一、SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用（论文文献综述）
戴姿薇,唐标[1]（2021）在《新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析》文中研究说明采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）跨膜蛋白酶丝氨酸2（transmembrane protease serine 2, TMPRSS2）的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研发提供参考。利用ProtParam、ProtScale分析预测TMPRSS2蛋白酶的理化特性;利用COILS Server、SignalP、TMPred、TargetP Server、NetPhos Server、NetNGlyc Server服务器对TMPRSS2蛋白酶结构进行功能结构的分析预测;利用SOPMA、Pfam、SWISS-MODEL分析预测TMPRSS2蛋白酶高级结构;利用IEBD分析预测TMPRSS2蛋白酶B细胞、T细胞表位。TMPRSS2蛋白酶氨基酸组成数为492个,其中丝氨酸占比最高;亲水性较高,含10个跨膜螺旋区;具有4个磷酸化位点,3个糖基化修饰点;二级结构中无规则卷曲占据主导地位,三级结构能与已知的5ce.1.1.A（SMTL ID）模型同源建模;存在13个潜在的B细胞表位,12个得分较高的T细胞表位。
万伟玮[2]（2020）在《抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究》文中指出沙粒病毒是一类有囊膜包裹的负链分节RNA病毒,其多个成员如瓜纳瑞托病毒（Guanarito virus,GTOV）、胡宁病毒（Junin virus,JUNV）、拉沙病毒（Lassa virus,LASV）、Lujo病毒（Lujo virus,LUJV）、马秋波病毒（Machupo virus,MACV）、萨比亚病毒（Sabia virus,SABV）、和白水河病毒（Whitewater Arroyo virus,WWAV）在西非和南美等地区流行,可以导致感染者出现出血热等症状,严重威胁人类健康。目前临床上除了广谱的抗病毒药物利巴韦林,没有FDA批准的特异性针对沙粒病毒的疫苗及药物,然而利巴韦林的治疗效果有限并且有较大的副作用。因此,迫切需要通过各种研究手段来寻找新的抗沙粒病毒药物。在本课题中,我们构建了低致病性沙粒病毒淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的反向遗传操作系统,并利用该系统拯救出带e GFP的重组LCMV病毒,随后我们利用含1018种小分子化合物的FDA成药库对重组LCMV进行了抗病毒活性筛选,发现霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼具备较强的抗LCMV活性。其中贝尼地平的抗LCMV活性最强,在Vero细胞上IC50=0.548μM、CC50=113.8μM、SI=207.66,并且在动物水平也展现了一定的抗LCMV活性。贝尼地平是一种二氢吡啶类钙离子通道抑制剂,在临床上可以用于治疗高血压和缺血性心脏病,同时也有血管保护和肾脏保护作用。进一步的功能研究表明,贝尼地平主要靶向LCMV入侵宿主细胞的膜融合过程。将LCMV在含有贝尼地平的培养基中多次传代获得了适应性突变的病毒,对病毒基因组测序发现了位于GPC上的突变D414A,并通过反向遗传学操作系统拯救出了适应性突变病毒株LCMV GPC-D414A,其GP2上D414A突变导致突变病毒对贝尼地平的抑制作用产生抗性。同时,贝尼地平对D414A突变的LCMV GPC介导的膜融合过程也失去了抑制效果,暗示贝尼地平可能通过与GP2上的D414位点直接或间接的相互作用,影响了GPC在低p H条件下的构象改变,从而抑制了病毒的膜融合;这一位点发生突变之后,贝尼地平与GPC的相互作用受阻,GPC的膜融合可以正常进行。此外我们还发现其它二氢吡啶类钙离子通道抑制剂对LCMV也具有抑制效果,并且LCMV GPC-D414A同样对这些药物的抑制作用存在抗性,这一结果表明这些二氢吡啶类钙离子通道抑制剂的抗病毒机制与贝尼地平类似。与此同时,我们发现霉酚酸、氯法齐明、达拉菲尼和阿帕替尼对新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2）也具有抑制效果,其中霉酚酸的IC50=0.101μM、CC50>100μM、SI>1000。霉酚酸是细胞内IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase）抑制剂,能够降低细胞内鸟嘌呤核苷水平从而影响GTP的合成并抑制病毒的复制。我们发现通过向细胞培养基中额外添加鸟嘌呤核苷,可以缓解霉酚酸对LCMV和SARS-Co V-2两种病毒的抑制。霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼都是FDA批准的药物,其临床安全性较为可靠,有望快速应用于沙粒病毒和SARS-Co V-2的临床治疗。HSV-1是一种在人类宿主中广泛携带的双链DNA病毒,感染人群可以终身携带病毒并且周期性的发病,在免疫力低下的情况下可能出现严重的症状。为了研究该病毒与宿主细胞的相互作用机制,本课题使用基于质谱的定量蛋白质组学的方法分析了宿主细胞HEK 293T感染HSV-1后蛋白质组的变化。我们总共鉴定到了6607个宿主蛋白,其中498个蛋白的表达受到调控。使用RNAi敲降的方法,我们发现了三个宿主蛋白IFITM3（IFN-inducible transmembrane protein 3）、CHCHD2（Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2）和TRIM27（Tripartite motif-containing protein 27）可以抑制病毒复制。通过生物信息学分析,我们鉴定到了一批参与HSV-1感染的宿主细胞信号通路,从系统的角度探究了HSV-1感染对宿主细胞的影响。
宁铁林,郑敏娜[3]（2020）在《核酸检测在2019冠状病毒病研究中的应用》文中认为2019冠状病毒病（coronavirus disease-19, COVID-19）传染性强、传播范围广,严重威胁全球公共卫生安全,再次引发了人们对不明原因突发急性传染病的高度关注。近年来分子生物学技术的发展,大大缩短了对未知病原体的鉴定时间。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）全基因组序列被快速破译,病毒来源、生物学特征和感染机制等信息得以初步揭示,为抗病毒药物和疫苗研发提供了参考。以实时荧光反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）和病毒基因测序为代表的核酸检测方法是COVID-19诊断的重要手段,在发现传染源、控制疾病传播方面发挥了不可替代的作用。本文就核酸检测在COVID-19研究中的应用做一综述。
朱小丽,黄翠,马丽丽,张超,巩玥,赵婉雨,赵秀芳,郭文姣,彭皓,张吉,梁慧刚[4]（2020）在《新型冠状病毒病（COVID-19）研究进展》文中提出2019年12月,湖北省武汉市暴发了一种由新型冠状病毒引起的肺炎（COVID-19）随后蔓延到中国所有省区,WHO宣布其为全球关注的突发公共卫生事件。及时了解和表征该病毒对抗击疫情至关重要。通过收集和梳理该疫情暴发之后2个月内全球多领域研究人员关于COVID-19的论文,发现这些研究主要集中在溯源分析、检测手段、病患治疗、临床表现、药物研发、致病机理、传播途径、流行特征等方面。该冠状病毒与蝙蝠冠状病毒以及穿山甲冠状病毒相关,其利用与SARS-CoV相同的人受体ACE2,感染途径证实为呼吸系统和消化系统。该病毒具有人际传播能力,并且出现无症状传播。COVID-19确诊病例多数与武汉有关,大多数为轻症,年老者病死率较高。快速灵敏核酸检测通常作为确诊依据,目前已经筛选出有价值的候选药物如瑞德西韦进行临床试验。中国采取的旅行禁令和隔离等干预措施有效减轻了疫情蔓延。
