一、用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST（论文文献综述）
孟亮[1]（2014）在《半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选》文中认为半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国特有的优质海水养殖鱼类，其雄性个体比雌性个体小2到4倍，且生长速度也比雌性个体慢很多。另外，半滑舌鳎的性别决定系统为ZZ/ZW型，存在自然性逆转现象。这些原因都导致了在自然养殖条件下雄性比例过高，从而严重阻碍了半滑舌鳎养殖产业的进一步发展。为了提高后代雌性比例，在育种中我们尝试用半滑舌鳎伪雄鱼为父本，结果却发现伪雄鱼后代中的雌性比例并没有提高。因此我们检测了伪雄鱼精子的基因型，发现只有Z型精子而没有W型精子。结合半滑舌鳎基因组测序结果发现，W染色体虽然比Z染色体大很多，但携带的基因数目却远远少于Z染色体，所包含的遗传信息也少很多。本文对3个半滑舌鳎Z染色体特异的、与精子发生相关的基因进行了初步的研究，推测了这些基因在精子发生过程的功能，为揭示半滑舌鳎W型精子缺失的原因，及高雌乃至全雌育种提供理论依据。主要结果如下：1.克隆得到了半滑舌鳎tesk1全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征，结果表明：tesk1在半滑舌鳎精巢中的表达最高，在脑、肝脏、肾脏中有少量表达；在正常雄鱼和伪雄鱼精巢中表达，而三倍体雄鱼的精巢中不表达；在116天前几乎不表达，5个月开始表达，1年时表达急剧上升并达到最大。原位杂交结果表明，tesk1主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。因此我们推测，tesk1可能在精子形成阶段起作用。通过染色体原位杂交将该基因定位到了半滑舌鳎Z染色体上。通过Genome Walking获得了部分上游调控序列，通过分析发现了HSF、SRY、C/EBP、CRE-BP等转录因子结合位点。甲基化分析表明，该基因的表达水平与甲基化水平没有关系。2.克隆得到了半滑舌鳎neurl3全长cDNA序列和基因组序列。利用定量PCR检测了该基因的表达特征，结果表明：在半滑舌鳎各组织中，精巢的表达量最高；在孵化后116天，开始大量表达并达到最高。原位杂交结果表明，neurl3主要在半滑舌鳎精巢中的精子细胞和成熟精子中表达。染色体原位杂交结果表明，neurl3位于半滑舌鳎Z染色体上。成功构建了原核表达载体，通过IPTG诱导，能够表达出大小符合预期分子量的蛋白。3.获得了半滑舌鳎strbp的全长cDNA序列和基因组序列，利用Real-timePCR检测了半滑舌鳎strbp在转录水平的表达情况。发现该基因主要在成熟半滑舌鳎的性腺中表达（精巢和卵巢都有表达），虽然在脑和脾脏中也检测到了该基因的表达，但与性腺相比要低很多。原位杂交结果表明半滑舌鳎strbp主要在精子细胞变态开始形成精子的阶段大量表达，可能在这一时期发挥一定的作用。大菱鲆（Scophthalmus maximus）是从欧洲引进的优良海水养殖鱼类。频繁暴发的疾病严重影响了大菱鲆养殖产业的发展。使用药物能够减少疾病造成的损失，但药物不但使病原菌产生抗药性，更为重要的是，药物残留也会造成环境污染以及对人类健康造成威胁。因此，利用分子生物技术来提高养殖鱼类的抗病力势在必行。我们构建了大菱鲆脾脏和头肾cDNA文库，2个文库的库容分别达到2.26x106和1.45x106。通过测序共获得了3656条EST序列，经生物信息学分析，鉴定了149个新的大菱鲆基因，其中免疫抗病相关的基因45个，均首次在大菱鲆中被发现。
丁玲[2]（2013）在《东北梅花鹿茸生长期顶端组织差异表达基因的筛选和鉴定》文中指出鹿茸是哺乳动物中惟一能够再生的组织器官,因此鹿茸为哺乳动物组织器官再生的研究提供了独特的模型。研究已表明鹿茸发育属软骨内成骨,其再生基于干细胞而不涉及细胞的去分化；在鹿茸生长过程中,细胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因的表达调控；但其再生及其生长发育的分子机制迄今还并不十分清楚。本试验采用mRNA差异显示PCR技术筛选东北梅花鹿茸生长过程中小鞍子（前期）、二杠茸（中期）和三权茸（后期）顶端间充质组织的差异表达基因片段,共获得45条鹿茸生长过程中差异表达片段,回收了15条,其中14条克隆测序,经Blast比对发现5条序列（EST1、EST2、EST3、EST4和EST5）分别与已知基因（COL9A3、MALAT1、 LOX、BCLAF1）高度同源,EST3与EST5来源于LOX基因,其它序列在数据库中均无同源基因。采用实时定量PCR进一步检测LOX基因表达水平,与mRNA差异显示结果基本一致。本试验初步发现：COL9A3在鹿茸生长前期不表达,后期的表达量大于中期；MALAT1在鹿茸生长中期表达量最高,前期至中期表达上调,中期至后期表达下调；LOX在鹿茸生长中、后期的表达量大于前期；BCLAF1只在鹿茸生长的后期表达。实时定量结果显示：鹿茸间充质生长的3个时期,LOX mRNA表达水平呈上调趋势,中期表达量最高,显着高于前期（P<0.05）,后期与前期、中期差异均不显着（P>0.05）,提示该基因参与鹿茸间充质前期至后期的生长,推测其可能促进了间充质细胞的快速增殖,协同其它因子使胶原蛋白与弹性蛋白形成分子间的交联,稳定细胞外基质,保持细胞外内环境稳定。
孙新菊[3]（2012）在《萝卜CMS育性相关基因分离鉴定与表达特征分析》文中研究指明萝卜（Raphanus sativus L.）是一种重要的根菜类蔬菜作物,在我国栽培历史悠久,分布广泛。萝卜不仅营养丰富,而且具有较高的药用食疗价值,深受人们喜爱。细胞质雄性不育是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状,育性由核基因恢复。萝卜的杂种优势明显,利用雄性不育进行杂交种生产是主要的育种方式,因此培育大量优良CMS（cytoplasmic male sterility,细胞质雄性不育）雄性不育系是广泛、高效利用萝卜杂种优势的前提。萝卜雄性不育胞质已成功转育到芸薹属多种作物如油菜、甘蓝、白菜中,是十字花科植物最受关注的不育胞质之一。然而萝卜胞质鉴定的技术体系和分子标记辅助选择候选保持系的技术体系尚未建立,雄性不育产生的机理至今尚未完全阐明。有鉴于此,本研究从形态、细胞、遗传及分子生物学方面对萝卜CMS胞质不育和恢复基因的特征进行研究,以及从基因差异表达水平入手分析花粉发育的特征和分子调控机制,并对相关差异表达基因进行克隆与特征分析。取得的主要研究结果如下：（1）应用鉴定不同胞质类型的特异引物MSF1/R1, LwnomalF/R, LwNWBF/R, KOSF/R和LwDCGMSF/R对80份萝卜自交系与不育系配制的组合以及20个商业品种进行扩增。根据扩增条带,将萝卜胞质分为Ogura, DBRMF1, DBRMF2, NWB, DCGMS,交叉型以及新胞质7种类型。其中大多数材料（65份）是Ogura类型；8份材料是DBRMF1类型；7份材料是DBRMF2类型；10份材料是NWB类型；5份材料是DCGMS类型；3份材料是交叉型,以及2份材料是新胞质类型。细胞学观察发现不同胞质不育系的败育方式相似,在四分体之前不育系小孢子发育没有发生异常,四分体时期绒毡层细胞膨大液泡化,致使后续的花粉发育各过程受阻,最终不能形成花粉而引起败育。（2）萝卜恢复系NAU-RsWR1的Rs-Rfl基因编码687个氨基酸,包含16个PPR重复序列。应用RT-PCR和qRT-PCR分析了恢复系NAU-RsWR1的不同时期、不同器官中Rs-Rf1基因的表达特征,以及分析了在恢复系NAU-RsWR1、不育系NAU-RsWA1、保持系NAU-RsWB1和F1不同发育时期（减数分裂,四分体,小孢子）的花蕾中Rs-Rf1和orf138基因的互作模式。结果显示Rs-Rf1基因在根、茎、叶、花柄、花蕾中都有表达,不过根中表达量较弱；花期各器官的表达量较蕾期的要高。Rs-Rf1基因在恢复系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在恢复系中的表达量要高于Fl,而在不育系和保持系中不表达；orf138基因在不育系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在不育系中的表达量要高于F1,但在恢复系和保持系中不表达。