,药敏表型分析表明,I类整合子与木糖葡萄球菌的耐药性有关,即I类整合子阳性菌比I类整合子阴性菌更容易产生耐药性。通过对整合子系统的研究,可以更多的了解细菌的耐药机制。

二、霍乱弧菌散发菌株的耐药遗传分析（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、霍乱弧菌散发菌株的耐药遗传分析（论文提纲范文）

（1）铜绿假单胞菌噬菌体对小鼠急、慢性肺炎模型的疗效探究（论文提纲范文）

（2）鼠李糖乳杆菌LS-8中新型细菌素的挖掘及抑菌机制的研究（论文提纲范文）

（3）弯曲菌快速检测及基因组水平遗传特征分析（论文提纲范文）

（4）1950-2009年动物源沙门菌的分型、耐药性及致病性研究（论文提纲范文）

（5）浙江沿海创伤弧菌的分布特征及其种群结构研究（论文提纲范文）

（6）生食贝类中副溶血性弧菌污染水平调查、定量风险评估和分离菌株特征分析（论文提纲范文）

（7）广州市海珠区感染性腹泻的病原学分析（论文提纲范文）

（8）Rep-PCR对牛舍环境中产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌溯源的研究（论文提纲范文）

（9）副溶血性弧菌分离株毒力相关基因分布特征及脉冲场凝胶电泳分型（论文提纲范文）

（10）致奶牛乳房炎木糖葡萄球菌部分生物学特性及Ⅰ类整合子检测（论文提纲范文）

四、霍乱弧菌散发菌株的耐药遗传分析（论文参考文献）

• [1]铜绿假单胞菌噬菌体对小鼠急、慢性肺炎模型的疗效探究[D]. 陈锋. 西南医科大学, 2021(01)
• [2]鼠李糖乳杆菌LS-8中新型细菌素的挖掘及抑菌机制的研究[D]. 郭行. 西北农林科技大学, 2020(03)
• [3]弯曲菌快速检测及基因组水平遗传特征分析[D]. 梁昊. 中国疾病预防控制中心, 2019(02)
• [4]1950-2009年动物源沙门菌的分型、耐药性及致病性研究[D]. 岂晓鑫. 扬州大学, 2018(05)
• [5]浙江沿海创伤弧菌的分布特征及其种群结构研究[D]. 潘军航. 浙江大学, 2015(02)
• [6]生食贝类中副溶血性弧菌污染水平调查、定量风险评估和分离菌株特征分析[D]. 韩海红. 中国疾病预防控制中心, 2015(10)
• [7]广州市海珠区感染性腹泻的病原学分析[D]. 王瑞莲. 南方医科大学, 2014(12)
• [8]Rep-PCR对牛舍环境中产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌溯源的研究[D]. 胡婧. 黑龙江八一农垦大学, 2013(10)
• [9]副溶血性弧菌分离株毒力相关基因分布特征及脉冲场凝胶电泳分型[D]. 王芳. 扬州大学, 2011(06)
• [10]致奶牛乳房炎木糖葡萄球菌部分生物学特性及Ⅰ类整合子检测[D]. 魏鲁予. 石河子大学, 2010(02)