孙敏[5]（2017）在《猪流行性腹泻病毒遗传变异规律与Ⅰ型干扰素逃避机制》文中研究指明猪流行性腹泻（Pocine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Pocine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病。可引起严重腹泻、脱水等临床症状,且可导致严重的萎缩性肠炎,发病率及死亡率较高。自1971年首次报道以来,目前已蔓延至欧洲、亚洲、美洲等多个国家,给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在临床传播过程中,PEDV基因组在不停的变异进化、致病力不断加强,而疫苗的保护效率较低,给PEDV的防控增加了难度。此外,PEDV感染宿主细胞后,可显着抑制干扰素的转录表达而逃避天然免疫应答。探讨PEDV的基因变异规律及进化方向、调控病毒感染功能性位点的鉴定及其免疫逃避机制,可为疫病的有效防控提供理论依据。1猪流行性腹泻病毒临床株变异及流行特点猪流行性腹泻在亚洲的大范围流行,给养殖业造成了重大的经济损失。本研究测定了 11株PEDV中国临床分离株全基因组,结合已报道38株PEDV全基因组序列,比较分析发现,该49株PEDV可分为经典群及流行群毒株,且在其基因组内鉴定了4个高突变区域（V1-V4）。进一步分析发现S基因及V2区域是区别经典群与流行群的关键区域,且可代替全基因组进行遗传进化分析。进而利用219株背景清楚的亚洲PEDV毒株的S基因建立系统进化树,并结合其地理分布发现,亚洲PEDV可分为多个流行亚群,且不同国家毒株间均存在广泛的基因变异,进而造成PEDV在亚洲流行的复杂性和严重性。时空重构进化分析结果表明,亚洲PEDV流行群毒株可能来自于韩国,进而传播至日本、泰国及中国;2013年后韩国新形成的变异株与中国的变异株亲缘关系最近;目前中国及韩国PEDV流行的严重性可能是由于流行亚群的复杂性所引起的。本研究对揭示PEDV在亚洲的流行趋势有重要意义,且为有效防控PEDV提供一定的帮助。2调控PEDV复制与感染的功能位点鉴定猪流行性腹泻病毒纤突蛋白（S蛋白）首先与细胞受体蛋白结合,进而借助特异性的蛋白酶介导S蛋白构象的改变而激活病毒囊膜与细胞膜的融合而入侵宿主细胞。本研究中,PEDV分离株85-7可以在Vero细胞内有效增殖,且可诱导胰酶非依赖性的细胞融合。在连续传代过程中筛选到了 8株传代突变株,通过全基因组比较分析发现,85-7株在传代过程中主要在非结构蛋白2（Nsp2）、S、ORF3及E基因四个区域发生了基因变异。结合其细胞内增殖特性分析发现,S2’切割位点的突变,即甘氨酸替代保守的精氨酸（R895G）,是致弱细胞融合能力、提高病毒滴度及诱导感染细胞微丝骨架固缩的关键性位点;进一步研究证明该位点变异可增强相应毒株的细胞增殖竞争力和适应性。另外,E蛋白跨膜区内16-20位氨基酸的缺失及第25位氨基酸的突变（L25P）可影响PEDV多个感染过程,如诱导内质网压力标志蛋白GRP78表达水平的提高、促炎性细胞因子IL-6及IL-8表达水平的提高,及宿主细胞凋亡水平的提高。本研究为进一步理解病毒蛋白在PEDV的复制、感染、细胞适应性及致病性中的作用提供依据。3热休克蛋白27（HSP27）下调表达辅助PEDV逃避宿主天然免疫应答PEDV 85-7株可在MARC-145细胞中有效增殖,其感染可显着抑制干扰素-β（IFN-β）的转录表达。同时,研究发现85-7分离株可影响宿主细胞内不同家族热休克蛋白转录水平的变化,其中热休克蛋白27（HSP27）的转录表达水平显着下降,高表达HSP27蛋白显着抑制PEDV的体外复制（约28倍）,而iRNA干扰HSP27转录表达可显着提高PEDV病毒滴度。进一步研究表明HSP27可显着激活NF-κB磷酸化,进而刺激IFNB1（编码IFN-β）及干扰素下游基因（ISGs）转录水平的显着升高。且通过体外添加IFN-β,或外源高表达ISGs Mx1与Mx2均可显着抑制PEDV的体外复制。值得注意的是,IFN-β的干扰表达几乎可以抵抗HSP27的抗病毒作用及其诱导ISGs表达的能力,提示HSP27蛋白是细胞内抵抗PEDV感染的IFN-β上游调控因子,其下调表达可辅助PEDV逃避宿主细胞的天然免疫应答。本研究首次探讨PEDV感染过程中HSP27蛋白在天然免疫应答中的作用,有助于进一步阐明PEDV的感染机制。4干扰素诱导型PEDV变异株的鉴定及机制探究PEDV 85-7传代突变株（C40株）S2’位点的变异在Vero细胞上促使病毒滴度显着升高,而该变异株在感染MARC-145细胞时其病毒滴度较亲本株显着下降,推测S2’位点的变异与干扰素表达分泌通路存在密切关联。为证明S2’位点的变异与干扰素分泌的关系,利用转录组学比较分析了 PEDV 85-7亲本株及C40突变株感染MARC-145细胞后差异转录的mRNA及LncRNA。qPCR结果验证其与测序结果中差异基因表达水平变化趋势一致,说明测序结果的可靠性。通过Gene Ontology及KEGG数据库中对差异基因进行功能注释,结果表明这些差异基因可参与核酸等大分子的转录修饰,细胞内膜、细胞器等细胞组分表达。不同于亲本株,C40突变株特异地调控HSPA12B、DNAJC1、DNAJC24等表达并诱导IL6、CXCL9及IL12A等转录水平显着上调。值得注意的是,与亲本株相比,C40突变株可特异地启动IFNB1、IFNL1、IFNL3等干扰素编码基因的转录,并显着提高下游相应干扰素刺激基因（ISGs）的转录表达,进而促使C40毒株的病毒滴度的显着下降。我们的研究证实LncRNA参与PEDV感染过程,且在亲本株与C40突变株也显现明显的差异。C40可特异性诱导16个LncRNA差异转录,其中LncRNA-L6及LncRNA-L7靶基因预测分别为PEDV抗病毒蛋白IF144及IL12A,进而负调控PEDV的增殖复制。结果表明,PEDV特定基因或位点的变异,可通过调控宿主蛋白及LncRNA等的转录表达而改造细胞天然免疫应答反应,进而影响PEDV增殖复制,为PEDV抗病毒分子的筛选及感染机制阐明提供基础。
王文[6]（2017）在《啮齿动物中冠状病毒的分子流行病学研究及登革病毒在非疫区的再现》文中提出冠状病毒是有包膜的单股正链RNA病毒,是目前已知的RNA病毒中基因组最大的。冠状病毒主要感染呼吸道、肠道、肝脏和神经系统,可以引起人和动物多种疾病,是非常重要的病原体。在2002/2003年SARS冠状病毒引起的新发传染病暴发流行前,兽医、养殖业对冠状病毒的重视程度高于公共卫生对冠状病毒的关注。SARS冠状病毒新发传染病的暴发使得人们对冠状病毒高度重视,全世界的科学家致力于SARS冠状病毒的溯源研究和新型冠状病毒的发现工作。在过去的十几年间,在人和动物中发现了大量的新型冠状病毒。2012年MERS冠状病毒在中东的暴发流行使得冠状病毒再次成为关注的焦点。动物中很有可能存在新的未被识别的冠状病毒存在跨种间传播的风险。目前已知的冠状病毒分为4属,其中Alpha和Beta属病毒的宿主主要为哺乳动物,Gamma和Delta属病毒主要发现于鸟类与禽类。啮齿动物包括约2277种,可传播60多种已知的人类和家畜传染病。啮齿动物生活在人类或家养动物的附近,一旦接触被啮齿动物的唾液、尿液和粪便污染的食物和物品以及分泌物形成的气溶胶,增加了病原体的跨种间传播风险。鼠等啮齿动物是RNA病毒重要的储存宿主,但是迄今为止只发现啮齿动物携带一种冠状病毒,即鼠科冠状病毒,包括鼠肝炎病毒（Murine hepatitis virus,MHV）和大鼠涎泪腺炎冠状病毒（Ratsialodacryoadenitiscoronavirus,RCoV）。为了探索冠状病毒在啮齿动物中的多样性及其进化,我们2011-2013年在浙江省的龙泉市、文成县和鹿城区采集了 1,465只啮齿动物,通过逆转录PCR的方法检测冠状病毒RNA,使用深度测序、基因组步移和RACE等方法扩增冠状病毒的全基因组序列。在浙江省龙泉市和温州市鹿城区的褐家鼠中发现了一种新型冠状病毒,命名为Lucheng Rn rat coronavirus（LRNV）;在龙泉市的罗赛鼠、黄胸鼠和社鼠中发现了鼠科冠状病毒的新种Longquan R1 rat coronavirus（LRLV）,在龙泉市的黑线姬鼠、褐家鼠和罗赛鼠中发现了Betacoronavirus 1 的新种 Longquan Aa mouse coronavirus（LAMV）。