分别从5个不同的恢复系和保持系中进行恢复基因的分离克隆和测序分析,应用"DNAStar GeneQuest enzyme-restriction map"软件分析发现限制性内切酶SspI在Rs-Rf1和Rs-rf1基因中酶切位点不同,经SspI酶切与聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测,若有2个酶切位点（产生3个酶切片段,大小分别为1,538、629、363bp）,则表明该自交系携有育性恢复基因；如果仅有1个酶切位点（产生2个酶切片段,大小分别为2,167、363bp）,表明该自交系是保持系。本研究开发的利用分子标记辅助选择萝卜候选保持系的方法,可以快速准确地选择出优良候选保持系,从而提高萝卜优良CMS雄性不育系的选育进程,为大规模优良不育系快速培育提供有力技术支撑。（3）在获得稳定的萝卜胞质雄性不育系NAU-RsWA1和保持系NAU-RsWB1材料体系的基础上,采用mRNA差异显示聚合酶链式反应技术（DDRT-PCR）研究两个材料花粉发育减数分裂、四分体和小孢子3个时期基因的表达差异,获得了90条阳性差异转录片段（transcript derived fragments, TDFs）;其中在保持系NAU-RsWB1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有60条,在不育系NAU-RsWA1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有30条。将差异片段回收、克隆、测序,在GenBank数据库中进行同源序列比对和功能预测,差异表达的基因涉及细胞壁合成与调控、花粉发育,防卫与胁迫反应、电子传递和能量途径、普通新陈代谢、蛋白质代谢、信号转导、转录调控和转运通道等方面,其中39%的差异表达基因功能未知或无相似序列。对22条在不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行时空表达模式分析,发现大多数差异片段所代表的基因在不育系和保持系的不同器官（雄蕊,花瓣,叶,茎）和花粉发育的不同时期（减数分裂,四分体,小孢子时期）的表达不尽相同。（4）利用DDRT-PCR筛选得到了花粉发育相关的差异片段所代表的基因（PCP,Bnm, TCTP, Rac）,利用同源克隆得到这些基因的DNA和cDNA全长,分别命名为RsPCPl, RsPCP2, RsBnm, RsTCTP和RsRac,并对它们的氨基酸序列和表达特征进行研究。利用RT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果表明,RsPCPl, RsPCP2, RsTCTP和RsBnm基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,但表达强弱不同,在不育系花蕾发育的3个时期都不表达或表达量很弱；这些基因在保持系的雄蕊和茎中表达,除了RsPCP2基因在不育系的雄蕊中检测到较弱的表达外,其它基因在不育系不同组织中都不表达。RsRac基因在不育系3级花蕾中的表达先降低再升高,在保持系3级花蕾中都不表达；该基因在不育系的雄蕊、花瓣、叶、茎中均表达,在保持系不同组织中都不表达。（5）利用DDRT-PCR分析筛选得到了在保持系3级花蕾中微弱表达但在不育系花蕾中高表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsBHLH。该基因编码336个氨基酸,具有basic helix-loop-helix （bHLH）结构域；进化分析表明,RsBHLH与AtBHLH060同源性很高,是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果显示其在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达,且在雄蕊中表达量最高。同不育系相比,RsBHLH在保持系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达,但在花蕾发育的3个时期中有较弱的表达。（6）利用DDRT-PCR分析筛选得到了一个在保持系3级花蕾都稳定表达且表达量很高,但在不育系小孢子时期的花蕾中有微弱表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsCHS。该基因编码392个氨基酸,具有CHS结构域；进化分析表明,RsCHS与油菜CHS氨基酸序列一致性最高,达到95%,其次与拟南芥CHS的一致性达到93%。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,发现该基因在保持系雄蕊、花瓣以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达。（7）利用DDRT-PCR分析筛选得到两个与细胞壁合成和调控相关的基因RsPMEI和RsPG.采用同源克隆法得到cDNA全长。RT-PCR和qRT-PCR分析表明RsPMEI基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,且表达量都很高；在不育系花蕾发育的减数分裂时期和四分体时期有少量的表达,但在小孢子时期不表达；RsPMEI基因在保持系雄蕊中表达量最大,在叶中次之,花瓣中表达量最弱,茎中不表达,该基因在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。RsPG基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,并且随着发育时期的推进,表达量呈上升趋势,该基因在不育系花蕾发育的3个时期都不表达；RsPG基因在保持系和不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。
张伟[4]（2012）在《中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库构建和Dmcl基因的克隆与序列分析》文中研究指明中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）.又称河蟹,属于甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）,是我国重要的水产养殖经济品种,养殖规模逐渐的扩大。近年来,随着集约化程度的提高,出现的性早熟现象导致了成品蟹的品质严重的下降,制约了制约了中华绒螯蟹的养殖业的发展,导致经济产值下降。因此,本论文试图从分子生物学的角度初步探讨究中华绒螯蟹的生殖调控机制,为将来从分子水平解决性早熟提供坚实的理论基础和基因组资料。本研究利用分子生物学、生物信息学的技术手段,首次构建了中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库的构建,并对得到的表达序列标签（EST）进行了分析,筛选出了许多与雄性生殖调控相关的基因序列,也丰富了中华绒螯蟹的基因组资料。在此基础上,通过cDNA末端快速扩增（RACE）和实时定量PCR等技术进一步对Dmcl基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华绒螯蟹雄性生殖的分子机制提供了研究基础。主要研究结果如下：1为了研究中华绒螯蟹精巢发育过程中储存的遗传信息,以精巢为材料构建了cDNA文库,文库的重组率为81.3%,库容量为3.5×106,插入片段大小为0.5-2kb。随机挑取了3,338个克隆进行5’-端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到2,990条高质量EST序列,这些序列的平均长度为561bp。经拼接后获得了2,415条unique序列,包括307条重叠群（Contig）和2,108条单一序列（Singleton）。通过比对发现有922条Unique序列被注释。据序列相似性分析,发现了Dmcl、Vasa和HSP70等30个与生殖、发育相关的基因。通过精巢cDNA文库的构建及ESTs分析,初步明晰了与河蟹精巢发育相关的基因,为进一步研究中华绒螫蟹乃至十足类的功能基因组提供了重要的基础资料。2根据获得的Dmcl基因的EST序列,利用RACE技术克隆得到了中华绒螯蟹Dmcl基因cDNA全长序列。生物信息学分析发现,该序列全长为1,360bp,包括96bp的5’-末端非转录区（5’-UTR）,1,026bp的开放阅读框（ORF）和238bp的3’-末端非转录区（3’-UTR）,共编码341个氨基酸。分析表明该cDNA推导的氨基酸序列与甲壳类动物的同源性最高,和其它动物Dmc1蛋白序列也具有较高的同源性；Dmc1含有两个嘌呤核苷酸的结合位点（motifs A and B）和DNA结合区（L1and L2）,与已报道其它物种的研究的结果一致；系统进化分析进一步的证实了该基因的保守性,与其它甲壳纲动物的亲缘关系最近,依次与其它相近物种进行聚类,符合了生物进化的特征。利用RT-PCR技术对中华绒螯蟹Dmcl组织特异性及其表达特征进行分析,发现在Dmcl基因在精巢中表达量最高,在卵巢、副性腺和血细胞中有微量表达,在心脏、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、胸神经节这几种组织中几乎不表达。采用实时荧光定量PCR技术检测河蟹Dmcl基因在精巢发育前期、中期、后期及末期四个不同发育阶段的表达丰度,结果表明Dmcl基因在前期的表达丰度最高,其次是中期和后期,在末期表达量最低。3采用抑制性差减杂交技术（SSH）,分别以中华绒螯蟹发育前期精巢为检测方（tester）,发育后期精巢为驱动方（driver）构建正向差减文库；以发育后期精巢为检测方（tester）,发育前期精巢为驱动方（driver）构建反向差减文库。两个文库分别包括850个和700个cDNA克隆,重组率在90%以上；插入片段在250-1500bp之间。该河蟹精巢差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明河蟹的雄性生殖调控机制奠定了基础。
刘娜[5]（2012）在《菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）在苯并（a）芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究》文中研究指明本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状，以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）为研究对象，克隆了菲律宾蛤仔芳烃受体介导的解毒代谢途径几种关键基因，包括芳烃受体蛋白（AhR）、芳烃受体核转位因子（ARNT）、热休克蛋白90（HSP90）。研究了毒性最强的多环芳烃（PAHs）——苯并（a）芘（BaP）对菲律宾蛤仔组织解毒代谢相关基因的表达调控规律，通过对在BaP胁迫下菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因的克隆及基因表达分析，探究双壳贝类PAHs解毒代谢机制；构建了菲律宾蛤仔PAHs消减cDNA文库，筛选、鉴定了差异表达基因，结合室内实验和海区现场验证，初步建立了基于菲律宾蛤仔的PAHs分子生物标志物监测技术，为海洋环境污染监测和水产品安全评价提供基础数据和技术支持。1菲律宾蛤仔芳烃受体（AhR）介导的关键基因克隆与表达分析菲律宾蛤仔芳烃受体蛋白（VpAhR）的cDNA全序列长2870bp，开放阅读框（ORF）长为2391bp，共编码796个氨基酸残基，不具备信号肽，属于胞内蛋白，含有2个核定位序列（NLS）：K45RRRR49和P67SKRHRE73。BLAST分析表明VpAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性。VpAhR含有1个碱性螺旋-环-螺旋结构（bHLH domain）和2个配体结合区（PAS domain），属于bHLH-PAS转录因子家族。序列分析显示，VpAhR的配体结合区（a.a.220–383）与砂海螂（M. arenaria）和斑马纹贻贝（D. polymorpha）AhR的配体结合区相似性很高。实时定量PCR分析表明VpAhR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、外套膜和闭壳肌中均有表达，鳃组织中表达量最高。菲律宾蛤仔ARNT片段长485bp，编码161个氨基酸残基，该序列含一个由44个氨基酸构成的PAS结构域（a.a.7-50），该区域与其他物种ARNT的PAS结构域相似性较高；VpARNT在菲律宾蛤仔消化盲囊中表达最高，在鳃、外套膜和闭壳肌中也均有分布。HSP90是分子伴侣家族的重要一员，菲律宾蛤仔的HSP90基因片段cDNA长687bp，编码299个氨基酸，具有HSP90家族保守信号区（GVVDSEDLPLNISRE），与其他物种HSP90氨基酸序列具有很高相似性，与栉孔扇贝（C. farreri）和海湾扇贝（A. irradians）的相似性均为99%，菲律宾蛤仔HSP90在鳃组织中表达量最高；不同浓度BaP（0.01、0.2μg/L）染毒处理3d、10d，菲律宾蛤仔鳃组织中AhR、ARNT、HSP90和谷胱甘肽硫转移酶（GSTpi）的基因表达水平随染毒浓度增大和处理时间延长而逐渐升高；除10d时0.2μg/L组细胞色素P4504（CYP4）基因表达被极显着（P＜0.01）上调外，其余处理组CYP4mRNA表达水平在染毒期间与对照组差异不显着（P＞0.05）。实验结果表明，BaP与AhR介导的菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的mRNA表达具有明显的剂量—效应关系，符合生物标志物筛选原则，适于进行进一步的分析和现场验证。2菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下cDNA消减文库的构建与分析利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了BaP（1μg/L）胁迫下菲律宾蛤仔正、反向cDNA消减文库，分别获得194个和93个重组克隆，测序分析显示，正、反向文库分别得到168个和83个EST序列，经同源序列相似性比对，正向cDNA文库中有31种基因与已知功能基因具有较高同源性，12种为假定蛋白，2种为未知蛋白；反向文库中已知功能基因10种，假定蛋白4种。所有ESTs序列信息均已提交Genbank数据库，cDNA消减文库编号为LIBEST027169。进一步序列比对、功能注释及分类显示，通过SSH筛选到的菲律宾蛤仔差异表达基因主要为药物代谢、杂环化合物代谢、细胞分解代谢、抗生素响应等代谢过程相关基因。3菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证设置一系列BaP染毒浓度（0.25、1和4μg/L），利用实时定量PCR检测染毒处理10d时菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因、SSH-selected差异表达基因及几种其他功能基因的mRNA表达。结果显示，测定的28种基因中Defensin、Serine protease、Thioesterprotein、GST C、Mn-SOD、ARNT等12种基因被BaP诱导表达上调，且与染毒浓度呈线性正相关关系，因此适于作为潜在的分子生物标志物进行进一步研究与验证。在胶州湾和胶南附近海域各选择一个实验站点（S1和S2），于2011年12月采集各站点表层海水及菲律宾蛤仔样品。高效液相色谱法（HPLC）测定海水中PAHs含量和菲律宾蛤仔软体部中PAHs的累积量。结果显示，S1站点海水和菲律宾蛤仔组织中的总PAHs和BaP含量均高于S2站点；实时定量PCR分析表明，除HSP90和AhR外，PAHs含量较高的S1站点的其余10种分子生物标志物基因表达水平明显高于S2站点，表现出一定的剂量—效应关系。由此表明，菲律宾蛤仔12种基因基本符合生物标志物筛选原则，适于作为分子生物标志物用于海洋环境PAHs污染监测及毒性效应评估。