这是鼠科冠状病毒发现60年后首次报道啮齿动物携带其它类型的冠状病毒,并首次发现啮齿动物携带Alpha属的冠状病毒,这些数据表明啮齿动物是冠状病毒重要的宿主。系统发生分析表明LAMV and LRLV都属于Beta冠状病毒的A组,该组包括在人、家畜和野生动物中发现的冠状病毒。有意思的是,褐家鼠携带的LRNV在3CLpro和RdRp基因树中形成单独的分支,并与Alpha冠状病毒聚集在一起,在Hel、ExoN、NendoU和O-MT进化树中形成单独分支,并位于Alpha冠状病毒的根部位置,而在N和S基因树中形成了更分化的一支,LRNV在基因结构上含有许多独特的辅助蛋白基因,表明可能是起源于重组。此外,在LRLV中也发现了种内重组事件。重组是冠状病毒进化的重要方式之一,也是产生遗传多样性的重要机制之一。由此可见,这些数据表明啮齿动物可能携带未知的冠状病毒并在Beta冠状病毒A分支和Alpha冠状病毒的起源进化中起重要的作用。登革病毒是人类最重要的新发传染病病原体之一,对世界大约三分之一的人口构成威胁。虽然二战后该疾病在中国消失了 30年,但是登革热自70年代末以来每年都有报道。然而,由于暴发通常高度地域化,因此并没有引起人们的广泛关注。此外,由于人口流动性增加,在中国其它气候条件不适宜该病原体增殖/传播的省份也有了登革热输入病例的报道。因此,更好地了解这些非流行地区的登革热流行病学将对其预防和控制具有重大的意义。登革热输入病例对非疫区,尤其是埃及伊蚊广泛分布的地区,可造成威胁人类生命健康的重大公共卫生问题。在本研究中,我们在温州市和武汉市（这两个地区在过去很少有登革热的报道）共收集了 20例登革热病例,其中温州市5例,武汉市15例。感染的患者表现为典型的登革热临床症状,包括高烧（100%）、头痛（100%）、头晕（45%）、肌痛（50%）、恶心和呕吐（40%）、皮疹（40%）以及出血点（25%）。系统发生分析显示,从四名患者中获得的病毒基因组序列均为DENV-1,并且与来自印度次大陆的毒株有最近的亲缘关系,表明该登革病毒在两地间的传播。值得注意的是,尽管大多数患者（18/20）有发病前曾到过国内或国外登革热流行地区的旅游史,表明这些病例可能是输入性病例,但包括一名7岁儿童在内的其他两名患者并没有近期曾到过登革热流行地区的旅行史,提示是登革病毒的本地传播。因此,本研究对中国登革热的流行病学、控制和预防有重要意义,并将与其它非流行情况下的病毒传播直接相关。
朱云鹏[7]（2016）在《SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及研究》文中提出SARS冠状病毒是一种拥有最大基因组的单股正链RNA冠状病毒,能够引起严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndromes）。SARS冠状病毒主蛋白酶（SARS-CoVMpro）在病毒复制和致病性方面起着关键的作用,且在同属的冠状病毒中具有高度的保守型,是抗SARS病毒药物的一个理想靶点。因此,其抑制剂或药物的发现与开发不仅具有重要的理论意义,同时也蕴含重大的实践价值。本研究首先对SARS冠状病毒主蛋白酶进行异源重组表达与提纯,然后以其为靶点,利用体外药物筛选模型,通过荧光强度的变化检测出酶的活性,对小分子片段库和蛋白酶抑制剂库共275种化合物进行了体外抑制活性的评价。通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物 5 种,为 P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28 和 P-2-54,其半数抑制浓度（IC50）分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L和0.36±0.03μmol/L。之后运用抑制动力学研究以及分子对接等方法探讨筛选出的这5种阳性结果对SARS-CoV Mpro的抑制机制。分子对接结果发现P-l-08、P-l-19、P-2-24 和 P-2-54 能与 SARS-CoV Mpro催化活性中心的 Cys-145 形成共价键,结合动力学曲线证明这四种化合物为不可逆抑制剂。P-2-28能够与SARS-CoV Mpro的Asn-142、Gly-143和Gln-189形成氢键,以非共价键的方式与蛋白结合,根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现该化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,其抑制常数K,为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC50值及K,值关系的研究,进一步验证了化合物P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。这5种抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。
任志林[8]（2014）在《MERS冠状病毒主蛋白酶与N3抑制剂复合物的结构功能研究及SARS冠状病毒解旋酶的晶体学研究》文中研究说明自2012年起,一种新型冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV）持续在中东地区蔓延,已造成上百例感染病例,致死率高达50%。这是继2003年爆发的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, SARS-CoV）、2004年发现的人类冠状病毒NL63（Human Coronavirus NL63,HCoV-NL63）以及2006年发现的人类冠状病毒HKU1（Human Coronavirus HKU1, HCoV-HKU1）之后发现的又一个人类冠状病毒家族的新成员,这表明冠状病毒对人类健康的威胁始终存在,然而到目前为止,在世界范围内还没有切实有效的能用于临床治疗MERS-CoV、SARS-CoV等冠状病毒感染的疫苗或特效药物。冠状病毒作为单股正链RNA病毒,编码约16个非结构蛋白（non-structural proteins, nsps）介导自身的转录复制过程。这其中,nsp5（即主蛋白酶）参与将冠状病毒基因组编码的复制酶多蛋白（polyproteins, pp1a, pp1ab）酶切水解为病毒基因组复制所必需的16个非结构蛋白的过程,因而在冠状病毒的转录复制中发挥了至关重要作用。并且在人体内不存在nsp5的同源蛋白,因而nsp5蛋白是一个良好的抗冠状病毒靶点。本论文首先运用分子置换法解析了MERS-CoV nsp5与N3抑制剂复合物的2.27A晶体结构,分析了nsp5与N3抑制剂间的精确相互作用,验证了MERS-CoVnsp5以同源二聚体的形式发挥活性功能,以Cys-His二体构成催化活性中心,为理解N3抑制MERS-CoV nsp5的反应机理提供了良好的结构基础；并且我们通过体外构建的荧光酶活体系定量分析了N3分子对MERS-CoV nsp5的抑制活性,从结构和功能两方面证实了N3确实是MERS-CoV nsp5的良好抑制剂；其次,我们比较并分析了冠状病毒亚科不同成员（MERS-CoV、SARS-CoV、 HCoV-HKU1和IBV）的nsp5结合N3抑制剂的高度结构保守性及轻微差异,期望为抗MERS-CoV的抑制剂开发提供优化指导。本论文的另外一部分工作为SARS-CoV nsp13蛋白的蛋白质晶体学研究。nsp13具有解旋酶及NTPAse酶功能,是冠状病毒转录复制过程不可缺少的核心酶之一,也是一个良好的抗冠状病毒药物靶点。在本论文中,我们通过合理的分子克隆构建及有效的蛋白表达纯化手段,获得了SARS-CoV nsp13母体晶体的X射线衍射数据（2.9A）,为最终解析SARS-CoV nsp13的三维结构奠定了良好的基础。
苏测洋[9]（2014）在《SARS冠状病毒nsp10/nsp16蛋白质复合体行使2’-O-甲基转移酶功能的结构和生物化学研究》文中研究表明冠状病毒（Coronavirus）属于套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）,冠状病毒为单链正义RNA病毒,其基因组全长约为30000nt左右,具有RNA病毒中最大的基因组。冠状病毒基因组含有7-14个开放读码框（ORF）,翻译8-15条多肽链,其中,位于病毒基因组5’端的两个ORF （ORF la, ORF lab）翻译成两个多聚蛋白（ppla, pplab）通过病毒蛋白酶经过切割成熟,形成16个非结构蛋白（nspl-16）,并与一些宿主因子及病毒RNA形成复制转录复合体,进行病毒基因组的复制转录。2002年底,一种新型的冠状病毒在我国广东省爆发,并迅速扩散到全球30多个国家与地区,总共导致超过8000多例感染,死亡率约为10%。此病毒被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV）,由于SARS冠状病毒的高致病性,使得冠状病毒的研究成为了研究热点。2012年9月,一种新的冠状病毒在中东地区爆发,并向欧洲地区蔓延,这种病毒随后被命名为中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV）.迄今为止,共导致630例感染,199例死亡。冠状病毒是一种典型的人畜共患病毒,可以在宿主之间进行跨物种转播,容易导致新发（emerging）急性感染,成为威胁人类健康的重要因素。冠状病毒病毒RNA的5’端具有cap1型帽子结构修饰。RNA病毒基因组5’端的修饰对于病毒基因组的复制、病毒蛋白质的翻译合成、病毒颗粒的装配以及逃避宿主先天免疫系统对病毒病原分子模式和病毒复制的识别非常重要。这使得RNA病毒基因组RNA5’端修饰相关元件成为了一个潜在的抗病毒药物设计靶点。由于冠状病毒的复制生活周期发生在细胞质中,无法调用宿主的加帽酶来完成自身病毒RNA的加帽,所以冠状病毒通过病毒自身蛋白来完成病毒RNA cap1型加帽。之前研究发现,冠状病毒的nsp10通过与nsp16形成蛋白质复合体来起始nsp16的2’-O-甲基转移酶活性,参与cap1型帽子结构的形成。但是,冠状病毒nsp10促进nsp162’-O-甲基转移酶活性的分子机制尚不明确。本课题以SARS冠状病毒为研究模型,采用蛋白质X-射线晶体学研究方法,获得了SARS冠状病毒asp10/nsp16蛋白质复合体与甲基化供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）复合体的高分辨率晶体结构模型,其分辨率为2.0埃米。通过一系列蛋白质生物化学研究,结合结构模型分析,我们发现,相比于其他加帽相关的2’-O-甲基转移酶,nsp16具有一种新的蛋白质表面结构模式,nsp16的表面完全被柔性的loop区覆盖,尤其是SAM结合口袋和底物RNA结合沟槽,nsp16的α D螺旋太短,不足以支撑SAM结合口袋的侧壁,同时,nsp16底物RNA结合沟槽的侧壁柔性太高,导致其无法通过三明治π键堆积作用结合底物RNA的鸟苷酸帽子结构。以上结构特征导致单独的nsp16不能结合甲基化供体和底物；在nsp10/nsp16复合体中,nsp10通过一对极性相互作用稳定了nsp16的SAM结合口袋（pocket）的侧壁,同时nsp10延伸了nsp16负责与底物RNA结合的正电荷蛋白质表面。通过这一系列的作用,nsp10帮助nsp16结合甲基化供体SAM和甲基化底物RNA并激活nsp16的2’-O-甲基转移酶活性。由于冠状病毒nsp10/nsp16蛋白质复合体的这种新的结构与功能模式,使得我们针对nsp10与nsp16相互作用表面开发新型的冠状病毒特异性抗病毒药物成为了可能。
曹中赞[10]（2011）在《人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析》文中研究说明冠状病毒具有广泛的宿主范围,能够导致人和多种动物出现不同程度的呼吸道、肠道和神经系统的功能紊乱症状。2003年春季SARS-CoV的出现及其感染并导致的高死亡率引起了人们对冠状病毒的高度重视。对冠状病毒的致病性以及致病机理的研究是当前研究者关注的热点之一。IBV属于γ冠状病毒,主要在家禽的气管、肾脏、腺胃和生殖道等器官组织的上皮细胞中复制。IBV的传播给全球家禽业带来严重的经济损失。已有的研究证明部分其他冠状病毒的感染能够影响宿主细胞的蛋白表达模式。本研究首次利用蛋白质组学以及相关的分子生物学技术对人工感染IBV鸡胚的气管和肾脏组织的差异表达蛋白质、人工感染不同毒力IBV后不同阶段的鸡气管和肾脏组织的差异表达蛋白质进行了鉴定,并应用生物信息学工具对差异表达蛋白质的分子功能、生物学进程和亚细胞分布进行分类,旨在从蛋白质水平上探索IBV与宿主的相互作用以及IBV的致病机制。本研究首先利用双向凝胶电泳（2-DE）结合质谱技术对人工感染IBV H120疫苗株72小时时鸡胚和未感染对照组鸡胚气管和肾脏组织的群体蛋白质表达情况进行了分析。鉴定出了一些有显着差异表达的蛋白质。生物信息学分析表明这些蛋白质大多与细胞骨架组成、钙离子结合、能量代谢、抗氧化、应激反应、以及大分子物质合成有关,其中有些蛋白还具有调节细胞凋亡的特性。应用荧光定量PCR技术对热休克蛋白beta-1、胞外脂肪酸结合蛋白、原肌球蛋白alpha-1、膜联蛋白A5、过氧化物还原酶-1、膜联蛋白A2、烯醇酶-1等11种蛋白的转录水平进行了分析,结果表明这些蛋白基因的mRNA水平变化趋势和2-DE结果基本一致。Western blot分析进一步验证了热休克蛋白beta-1和膜联蛋白A5的表达变化,结果与mRNA表达模式的变化也一致。本研究着重应用2-DE和荧光差异显示双向凝胶电泳（2-DIGE）结合质谱技术研究了人工感染IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5和其鸡胚传代致弱毒株ck/CH/LDL/97I P115后不同时间点鸡气管和肾脏组织群体蛋白质的表达改变情况,鉴定出62种差异表达蛋白。生物信息学分析表明大部分差异蛋白与细胞骨架组成、急性期应答、抗氧化、应激应答、能量代谢,大分子物质代谢,信号转导和离子运输有关。用荧光定量PCR技术对热休克蛋白beta-1、膜联蛋白A2、波形蛋白、膜联蛋白A5、锰超氧化物歧化酶、线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧基酶等14种差异表达蛋白进行转录水平的分析,其动态变化趋势与蛋白质组学的结果大部分是一致的。用western blot方法对三种差异表达蛋白膜联蛋白A2、膜联蛋白A5和热休克蛋白beta-1从表达水平上进行了验证,其结果与蛋白质组学得到的结果是一致的。实验结果表明,IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5和鸡胚传代致弱毒株ck/CH/LDL/97I P115感染能够诱导包括细胞骨架组成、抗氧化、应激应答、能量代谢等相关蛋白在内的一些在宿主应答过程中可能起重要作用的关键蛋白产生不同模式的表达变化,而且这种表达变化的差异主要发生在感染的早期阶段。本研究首次获得了较为完善的人工感染IBV自然宿主鸡的气管和肾脏组织的差异表达蛋白质数据,为进一步阐释IBV的致病机理,以及筛选到有价值的预防或治疗药物提供了有价值的信息。同时,本研究结果也为SARS-CoV等其他冠状病毒的相关研究提供了参考依据。
二、SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用（论文提纲范文）
（1）新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 数据来源 |
| 1.1.2 主要数据库 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 TMPRSS2蛋白酶一级结构分析预测 |
| 1.2.2 TMPRSS2蛋白酶功能结构分析预测 |
| 1.2.3 TMPRSS2蛋白酶高级结构分析预测 |
| 1.2.4 TMPRSS2蛋白酶B细胞表位和T细胞表位分析预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TMPRSS2蛋白酶氨基酸理化性质预测分析 |
| 2.2 TMPRSS2蛋白酶疏水性预测分析 |
| 2.3 TMPRSS2蛋白酶卷曲螺旋区预测分析 |
| 2.4 TMPRSS2蛋白酶信号肽预测分析 |
| 2.5 TMPRSS2蛋白酶跨膜结构区预测分析 |
| 2.6 TMPRSS2蛋白酶亚细胞定位预测分析 |