卢立志[6]（2011）在《鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析》文中指出禽类的产蛋率,除了其他方面外,取决于等级前卵泡能被有效地募集进入等级卵泡,即通过卵泡的生长和闭锁建立卵泡等级。随着日龄的老化产蛋率的下降归因于卵泡闭锁的增加以及可供选择进入最后生长阶段（最大等级卵泡／排卵前卵泡）的小/生长卵泡数量减少。对人和哺乳动物巢卵泡发育研究表明,卵泡的生长和分化是多因素调控的复杂的生理生化过程,不仅受生殖轴内分泌激素的调控,而且卵巢中许多局部的生长、分化因子也以自分泌或旁分泌等形式发挥重要作用。目前,对于禽类卵泡发育的研究,虽然已经知道一些基因在不同发育阶段的卵泡中差异表达,但是对于复杂生命体而言,仅仅是其中很小部分,仍然没有合理假说来说明禽类卵泡等级的建立机制。通过筛选鸭卵泡差异表达的基因,比较不同发育阶段卵泡的差异表达基因,可以对这些差异基因在卵泡发育和分化过程中所发挥的作用有更深入的了解。揭示卵泡在不同生理状况下差异基因的表达情况,为进一步研究禽类性成熟、产蛋的启动、产蛋的维持和高产性能的分子生物学机制提供重要资料,并为最终揭示禽类卵泡发育和等级建立的分子机制,从而在基因水平上进行遗传操作,延长产蛋高峰期,提高鸭的产蛋率提供理论依据。本实验以产蛋高峰期绍兴鸭母鸭不同阶段的卵泡为实验材料,采用DSN酶介导的均一化消减杂交方法构建鸭卵泡差异表达基因的消减cDNA文库,以期找到与鸭卵泡发育相关的基因,探索卵泡等级建立与分化的基因表达调控的分子机制。本实验构建了两个鸭卵泡差异表达基因的双向消减文库：以最大等级卵泡和等级前卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,等级前卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以等级前卵泡为Tester最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集。正向消减文库中获得了88条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中60条具有同源基因,28条相似度极低或无同源性的基因。筛选出与卵泡发育相关基因LHR和EGFR,与细胞增殖和分化有关的基因SLC家族等,影响胚胎发育的NADH1α脱氢酶同源基因NADH1β几个编码激酶或其同源基因如PRKG2、 AKAP2、similar to protein kinase D1。此外,筛选到我们还分离了一些未知功能的基因。反向消减文库中获得了72条独立的差异表达的基因,BLAST比对结果显示,其中51条具有同源基因,21条无相似或者同源性极低的基因。筛选出的基因有RBMII,拼接因子SF2亚单位p32和U2AF35kDa subunit-like, tensin基因,真核生物翻译起始基因EIF3I,微管组分基因α-tubu1in,肠平滑肌肌动蛋白gamma2,含靶蛋白同源基因similar to palladin,免疫反应相关基因CD58,编码微小染色体维持蛋白的基因MCM5, RCC2,参与细胞侵袭和转移的基因Flotillin-2,酶类（包括激酶）及其同源基因AFG3ATPase f ami ly gene3-like2、AK3L2、TAOK3等基因。另外,我们还分离了一些未知功能的新基因。以最大等级卵泡和最小等级卵泡这两个不同发育阶段的卵泡为实验材料进行消减杂交。其中,以最大等级卵泡为Tester,最小等级卵泡为Driver,建立的为正向消减文库；以最小等级卵泡为Tester,最大等级卵泡为Driver建立的为反向消减文库。实验过程中,总RNA与反转录成的cDNA质量较好,消减产物得到很好的富集,正向消减文库中获得了79条独立的差异表达基因,BLAST比对结果显示,其中67条具有同源基因,12条无相似基因或者同源性极低的基因；筛选出与卵泡发育相关基因EGFR,与排卵有关的基因ADAMTS-1影响脑神经系统和胚胎发育的编码钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶基因、免疫相关基因lymphocyte antigen86-like和IL17RA,参与细胞调亡的基因death domain-containing tumor necrosis factor receptor superfamily member23,骨成形蛋白2基因。分离了一些编码通道或转运有关蛋白的基因及其同源基因sodium/myo-inositol cotransporter-like、calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase、 SLC9A8、potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member2、 SLC2A1、PCTP等。除上述基因外,还筛选到RNF14、TTC17、PHF21A、PLEKHB2、 ADD3、RGS12、SVEP1、HDAC4、STOM、SMARCE1、SETD4、CEBPG、STRADA、ZC3H14、 RHOBTB1、ALDH1A2、EXOC2和GAPVD等基因。反向消减文库中获得了37条独立的差异表达的基因,比对结果显示,其中29条具有同源基因,8条无相似或相似度极低的基因。反向文库中筛选出的基因主要包括RBMII、微管组分基因α-tubulin lc、 CD58、真核生物翻译起始基因EIF3I以及编码微小染色体维持蛋白的MCM5基因。
陈建军[7]（2011）在《黄河鲤性别特异片段的鉴定与性腺差异cDNA文库的构建及相关ESTS功能分析》文中指出本研究以黄河鲤为实验材料,选择220条10bp的随机引物、10对SSR引物及100条ISSR引物,利用RAPD-PCR、SSR-PCR及ISSR-PCR三种分子标记技术对黄河鲤基因组进行扫描,试图发现一些与黄河鲤性别相关的连锁标记。SSR结果显示,虽然在对其DNA池进行扫描的过程中,在1对引物的扩增谱带上发现了1条可能与性别连锁的疑似条带,但当利用这对引物在更多的个体中验证时,没有发现其性别特异性;而ISSR结果表明,在所有筛选出来的10条引物的扩增谱带上,未发现与性别连锁的疑似条带。利用RAPD技术对黄河鲤雌、雄基因池进行扫描的结果表明,其中的5条随机引物的扩增谱带中有疑似性别特异条带的存在,利用这5条随机引物在个体中进行反复验证,只有随机引物S2107的扩增产物中存在一条稳定的雄性特异条带。经回收、克隆、测序后获得了一条大小为909bp的候选雄性特异条带,命名为Ccmf1。BLAST检索发现该片段与位于斑马鱼连锁群1的一段重复序列（DKEY-24 H 22）有一定的相似性。此外,本研究还利用抑制性消减杂交技术,成功构建了黄河鲤鱼基因组DNA的消减文库,随机挑选150个克隆经巢式引物PCR验证后,获得88个阳性克隆,以正、反向二次PCR产物为探针,与88个阳性克隆质粒DNA进行Southern dot blotting杂交,从中挑选了22个候选性别特异阳性克隆进行序列测定,经特异引物的PCR验证后,获得了两个长度分别为387bp和183bp雄性特异的DNA片段,BLASTN和BLASTX检索未发现与其同源的核苷酸和氨基酸序列,将其命名为Ccmf2和Ccmf3。根据3个雄性特异片段的序列分别设计特异引物,以管家基因GAPDH为内部对照,雌雄个体基因组为模板进行特异PCR扩增。结果表明,在所有的雄性个体中均扩增出了稳定的目的特异性条带,而雌性个体中没有该条带的出现。由于分离到的三个片段都与雄性性别连锁,所以推测黄河鲤的染色体类型应该为XX/XY型。为了进一步了解三个片段的性别特异性,利用特异PCR技术对100个黄河鲤的雌、雄基因组进行了验证,结果发现,Ccmf1和Ccmf2的性别特异性分别为99%和98%;Ccmf3的性别特异性达到了100%,故3个雄性特异片段在两染色体（性染色体和常染色体）间的重组值都很低,可以用于黄河鲤的遗传性别的鉴别。分别以Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3为探针,与鲤鱼的其他三个品种:野生黄河鲤、建鲤以及丰鲤的基因组进行斑点印迹杂交（雌、雄各5尾）,以期判断这3个性别特异片段的分子性别有效性（即雌雄鉴别的效率）。结果发现,在雌性个体中,Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3的分子性别有效性分别为67%,80%和93%;而在雄性个体中,其分子性别有效性分别为67%,100%,和73%。