| 2.7 TMPRSS2蛋白酶磷酸化位点预测分析 |
| 2.8 TMPRSS2蛋白酶糖基化位点预测分析 |
| 2.9 TMPRSS2蛋白酶二级结构预测分析 |
| 2.10 TMPRSS2蛋白酶结构域预测分析 |
| 2.11 TMPRSS2三级结构预测分析 |
| 2.12 TMPRSS2蛋白酶B细胞表位、T细胞表位预测 |
| 3 讨 论 |
（2）抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 沙粒病毒的发现及分类 |
| 1.2 沙粒病毒的结构和编码的蛋白 |
| 1.2.1 沙粒病毒颗粒的结构 |
| 1.2.2 沙粒病毒基因组的结构 |
| 1.2.3 沙粒病毒的核蛋白NP |
| 1.2.4 沙粒病毒RNA依赖的RNA聚合酶L |
| 1.2.5 沙粒病毒的基质蛋白Z |
| 1.2.6 沙粒病毒的膜蛋白GPC |
| 1.3 沙粒病毒的生命周期 |
| 1.4 沙粒病毒流行病学及临床特征 |
| 1.5 沙粒病毒的动物模型 |
| 1.5.1 旧世界沙粒病毒的动物模型 |
| 1.5.2 新世界沙粒病毒的动物模型 |
| 1.6 沙粒病毒的药物和抗体研究进展 |
| 1.6.1 抑制沙粒病毒复制的药物研究进展 |
| 1.6.2 沙粒病毒进入抑制剂研究进展 |
| 1.6.3 多肽类药物的研究进展 |
| 1.6.4 沙粒病毒疫苗的研究进展 |
| 1.7 Ⅰ型单纯疱疹病毒简介 |
| 第二章 FDA批准的小分子药物库的抗病毒药物筛选 |
| 2.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 质粒的构建 |
| 2.1.4 LCMV及其重组病毒的拯救与扩增 |
| 2.1.5 VSV假病毒的包装 |
| 2.1.6 SARS-Co V-2 病毒的获得 |
| 2.1.7 免疫噬斑印记法检测LCMV的滴度 |
| 2.1.8 LCMV NP蛋白小鼠和家兔抗血清的制备 |
| 2.1.9 MTT法检测细胞活力 |
| 2.1.10 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR) |
| 2.1.11 病毒与宿主细胞的结合与内化 |
| 2.1.12 细胞膜融合模型 |
| 2.1.13 迷你基因组复制系统 |
| 2.1.14 LCMV出芽能力检测 |
| 2.1.15 Western blot印记法检测目的蛋白 |
| 2.1.16 动物实验 |
| 2.1.17 筛选药物适应性突变病毒 |
| 2.1.18 免疫荧光染色法(Immunofluorescence assay,IFA) |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 利用重组e GFP的 LCMV筛选FDA批准的小分子药物库 |
| 2.2.2 筛选得到的抗病毒药物的IC50、CC50和SI值 |
| 2.2.3 五种抗病毒药物的作用阶段 |
| 2.2.4 贝尼地平的抗病毒机制 |
| 2.2.5 具有耐药性的突变位点的发现 |
| 2.2.6 贝尼地平能够抑制LCMV在小鼠体内的复制 |
| 2.2.7 贝尼地平在沙粒病毒中具有广谱的抗病毒效果 |
| 2.2.8 其它二氢吡啶类药物抑制LCMV的作用与贝尼地平相似 |
| 2.2.9 霉酚酸、阿帕替尼、达拉菲尼和氯法齐明对新冠病毒的抑制作用 |
| 2.2.10 额外添加鸟嘌呤核苷中和霉酚酸的抗病毒作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 总结与展望 |
| 第三章 HSV-1 感染的HEK293T细胞定量蛋白质组学分析 |
| 3.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 质谱样品的SILAC标记 |
| 3.1.4 细胞核蛋白与胞浆蛋白的提取 |
| 3.1.5 蛋白的提取和消化 |
| 3.1.6 液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)分析 |
| 3.1.7 蛋白的鉴定与定量 |
| 3.1.8 GO聚类分析 |
| 3.1.9 siRNA转染细胞 |
| 3.1.10 病毒基因组DNA和宿主细胞基因表达的检测 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 HSV-1 感染HEK293T细胞的定量蛋白质组学分析的样品准备 |
| 3.2.2 质谱获得的定量蛋白质组数据的处理 |
| 3.2.3 WB和 qRT-PCR法验证MS分析得到的差异蛋白 |
| 3.2.4 通过GO分析鉴定被HSV-1感染影响的生命过程 |
| 3.2.5 IFITM3、CHCHD2 和TRIM27 对病毒复制的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）核酸检测在2019冠状病毒病研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 SARS-CoV-2基因组特征 |
| 2 SARS-CoV-2感染机制 |
| 3 SARS-CoV-2核酸检测 |
| 3.1 实时荧光反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) |
| 3.2 宏基因组测序 |
| 3.3 等温核酸扩增技术 |
| 3.4 基于成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)检测技术 |
| 4 展 望 |
（4）新型冠状病毒病（COVID-19）研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒溯源 |
| 1.1 与蝙蝠冠状病毒的关系 |
| 1.2 关于蛇是潜在中间宿主的讨论 |
| 1.3 与穿山甲冠状病毒的关系 |
| 2 机理研究 |
| 2.1 感染机理和途径 |
| 2.2 药物抗体等潜在的设计基础 |
| 3 病毒检测和疾病诊断 |
| 3.1 核酸检测方法和设备 |
| 3.2 抗体、CT等在疾病检测诊断中的重要性 |
| 4 疫苗、抗病毒药物研发 |
| 4.1 抗病毒药物 |
| 4.2 疫苗和抗体 |
| 5 临床资料 |
| 6 基于模型开展的流行特征研究 |
（5）猪流行性腹泻病毒遗传变异规律与Ⅰ型干扰素逃避机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒致病性研究 |
| 1 流行病学 |
| 1.1 PEDV经典毒株在欧洲和亚洲首次报道 |
| 1.2 高致病性PEDV毒株在全球范围内的蔓延传播 |
| 1.3 S-INDEL PEDV毒株的发现与蔓延 |
| 1.4 其他PEDV变异毒株 |
| 1.5 PEDV全球内进化历程 |
| 2 猪流行性腹泻病毒致病性 |
| 2.1 传统毒株致病性 |
| 2.2 新型非S-INDEL PEDV强毒株的兴起 |
| 2.3 S-INDEL毒株致病性特点 |
| 2.4 细胞连续传代可致弱PEDV强毒株 |
| 2.5 S基因不同位点缺失株毒力减弱 |
| 3 PEDV毒株间的抗原性差异 |
| 3.1 传统毒株与新兴毒株间抗原性差异 |
| 3.2 新兴PEDV毒株抗原性的易变性 |
| 4 猪流行性腹泻病毒诊断与预防 |
| 4.1 PEDV诊断方法 |
| 4.2 PEDV防控措施 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒遗传变异及分子功能研究 |
| 1 猪流行性腹泻病毒分子特征 |
| 2 开放阅读框1(ORF1a/1b)分子功能研究 |
| 3 纤突蛋白(S) |
| 3.1 PEDV S蛋白的结构 |
| 3.2 PEDVS蛋白的抗原性 |
| 3.3 蛋白水解激活纤突蛋白 |
| 4 开放阅读框3 (ORF3) |
| 5 小膜蛋白(E) |
| 5.1 病毒装配及形态形成 |
| 5.2 细胞凋亡 |
| 5.3 离子通道活性 |
| 5.4 病毒毒力及致病性 |
| 5.5 PEDVE蛋白功能 |
| 6 膜蛋白(M) |
| 7 核衣壳蛋白(N) |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒与宿主蛋白互作研究 |
| 1 细胞适应性 |
| 2 PEDV受体 |
| 3 天然免疫在抗病毒反应过程中的作用 |
| 3.1 干扰素 |
| 3.2 干扰素刺激因子(ISGs) |
| 3.3 干扰素刺激转录产物 |
| 3.4 PEDV感染与天然免疫应答的关系 |
| 4 细胞应激 |
| 5 蛋白组学研究 |
| 6 细胞凋亡 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验部分 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒临床株变异及流行特点 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料采集与处理 |
| 1.2 病毒基因组提取及阳性病料鉴定 |
| 1.3 全基因组测序引物设计 |
| 1.4 全基因组序列测定与拼接 |
| 1.5 全基因组序列对齐及变异分析 |
| 1.6 PEDV遗传进化分析 |
| 1.7 PEDV流行群与经典群毒株区别位点(DCP)鉴定 |
| 1.8 抗原指数和亲水性分析 |
| 1.9 PEDV亚洲流行时间地理演变分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PEDV阳性病料的鉴定 |
| 2.2 PEDV阳性病料全基因组扩增、测序及序列拼接 |
| 2.3 PEDV全基因组序列的遗传进化分析 |
| 2.4 PEDV全基因组序列变异规律 |
| 2.5 PEDV遗传进化替代基因的筛选鉴定 |
| 2.6 PEDV纤突蛋白(S)氨基酸序列特性分析 |
| 2.7 PEDV亚洲流行亚群及特征分析 |
| 2.8 PEDV亚洲流行规律演变分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 调控PEDV复制与感染的功能位点鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞培养与试验试剂 |
| 1.2 病毒的分离 |
| 1.3 病毒的鉴定 |
| 1.4 病毒的克隆纯化与空斑计数 |
| 1.5 PEDV 85-7株增殖特性 |
| 1.6 PEDV 85-7株细胞传代株筛选及全基因组测定 |
| 1.7 细胞骨架形态观察 |
| 1.8 PEDV诱导Vero细胞凋亡特性分析 |
| 1.9 荧光定量PCR |
| 1.10 病毒竞争试验 |
| 1.11 计算分析和多序列比对 |
| 1.12 蛋白表达水平测定 |
| 1.13 PEDV E蛋白及其跨膜区突变体真核表达载体的构建及功能特性分析 |
| 1.14 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 单克隆抗体制备 |
| 2.3 PEDV 85-7株鉴定 |
| 2.4 PEDV85-7株在Vero细胞内增殖特性 |
| 2.5 PEDV 85-7株传代株的筛选及培养特性分析 |
| 2.6 PEDV 85-7株全基因组传代变异特点 |
| 2.7 S2'位点突变(R895G)生物功能鉴定 |
| 2.8 E蛋白变异株细胞感染特性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 热休克蛋白27(HSP27)的下调表达辅助PEDV逃避宿主天然免疫应答 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞,病毒与载体 |
| 1.2 PEDV在MARC-145细胞中增殖特性 |
| 1.3 PEDV感染对细胞内源热休克蛋白编码基因转录水平的影响 |
| 1.4 IFN-β对PEDV复制的影响 |
| 1.5 荧光定量PCR |
| 1.6 真核表达载体的构建 |
| 1.7 IFN-β调控蛋白对PEDV复制的影响 |
| 1.8 蛋白表达水平测定 |
| 1.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PEDV 85-7株在MARC-145细胞上增殖特性 |
| 2.2 细胞内源IFN-β与PEDV感染间关系 |
| 2.3 IFN-β显着抑制PEDV 85-7株复制 |
| 2.4 HSP27蛋白参与PEDV感染及天然免疫应答过程 |
| 2.5 HSP27蛋白依赖IFN信号通路抑制PEDV在细胞内的复制 |
| 2.6 HSP27诱导干扰素刺激基因的转录 |
| 2.7 抑制PEDV复制的干扰素刺激基因的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 干扰素诱导型PEDV变异株的鉴定及机制探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞,病毒与载体 |
| 1.2 细胞培养与病毒增殖 |
| 1.3 PEDV生长曲线与生长特性测定 |
| 1.4 PEDV85-7亲本株及C40突变株感染MARC-145细胞比较转录组分析 |
| 1.5 荧光定量PCR |
| 1.6 LncRNA参与调控PEDV的细胞内复制 |
| 1.7 数据统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 S2'位点突变(R895G)对PEDV在MARC-145细胞中细胞病变的影响 |
| 2.2 S2'位点突变(R895G)对PEDV在MARC-145细胞增殖的影响 |
| 2.3 比较转录组学分析 |
| 2.4 差异表达基因的qPCR验证 |
| 2.5 PEDV 85-7株及C40突变株诱导细胞热休克蛋白的表达差异比较 |
| 2.6 PEDV 85-7株及传代突变株C40诱导细胞因子的表达差异比较 |
| 2.7 PEDV 85-7株及传代突变株C40感染诱导细胞ISGs的表达差异比较 |
| 2.8 宿主LncRNA对PEDV复制的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）啮齿动物中冠状病毒的分子流行病学研究及登革病毒在非疫区的再现（论文提纲范文）
| 缩略词 第一部分 啮齿动物中新型冠状病毒的发现、多样性及其进化的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 试验材料 |
| 2.1 实验所需试剂 |
| 2.2 试验主要仪器 |
| 2.3 生物信息学分析软件 |
| 3. 方法 |
| 3.1 标本采集 |
| 3.2 样本中RNA的提取 |
| 3.3 宿主动物总DNA的提取 |
| 3.4 Cytb基因的扩增 |
| 3.5 冠状病毒的检测 |
| 3.6 深度测序 |
| 3.7 冠状病毒全基因组的获取 |
| 3.8 核苷酸序列的登录号 |
| 3.9 系统发生分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 啮齿动物采集及冠状病毒筛查 |
| 4.2 病毒序列的遗传特征 |
| 4.3 冠状病毒的系统发生关系 |
| 4.4 重组分析 |
| 5. 讨论 |
| 6. 参考文献 第二部分 2014年登革热非疫区的登革热再发和本地传播研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 登革热病人和样品 |
| 2.2 血清学检测 |
| 2.3 RT-PCR和DENV测序 |
| 2.4 进化分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 人口学特征和流行病学 |
| 3.2 患者血清样品的血清学和遗传学研究 |
| 3.3 住院患者的临床资料 |
| 3.4 系统发生分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 结论 文献综述 冠状病毒病原生物学研究进展 |
| 参考文献 附表 在学期间发表的文章 致谢 |
（7）SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 SARS冠状病毒概述 |