充分说明在鲤鱼不同种间性染色体的分子类型的多样性。3个雄性连锁标记的发现与鉴定,能够作为鉴别黄河鲤遗传性别以及识别该鱼种性染色体的分子切入点,从而为探讨该物种性别决定及分化机制提供依据。为了更加全面的了解黄河鲤性腺发育机制,本研究还从mRNA水平上,分别以精巢与卵巢互为验证方,成功构建了黄河鲤成熟期雌、雄性腺的双向差减文库,经菌液PCR对文库进行初步筛选,分别获得了280个（来自雄性文库）和240个（来自雌性文库）含有插入片段的阳性克隆;然后利用Southern dot bltting对随机挑选的180个克隆（雌、雄各90个）在正、反杂交膜上进行了鉴定,从中找到了64个（其中来自雄性文库21个,雌性文库43个）候选差异表达克隆,经序列测定后,通过BLASTN和BLASTX对这些候选差异基因片段进行功能分类,得到了50个ESTS序列。其中雄性文库的18个差异ESTS中,包括14个已知功能的和4个未知功能的基因片段。按照其功能,14个ESTS分属于结构蛋白基因、蛋白质翻译机制相关基因、离子通道和蛋白转运基因、肿瘤相关和肿瘤抑制因子及其他基因等;而来自雌性文库的32个差异ESTS代表了27个已知功能基因和5个未知功能的基因,在已知功能基因中,出现频率较高的是来自呼吸链上的相关基因片段,以及与蛋白合成有关的基因片段;除一些未知功能蛋白外,其他的则出现了1次。参照斑马鱼及其他脊椎动物基因功能分析,雌性文库中已知功能EST分属调节因子、结构蛋白、酶类、转录因子、信号调控等。根据部分同源基因在黄河鲤精、卵巢中的半定量表达情况,在雄性差异文库中找到10个差异表达基因片段:5个为精巢特异表达基因;5个为精巢高效表达基因;其中包括2个首次发现的未知功能基因。在雌性差异文库中找到8个差异表达基因片段:2个为卵巢特异表达基因;6个为卵巢高效表达基因,其中包括1个未知功能基因。根据各基因片段的性质及编码功能,选择了可能参与性腺发育的3个基因片段,利用RACE技术对其全长进行了扩增,分别获得了大小为2173bp、1763bp以及884bp的全长基因,他们分别是Hmwt1a基因、HmSetd6基因以及HmPsmb2基因。最后,通过在成体不同组织的半定量和荧光定量表达模式分析,发现这3个基因均为性腺差异表达基因,其中Hmwt1a基因主要在精巢中表达,HmSetd6基因则主要在卵巢中表达,且表达量远远高于精巢,而HmPsmb2基因则是卵巢特异表达基因;通过与脊椎动物性腺发育相关基因功能的对比,推测Hmwt1a基因可能是黄河鲤雄性性别发育的重要调控基因;Hmsetd6基因则作为表观调控基因参与了黄河鲤雌性性状的发育;而HmPsmb2基因是在生理上或行为上维持黄河鲤雌性性别的性别偏向基因;这些基因的发现及相关性腺差异表达EST文库的构建,将对了解黄河鲤性腺发育及性别分化的分子机制奠定基础,同时为黄河鲤性别控制机制的研究提供丰富的基因鉴定资源。
顾朝辉[8]（2010）在《生物信息挖掘新基因预测平台的建立与TSEG-3的克隆和功能初步研究》文中研究说明第一部分：生物信息数据挖掘新基因预测平台的建立摘要目的：依据最新生物信息学数据库和数据挖掘技术,充分挖掘现有生物数据库内蕴含信息,建立基于生物信息和数据挖掘技术的新基因克隆和功能预测平台。方法：首先,通过检索词从dbEST数据库检索,下载研究相关目标序列,将所选序列进行Blast分析,比对出相应的Unigene同源簇,下载上述同源簇或通过数字差异显示工具NCBIDDD检索组织特异性Unigene同源簇；其次,通过Biolign软件进行EST clusters的拼接、延伸和组装,应用Blast检索程序进行EST clusters拼接的contigs序列基因组相似性分析,校正contigs组装产生的误差；第三,应用Genscan程序分析基因组同源序列的编码区（CDS）；第四,DNAssist预测上述CDS序列的开放阅读框（open reading frame, ORF）;最后,Premier 5.0设计针对每个ORF的对应引物。结果：通过数字差异显示工具分析RIKEN full-length enriched mouse cDNA library和Epididymis cDNA library间的表达序列标签的差异序列,得到一个在RIKEN full-length enriched mouse cDNA library高丰度表达的同源簇Mm.5168,下载其对应的同源簇为UGID:258077;进行后续EST组装、延伸和contigs序列校对,同时预测基因组同源性编码区和开放阅读框,并设计相应的引物。结论：生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测平台能有效的发现组织特异性Unigene同源簇,为未知新基因的克隆和功能预测提供了很好的方向。第二部分：小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3的克隆、组织定位及表达谱分析目的：应用生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测平台,预测可能参与睾丸精子发生和男性不育相关睾丸基因,并通过实验验证预测的准确性。方法：首先,利用数字差异显示工具Digital Differential Display检索与EST片段BY706707.1的同源簇,按前文提出的生物信息数据挖掘新基因克隆和功能预测流程,预测出一个新的编码区序列；其次,通过RT-PCR验证,证实其确实存在于成年小鼠睾丸；第三,通过T／A克隆,进行测序分析其与设计序列的一致性和同源性,验证了新基因预测平台的可靠程度；通过原位杂交分析分析TSEG.3表达的细胞类型,同时以用Northern blotting分析转录本大小和RT-PCR分析TSEG-3多器官和不同发育阶段表达谱序列。结果：成功从小鼠睾丸组织中扩增出TSEG-3,测序结果与预测结果一致,将基因序列提交Genbank数据库,获得Genbank登录号：EU477370（GI：186892498）,命名为睾丸特异表达基因3（TSEG-3）。原位杂交结果显示TSEG-3表达于精原细胞、少量精母细胞和精子细胞等,Northern Blotting印迹证实转录长度为1023bp左右,小鼠TSEG-3多组织表达谱分析显示TSEG-3特异地表达于睾丸组织,在出生后2月龄时达到表达峰值。结论：TSEG-3是睾丸特异性表达基因,具有发育阶段特异性特征,可能参与小鼠生精过程,深入研究TSEG-3的功能有助于阐明精子发生机制和男性不育机制。第三部分：小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3生物信息学分析及TSEG-3多克隆抗体制备与鉴定目的：应用生物信息数据挖掘工具,进行TSEG-3蛋白生物信息学分析,为进一步研究TSEG-3蛋白的功能提供必要方向。方法：应用序列信息挖掘软件,分析TSEG-3蛋白质物理特性、疏水区域和亲水区、跨膜区、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、拓朴树分析、特异性磷酸化位点、抗原位点及肽段、亚细胞定位及TSEG-3蛋白功能注释；设计TSEG-3抗原多肽并合成多肽,制备抗TSEG-3蛋白血清,Western Blotting鉴定TSEG-3蛋白分子量大小。结果：通过序列分析显示TSEG-3位于第17号染色体17A3.3区,有六个外显子组成。TSEG-3属于DFU634家族基因,在TSEG-3的5’侧翼区域有六个启动子序列；miRNA检索发现16个可能相关miRNA;并在TSEG.3第277AA.285AA预测出一个非稳定区段（disordered regions）序列为：QSLHEALFG；TSEG-3属于非跨膜蛋白,47.8%可能胞质的：21.7%定位于细胞核；理论等电点为7.15.吸光系数为23680；具有10个丝氨酸（Serine）位点,3个酪氨酸（Tyrosine）位点,在第211到221间存在一个PKC位点,第28氨基酸残基处为信号肽区,第65个氨基酸为一个精氨酸／赖氨酸前肽切割位点（Arg（R）／Lys（K））等；TSEG-3蛋白预测理论分子量为38,52976KD和Western Blotting检测结果一致；功能预测提示TSEG-3可能参与生殖细胞的分化和凋亡。结论：生物信息数据挖掘工具为新基因TSEG-3功能研究提供了丰富的研究内容,极大减少了TSEG-3功能研究的盲目性,加快了基因功能鉴定的速度。第四部分：过表达TSEG-3基因对小鼠精母细胞系GC-2 spd增殖、凋亡的影响目的：探讨TSEG-3过表达对小鼠精母细胞系GC-2 spd（ts）的增殖和凋亡的影响。方法：通过构建pEGFP-TSEG-3载体和体外培养小鼠精母细胞系GC-2 spd（ts）,观察融合蛋白EGFP-TSEG-3的亚细胞定位；采用MTT法检测TSEG-3过表达对GC-2spd（ts）细胞增殖的影响；应用流式细胞仪分析TSEG-3过表达对GC-2 spd（ts）细胞周期的作用；AO/EB双重染色法、Hoechst 33258/PI双染、Annexin V/PI双染法和JC-1染色分析TSEG-3过表达对GC-2 spd（ts）细胞凋亡率的影响；Real-Time RT-PCR分析TSEG-3过表达对凋亡相关蛋白的影响。结果：融合蛋白EGFP-TSEG-3定位于细胞核,MTT法结果提示TSEG-3过表达抑制GC-2 spd（ts）细胞增殖；TSEG-3过表达诱导GC-2 spd（ts）细胞出现G1和G2／M期捕获。TSEG-3过表达诱导GC-2 spd（ts）细胞凋亡,Real-Time RT-PCR显示TSEG-3过表达诱导Fas上调,同时Bcl-2/Bax比率下调,说明Fas-Fas通路和Bcl-2/Bax均参与TSEG-3过表达诱导GC-2 spd（ts）细胞凋亡。结论：TSEG-3过表达抑制GC-2 spd（ts）细胞增殖,诱导GC-2 spd（ts）细胞凋亡,Fas/Fas通路和Bcl-2/Bax均参与TSEG-3过表达诱导GC-2 spd（ts）细胞凋亡途径。第五部分：TSEG-3过表达诱导小鼠睾丸精原细胞凋亡及其睾丸疾病模型表达谱分析目的：整体水平探讨TSEG-3过表达对小鼠睾丸精原细胞的影响,并分析其在睾丸疾病模型表达谱。方法：制备in vivo-jetPEITM-pEGFP-TSEG-3聚合物：构建TSEG-3过表达模型,HE染色和Tunel分析TSEG-3过表达对小鼠生殖细胞的影响；同时构建手术隐睾模型,分析TSEG-3转录水平与细胞凋亡率的关系,分析温度对TSEG-3转录水平的影响；复制17β雌二醇诱导隐睾模型,检测17β雌二醇诱导隐睾模型中TSEG-3转录水平,明确17β雌二醇对TSEG-3转录的影响。结果：荧光显微镜观察提示In Vivo JetPEITM是一种高效、可靠安全的DNA转染试剂,能有效的携带外源DNA入生殖细胞。TSEG-3过表达使睾丸组织生精小管官腔内细胞密度减少,生精小管官腔变薄,大量精原细胞及精母细胞缺失,未发现成熟精子。Tunel结果提示TSEG-3过表达可能诱导生精细胞的凋亡。手术隐睾模型结果显示：TSEG-3的转录激活与手术组小鼠睾丸内生精细胞凋亡率增加呈正相关关系,进一步提示TSEG-3可能参与睾丸组织生精过程中细胞凋亡过程。17β-雌二醇诱导隐睾模型原位杂交结果提示17β-雌二醇可能参与抑制不同阶段生殖细胞中TSEG-3的转录。结论：TSEG-3过表达诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡,温度可能诱导TSEG-3的转录,17β-雌二醇可能参与抑制不同阶段生殖细胞中TSEG-3的转录。
陆芳[9]（2010）在《发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选》文中研究表明胚胎的初次卵裂时间是衡量胚胎质量和后续发育能力的重要指标之一,以初次卵裂时间为基础选择发育能力不同的胚胎做研究对象,再通过相应的试验技术可以使我们发现一些影响胚胎发育能力的母源基因。猪的胚胎基因组激活（Embryonic genome activation, ZGA）在4-细胞期,如果之前的发育均由源自卵子的母源mRNAs调控,则早卵裂的胚胎与晚卵裂胚胎间各种mRNA丰度的不同将极可能表现在2-细胞期。鉴定出该时期表达丰度不同的mRNAs,可以使我们获得与胚胎发育能力有重要关系的母源基因,同时也有助于我们发掘胚胎早期发育过程中初次卵裂时间影响胚胎后续发育能力的原因。本试验以猪孤雌胚胎为材料,根据初次卵裂时间的早晚划分出发育能力不同的两组胚胎,比较其mRNAs丰度。利用mRNA差异显示技术（mRNA Differential Display Reverse Transcription PCR, DDRT-PCR）筛选出两组胚胎中表达丰度不同的mRNAs。采用反Northorn-blot技术进行阳性片段的鉴定。利用PCR和5’RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）技术对阳性片段E3所在的CPEB2基因进行全长cDNA克隆。利用SYBR Green荧光定量PCR技术得到了该基因在早期胚胎中的表达模式。1.经反Northern-blot验证,发现有8条差异表达的阳性cDNA片段（E1-E4; L1-L4）,其中四条（E1-4）在早卵裂（发育潜能较高）胚胎中表达量较高;四条（L1-L4）在晚卵裂（发育潜能较低）胚胎中表达量较高。2. 8条阳性片段克隆、测序后与GenBank中猪的基因数据库进行同源性比对分析,其中6条（E1, E2, E3, L1, L2, L4）与已知猪的ESTs有较高的同源性。3.经过与GenBank中人的基因数据库对比,发现在卵裂较快的胚胎中表达量较高的E3与人CPEB2的同源性为97%;在卵裂较慢的胚胎中表达量较高的L3与人hnRNPA1的同源性89%。4.首次成功克隆了猪CPEB2 cDNA,提交到NCBI,获得基因登录号:HM037344。5.首次确定猪胚胎中存在CPEB2基因,经荧光定量PCR进一步证明E3的表达量在早卵裂和晚卵裂胚胎中明显不同,表达模式与其他功能性转录子一致。
何小龙[10]（2010）在《蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究》文中研究指明绵羊的繁殖性状一般分为受胎率、多胎率及羔羊存活率三类性状,繁殖性能的高低直接关系到养羊业生产成本和生产效率,具有重大的经济意义。蒙古羊是我国最古老的地方绵羊品种之一,乌珠穆沁系蒙古羊是在当地生态环境条件下,经长期选育形成的一个优良类群,具有许多优良特性,主要以抗病力强、产肉率高和繁殖性能高而闻名。为了揭示蒙古羊高繁殖性能,使蒙古羊这一宝贵资源能得到有效利用,本研究以乌珠穆沁系蒙古羊为实验材料,首先以BMPR-IB和FSHβ基因作为蒙古羊高繁殖力候选基因,对其进行了克隆及序列分析,并采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）的相对定量方法对BMPR-IB和FSHβ基因在单羔蒙古羊非发情期、发情期及产双羔蒙古羊怀孕后期的卵巢、子宫、输卵管、下丘脑和垂体组织进行了差异表达研究;其次采用抑制性消减杂交技术（SSH）对经产单、双羔蒙古羊的卵巢组织差异表达基因进行了筛选并采用电子克隆加RT-PCR方法对部分差异表达基因进行了克隆和验证。通过以上研究,为提高我国肉用绵羊繁殖力及加快肉羊新品种选育提供了重要的理论依据,并获得以下主要研究结果:（1）采用RT-PCR方法分别从蒙古羊卵巢组织中扩增出BMPR-IB、FSHβ基因的cDNA序列。蒙古羊BMPR-IB基因全长1567bp,包括完整的1509bp开放读码框（ORF）,共编码502个氨基酸。通过对单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因测序结果分析发现,在单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因编码区第746位和第1113位碱基相一致,分别为“A”和“C”,并没有发生同多胎Booroola羊相同的A→G突变和C→A突变。蒙古羊FSHβ基因全长1021bp,包括完整的390bp ORF,共编码129个氨基酸。（2）采用相对定量的双标准曲线法建立了蒙古羊β-Actin、BMPR-IB和FSHβ基因的RQ-PCR反应体系。以非发情期单羔蒙古羊的卵巢组织定量结果为对照,计算得到FSHβ基因在单羔蒙古羊发情期下丘脑组织中表达量最高,在发情期的输卵管组织中表达量最低;BMPR-IB基因在单羔蒙古羊发情期卵巢组织中表达量最高,在发情期的子宫组织中表达量最低。