| 1.1.1 SARS的体征和冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 SARS冠状病毒简介 |
| 1.2 已发现的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂 |
| 1.2.1 SARS冠状病毒主蛋白酶简介 |
| 1.2.2 SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂 |
| 1.3 高通量药物筛选概述 |
| 1.3.1 高通量药物筛选简介 |
| 1.3.2 高通量药物筛选的检测方法 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验载体及菌种 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验原理及方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化 |
| 2.2.3 SARS冠状病毒主蛋白酶的酶活检测 |
| 2.2.4 SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的高通量筛选 |
| 2.2.5 SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的抑制动力学研究 |
| 2.2.6 SARS冠状病毒主蛋白酶与抑制剂的分子对接 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 分子克隆及重组质粒构建 |
| 3.1.2 SARS冠状病毒主蛋白酶异源表达与纯化 |
| 3.1.3 SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的高通量筛选 |
| 3.1.4 SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的抑制动力学研究 |
| 3.1.5 SARS冠状病毒主蛋白酶与抑制剂的分子对接 |
| 3.2 结果讨论 |
| 3.2.1 对药物筛选结果的讨论 |
| 3.2.2 对抑制剂研究结果的讨论 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（8）MERS冠状病毒主蛋白酶与N3抑制剂复合物的结构功能研究及SARS冠状病毒解旋酶的晶体学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 图和附表清单 |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 选题背景及意义 |
| 第二节 冠状病毒的研究简史、分类和引发的疾病 |
| 1.2.1 冠状病毒的研究简史 |
| 1.2.2 冠状病毒的分类 |
| 1.2.4 冠状病毒引起的疾病 |
| 1.2.5 冠状病毒引起的疾病的防治 |
| 第三节 冠状病毒的研究概况 |
| 1.3.1 冠状病毒的基因组结构 |
| 1.3.2 冠状病毒的生活周期 |
| 1.3.3 冠状病毒的复制转录机制 |
| 1.3.4 冠状病毒RTC的组成 |
| 第四节 MERS-CoV nsp5的研究意义 |
| 1.4.1 冠状病毒nsp5的研究意义 |
| 1.4.2 冠状病毒nsp5的研究现状 |
| 1.4.3 冠状病毒nsp5抑制剂的研究现状 |
| 1.4.4 冠状病毒nsp5及其抑制剂研究过程中的注意点 |
| 1.4.5 MERS-CoV nsp5与N3复合物结构的研究意义 |
| 第五节 本课题的研究内容与意义 |
| 第六节 论文结构安排 |
| 第二章 MERS-CoV nsp5与抑制剂N3的复合物晶体制备 |
| 第一节 MERS-CoV nsp5的基本信息 |
| 2.1.1 MERS-CoV nsp5的基因序列 |
| 2.1.2 MERS-CoV nsp5的生物化学信息 |
| 2.1.3 MERS-CoV nsp5折叠情况预测 |
| 2.1.4 MERS-CoV nsp5的同源蛋白分析 |
| 2.1.5 小结 |
| 第二节 MERS-CoV nsp5基因的克隆与表达载体的优化 |
| 2.2.1 MERS-CoV nsp5基因的获取 |
| 2.2.2 表达系统的选择 |
| 2.2.3 表达载体的选择 |
| 2.2.4 重组质粒的构建 |
| 第三节 MERS-CoV nsp5重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.1 MERS-CoV nsp5重组蛋白的表达 |
| 2.3.2 MERS-CoV nsp5重组蛋白的纯化 |
| 第四节 MERS-CoV nsp5蛋白的晶体生长与初步数据收集 |
| 2.4.1 蛋白质结晶的基本原理 |
| 2.4.2 MERS-CoV nsp5结晶条件的初步筛选和优化尝试 |
| 2.4.3 MERS-CoV nsp5与N3复合物晶体的生长与优化 |
| 第三章 MERS-CoV nsp5-N3复合物的结构功能研究 |
| 第一节 结构解析原理简介 |
| 3.1.1 相位问题的存在 |
| 3.1.2 常用结构解析方法简介 |
| 第二节 MERS-CoV nsp5-N3复合物的结构解析 |
| 3.2.1 数据收集和处理 |
| 3.2.2 结构解析过程 |
| 第三节 MERS-CoV nsp5与N3复合物的结构分析 |
| 3.3.1 MERS-CoV nsp5与N3的总体结构 |
| 3.3.2 MERS-CoV nsp5与N3的结合情况分析 |
| 第四节 N3分子抑制MERS-CoV nsp5的酶活验证实验 |
| 3.4.1 MERS-CoV nsp5的活性检测原理 |
| 3.4.2 MERS-CoV nsp5的酶活实验方法 |
| 3.4.3 N3对MERS-CoV nsp5的抑制活性 |
| 3.4.4 小结 |
| 第四章 SARS-CoV nsp13的晶体学研究 |
| 第一节 SARS-CoV nsp13的研究进展及意义 |
| 4.1.1 SARS-CoV nsp13的功能研究进展 |
| 4.1.2 SARS-CoV nsp13结构生物学研究的意义 |
| 第二节 SARS-CoV nsp13重组质粒的构建 |
| 4.2.1 SARS-CoV nsp13基本信息分析 |
| 4.2.2 SARS-CoV nsp13表达载体的选择 |
| 4.2.3 SARS-CoV nsp13表达载体的构建 |
| 第三节 pGEX-6p-1-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶尝试 |
| 4.3.1 pGEX-6p-1-nsp13克隆的蛋白表达与纯化 |
| 4.3.2 pGEX-6p-1-nsp13野生型和突变体蛋白结晶尝试 |
| 第四节 pET-28a-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶 |
| 4.4.1 pET-28a-nsp13克隆的蛋白表达与纯化 |
| 4.4.2 pET-28a-nsp13蛋白的结晶 |
| 第五节 pET-28a'-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶 |
| 4.5.1 pET-28a'-nsp13克隆的蛋白表达与纯化 |
| 4.5.2 pET-28a'-nsp13蛋白的结晶 |
| 第六节 pET-28a-6×His-nsp13克隆的蛋白晶体制备与数据收集 |
| 4.6.1 pET-28a-6×His-nsp13克隆的蛋白表达与纯化 |
| 4.6.2 pET-28a-6×His-nsp13蛋白的结晶 |
| 4.6.3 pET-28a-6×His-nsp13蛋白质晶体的数据收集和处理 |
| 第五章 结论 |
| 附录A MERS-CoV nsp5的编码碱基与氨基酸序列 |
| 附录B SARS-CoV nsp13的编码碱基与氨基酸序列 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）SARS冠状病毒nsp10/nsp16蛋白质复合体行使2’-O-甲基转移酶功能的结构和生物化学研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第—章真核生物及病毒RNA 5’端帽子结构形成机制 |
| 1.1 真核生物信使RNA具有5’端帽子结构 |
| 1.2 侵染真核生物的病毒RNA具有5’端修饰 |
| 1.3 mRNA 5’端帽子结构的生物学意义 |
| 1.4 RNA 5’端帽子结构的形成机制 |
| 1.5 RNA 5’端帽子结构形成相关蛋白质的结构生物学研究进展 |
| 第二章 冠状病毒与病毒基因组的复制转录 |
| 2.1 冠状病毒的形态与基因组结构 |
| 2.2 冠状病毒的分类学研究 |
| 2.3 冠状病毒非结构蛋白与病毒基因组的复制转录 |
| 2.4 冠状病毒RNA 5’端帽子结构形成机制的研究进展 |
| 2.5 冠状病毒复制相关蛋白质的结构生物学研究进展 |
| 第三章 蛋白质结构生物学研究方法——X射线晶体学 |
| 3.1 蛋白质晶体的形成过程 |
| 3.2 X射线源的选择 |
| 3.3 蛋白质X射线衍射的机制 |
| 第四章 SARS-CoV 2’-O-甲基转移酶复合体晶体结构解析 |
| 4.1 研究背景概述 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法及原理 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 第五章 SARS冠状病毒2’-O-甲基转移酶催化机制研究 |
| 5.1 研究背景概述 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法及原理 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 第六章 研究总结 |
| 6.1 研究结论及创新点 |
| 6.2 未来研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 图表清单 |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 IBV 致病机制的研究进展 |
| 1.1.1 IBV 的一般分子生物学特性 |
| 1.1.2 IBV 的结构蛋白及功能 |
| 1.1.3 IBV 的感染与复制机制 |
| 1.1.4 IBV 的复制对宿主细胞的影响 |
| 1.2 蛋白质组学概述及其主要技术平台 |
| 1.2.1 蛋白质组学概述 |
| 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术平台 |
| 1.3 蛋白质组学在冠状病毒研究中的应用 |
| 1.3.1 冠状病毒颗粒的蛋白质组学分析 |
| 1.3.2 冠状病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 1.3.3 冠状病毒感染的比较蛋白质组学分析 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人工感染传染性支气管炎病毒鸡胚气管和肾脏的蛋白质组学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与软件 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 病毒感染实验 |
| 2.1.6 IBV 病毒RNA 的提取与基因组N 基因的检测 |
| 2.1.7 双向凝胶电泳分析 |
| 2.1.8 质谱分析 |
| 2.1.9 用荧光定量PCR 在转录水平上分析差异蛋白 |
| 2.1.10 用Western blot 分析差异蛋白的表达水平 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 IBV 感染鸡胚的特征观察和病毒检测 |
| 2.2.2 鸡胚气管和肾脏组织双向凝胶电泳结果 |
| 2.2.3 差异表达蛋白分析结果 |
| 2.2.4 差异表达蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.5 差异表达蛋白的GO 注释分类 |
| 2.2.6 部分差异表达蛋白的转录水平分析 |
| 2.2.7 部分差异表达蛋白的Western blot 验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 人工感染不同毒力传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和软件 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 实验动物分组与病毒感染 |
| 3.1.6 样本采集 |
| 3.1.7 IBV 抗体效价的检测 |
| 3.1.8 气管组织样品的2-DE 分析 |
| 3.1.9 肾脏组织样品的2-DIGE 分析 |
| 3.1.10 质谱分析 |
| 3.1.11 差异蛋白质的GO 注释和相对表达量聚类分析 |
| 3.1.12 部分差异蛋白的 mRNA 水平动态变化分析 |
| 3.1.13 差异蛋白的Western blot 验证 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 动物实验临床观察和血清IBV 抗体检测结果 |
| 3.2.2 不同毒力IBV 毒株感染鸡气管和肾脏组织的蛋白表达变化 |
| 3.2.3 差异表达蛋白的质谱鉴定 |
| 3.2.4 差异表达蛋白的GO 注释分类 |
| 3.2.5 差异表达蛋白的聚类分析 |
| 3.2.6 部分差异表达蛋白的mRNA 水平动态变化分析 |
| 3.2.7 部分差异表达蛋白的Western blot 验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 本论文主要结论 |
| 4.2 本论文创新点 |
| 4.3 尚待进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用（论文参考文献）
- [1]新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析[J]. 戴姿薇,唐标. 微生物学杂志, 2021(01)
- [2]抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究[D]. 万伟玮. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [3]核酸检测在2019冠状病毒病研究中的应用[J]. 宁铁林,郑敏娜. 中国病毒病杂志, 2020(03)
- [4]新型冠状病毒病（COVID-19）研究进展[J]. 朱小丽,黄翠,马丽丽,张超,巩玥,赵婉雨,赵秀芳,郭文姣,彭皓,张吉,梁慧刚. 中国生物工程杂志, 2020(Z1)
- [5]猪流行性腹泻病毒遗传变异规律与Ⅰ型干扰素逃避机制[D]. 孙敏. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]啮齿动物中冠状病毒的分子流行病学研究及登革病毒在非疫区的再现[D]. 王文. 中国疾病预防控制中心, 2017(10)
- [7]SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及研究[D]. 朱云鹏. 天津科技大学, 2016(05)
- [8]MERS冠状病毒主蛋白酶与N3抑制剂复合物的结构功能研究及SARS冠状病毒解旋酶的晶体学研究[D]. 任志林. 南开大学, 2014(04)
- [9]SARS冠状病毒nsp10/nsp16蛋白质复合体行使2’-O-甲基转移酶功能的结构和生物化学研究[D]. 苏测洋. 武汉大学, 2014(06)
- [10]人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析[D]. 曹中赞. 中国农业科学院, 2011(10)