在卵巢组织中,FSHβ基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的1.31倍,双羔羊是单羔羊的0.70倍;BMPR-IB基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的2.65倍,双羔羊是单羔羊的2.16倍。证明BMPR-IB基因是蒙古羊多胎主要候选基因,FSHβ基因虽然在绵羊繁殖过程中具有重要的作用,但并非蒙古羊多胎主效基因,可能与多胎性状的主基因或QTL相连锁。（3）采用SSH技术成功构建了单、双羔蒙古羊卵巢组织的正、反向消减cDNA文库,并从两个消减cDNA质粒文库中筛选得到768个有效阳性克隆,插入片段长度主要分布于1501000bp之间。结合斑点杂交技术获得到差异克隆373个,通过测序和同源性检索获得已知基因序列185条,10条已知的差异表达EST和4条未知的EST序列。（4）对差异表达基因功能分析表明,本实验所获得的基因主要由以下几大类组成:机体和细胞防御、免疫类14个,代谢类53个,物质运输类20个,核酸修饰类12个,细胞发育类18个,信号传导类12个,细胞结构类9个,未分类47个,其中代谢类基因占据了最大部分占28.65%。将这些差异表达基因和已报道的与繁殖性状相关的基因比较发现,经过初步筛选得到12个差异表达基因与已报道的繁殖性状相关基因相一致,这些基因分别为ITGB1、BMP6、MHC-I、ACVRL1、IGFBP5、SPON1、FABP5、ADAMTS1、FAM46A、THY1、ARP3和Id3基因。（5）分别以SSH获得的差异表达ADAMTS1和Id3基因序列片段为种子序列在绵羊的EST数据库中进行blastn同源性检索,得到相应的UniGene编号分别为Oar.7453和Oar.5068,经过序列拼接分别得到2418bp和1099bp的蒙古羊ADAMTS1、Id3基因电子克隆cDNA序列。采用RT-PCR方法实验克隆得到2420bp的蒙古羊ADAMTS1基因序列和1045bp的蒙古羊Id3基因序列,经同源性比对发现,实验所得序列与电子延伸序列的同源性分别为99.4%和99.3%,并将序列提交至GenBank获得注册号分别为:GU437212和GU437213。
二、用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST（论文提纲范文）
（1）半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前沿综述 |
| 1.性别决定和性别分化 |
| 1.1 性染色体和性别决定系统 |
| 1.2 性别决定基因 |
| 1.2.1 两栖动物的性别决定基因 |
| 1.2.2 鸟类的性别决定基因 |
| 1.2.3 哺乳动物的性别决定基因 |
| 1.2.4 鱼类的性别决定基因 |
| 1.3 环境性别决 |
| 1.3.1 温度对鱼类性别分化的影响 |
| 1.3.2 外源激素对鱼类性别分化的影响 |
| 1.4 性逆转 |
| 2.精子发生 |
| 2.1 精子发生 |
| 2.2 鱼类的精子发生 |
| 2.2.1 鱼类的精巢结构 |
| 2.2.2 鱼类的精巢发育 |
| 2.2.3 鱼类精子发生的特点 |
| 3.精子发生相关基因 |
| 3.1 转录因子基因 |
| 3.1.1 cAMP 应答元件结合蛋白 |
| 3.1.2 cAMP 应答元件调节因子 |
| 3.1.3 TATA 结合蛋白及 TBP 相似因子 |
| 3.1.4 OVOL1 |
| 3.1.5 SOX |
| 3.1.6 DMRT1 |
| 3.1.7 HOX |
| 3.1.8 锌指蛋白 |
| 3.2 细胞周期蛋白基因 |
| 3.3 原癌基因 |
| 3.4 细胞凋亡相关基因 |
| 3.5 热休克蛋白基因 |
| 3.6 生殖细胞特异基因与 DNA 甲基化 |
| 3.7 DNA 甲基转移酶基因 |
| 第二章 半滑舌鳎精子发生相关基因的研究 |
| 1.前言 |
| 1.1 半滑舌鳎是研究鱼类性别决定机制的理想模型 |
| 1.2 半滑舌鳎性别决定和分化机制的研究现状和存在的问题 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2.样品制备与实验方法 |
| 2.1 不同基因型半滑舌鳎个体的获得 |
| 2.2 实验材料的收集 |
| 2.3 生理性别和遗传性别的鉴定 |
| 2.3.1 生理性别的鉴定 |
| 2.3.2 遗传性别的鉴定 |
| 2.4 半滑舌鳎总 RNA 的提取和第一链 cDNA 的合称 |
| 2.4.1 总 RNA 的提取 |
| 2.4.2 cDNA 的合成 |
| 2.5 实时定量 PCR（Real-time PCR） |
| 2.6 基因组 walking |
| 2.7 PCR 产物的克隆与测序 |
| 2.8 原位杂交（In situ hybridization，ISH） |
| 2.8.1 合成 RNA 探针 |
| 2.8.2 预杂交 |
| 2.8.3 切片原位杂交 |
| 2.9 染色体荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH） |
| 2.9.1 染色体的制备 |
| 2.9.2 阳性 BAC 克隆质粒的制备 |
| 2.9.3 Cot-1 DNA 的制备 |
| 2.9.4 探针的制备及变性 |
| 2.9.5 标本变性及杂交 |
| 2.10 甲基化位点预测与甲基化分析 |
| 3.半滑舌鳎 tesk1 基因的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 tesk1 全长 cDNA 的克隆 |
| 3.2.2 tesk1 基因组 DNA 序列的扩增 |
| 3.2.3 Real-time PCR 检测 tesk1 的表达情况 |
| 3.2.4 原位杂交 |
| 3.2.5 染色体荧光原位杂交 |
| 3.2.6 基因组 walking 扩增 tesk1 启动子区域及启动子的分析 |
| 3.2.7 甲基化检测与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 半滑舌鳎 tesk1 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 3.3.2 tesk1 多重序列比对及多基因分析 |
| 3.3.3 tesk1 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 3.3.4 tesk1 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 3.3.5 tesk1 在不同基因型半滑舌鳎性腺中的表达分析 |
| 3.3.6 原位杂交结果与 tesk1 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 3.3.7 tesk1 的染色体定位 |
| 3.3.8 tesk1 上游调控序列分析 |
| 3.3.9 甲基化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4.半滑舌鳎 neurl3 基因的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 neurl3 全长 cDNA 的克隆和基因组 DNA 序列的扩增 |
| 4.2.2 Real-time PCR 检测 neurl3 的表达情况 |
| 4.2.3 原位杂交及染色体荧光原位杂交 |
| 4.2.4 原核表达的初步研究 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 半滑舌鳎 nuerl3 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 4.3.2 nuerl3 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 4.3.3 nuerl3 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 4.3.4 原位杂交结果与 neurl3 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 4.3.5 nuerl3 的染色体定位 |
| 4.3.6 半滑舌鳎 Neurl3 原核表达初步研究 |
| 4.4 讨论 |
| 5.半滑舌鳎 strbp 基因的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 半滑舌鳎 strbp 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 5.2.2 Real-time PCR 检测 strbp 的表达情况 |
| 5.2.3 原位杂交 |
| 5.2.4 基因组 walking 扩增 strbp 启动子区域 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 半滑舌鳎 strbp 全长 cDNA 序列及基因组 DNA 序列的分析 |
| 5.3.2 strbp 在半滑舌鳎不同组织中的表达分析 |
| 5.3.3 strbp 在半滑舌鳎性腺不同发育时期的表达分析 |
| 5.3.4 strbp 在半滑舌鳎性腺中的细胞定位 |
| 5.3.5 strbp 上游调控序列的分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第三章 大菱鲆脾脏、头肾 cDNA 文库的构建，EST 测序及免疫相关基因的筛选 |
| 1.前言 |
| 1.1 鱼的免疫 |
| 1.1.1 鱼类的免疫组织和器官 |
| 1.1.2 鱼类的免疫细胞 |
| 1.1.3 鱼类的体液免疫 |
| 1.2 表达序列标签（EST）及其应用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2.大菱鲆脾脏、头肾 cDNA 文库的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 大菱鲆头肾、脾脏总 RNA 的提取 |
| 2.1.2 mRNA 的分离 |
| 2.1.3 逆转录合成双链 cDNA |
| 2.1.4 双链 cDNA 末端补平及加 EcoR I 接头 |
| 2.1.5 双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切 |
| 2.1.6 双链 cDNA 和载体的连接 |
| 2.1.7 电转化 |
| 2.1.8 cDNA 文库库容量的估算及文库扩增 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 总 RNA 和 mRNA 质量的检测 |
| 2.2.2 第一链和双链 cDNA 的合成 |
| 2.2.3 插入片段大小的检测 |
| 2.2.4 库容量的估算 |
| 2.3 讨论 |
| 3.EST 测序及免疫相关基因的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 EST 测序 |
| 3.1.2 EST 序列分析及基因注释 |
| 3.1.3 免疫抗病相关基因的筛选 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 序列测定 |
| 3.2.2 EST 序列分析及免疫抗病相关基因的筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）东北梅花鹿茸生长期顶端组织差异表达基因的筛选和鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 鹿茸的生长发育规律 |
| 1.1.1 鹿茸生长发育的组织结构 |
| 1.1.2 鹿茸的再生机理 |
| 1.1.3 鹿茸的组织发生 |
| 1.1.4 鹿茸的器官形成 |
| 1.2 鹿茸生长发育过程中的组织学特性 |
| 1.3 鹿茸生长发育调控 |
| 1.4 mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术简介 |
| 1.4.1 DDRT-PCR技术的原理 |
| 1.4.2 DDRT-PCR技术的发展 |
| 1.4.3 DDRT-PCR技术的优点与局限性 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 网络资源及软件 |
| 2.3 试剂及引物 |
| 2.3.1 主要试剂及试剂盒 |
| 2.3.2 电泳所需溶液配方 |
| 2.3.3 染色溶液的配制 |
| 2.3.4 LB培养基的配制 |
| 2.3.5 mRNA差异显示PCR引物 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 鹿茸间充质的获取 |
| 2.5.2 鹿茸间充质总RNA的提取 |
| 2.5.3 RNA纯化 |
| 2.5.4 cDNA的合成 |
| 2.5.5 DDRT-PCR反应 |
| 2.5.6 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.5.7 银染法显色 |
| 2.5.8 差异片段的切取 |
| 2.5.9 差异片段的二次扩增 |
| 2.5.10 二次扩增产物的回收 |
| 2.5.11 PCR产物克隆 |
| 2.5.12 Real-time PCR定量分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNA纯度与完整性 |
| 3.2 mRNA差异显示结果 |
| 3.3 差异片段的回收与再扩增 |
| 3.4 再扩增产物的克隆及阳性克隆的鉴定 |
| 3.5 差异片段序列的测序及同源性分析结果 |
| 3.6 实时定量PCR结果 |
| 3.6.1 RNA纯度和完整性 |
| 3.6.2 LOX基因实时实时定量PCR扩增产物的电泳检测 |
| 3.6.3 实时定量PCR扩增曲线 |
| 3.6.4 实时定量PCR熔解曲线 |
| 3.6.5 LOX基因表达的相对定量 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 应用改进的DDRT-PCR方法获得差异基因表达序列 |
| 4.2 差异条带的筛选 |
| 4.3 部分差异序列功能分析 |
| 4.3.1 EST1 |
| 4.3.2 EST2 |
| 4.3.3 EST3与EST5 |
| 4.3.4 EST4 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）萝卜CMS育性相关基因分离鉴定与表达特征分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 植物雄性不育的研究进展 |
| 1.1 植物雄性不育的来源 |
| 1.2 植物雄性不育的遗传学说 |
| 1.3 植物雄性不育的生理生化研究 |
| 1.4 植物雄性不育的细胞生物学研究 |
| 1.5 植物CMS雄性不育的分子生物学研究 |
| 1.6 植物CMS雄性不育恢复基因的研究进展 |
| 2. 萝卜CMS雄性不育的研究进展 |
| 2.1 萝卜CMS雄性不育胞质的类型 |
| 2.2 萝卜CMS雄性不育的遗传机制 |
| 2.3 萝卜CMS雄性不育的生理生化研究 |
| 2.4 萝卜CMS雄性不育的细胞学特征研究 |
| 2.5 萝卜CMS雄性不育的分子生物学研究 |
| 2.6 萝卜CMS雄性不育恢复基因的类型 |
| 2.7 萝卜CMS雄性不育恢复基因的作用机理 |
| 2.8 萝卜CMS雄性不育恢复基因的结构特征 |
| 2.9 萝卜CMS雄性不育恢复基因遗传标记分析 |
| 3. 植物花粉发育相关基因的研究进展 |
| 3.1 花粉发育过程 |
| 3.2 花粉发育相关基因 |
| 3.3 花粉发育相关基因差异表达分析 |
| 4. 本研究目的与意义 |
| 第二章 萝卜胞质不育类型鉴定及细胞学分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 PCR扩增 |
| 1.3 花粉母细胞时期观察 |
| 1.4 石蜡切片方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜保持系与不育系花药外形特征 |
| 2.2 萝卜胞质类型分子鉴定 |
| 2.3 雄性不育材料和相应保持系的花粉母细胞观察 |
| 2.4 不同胞质雄性不育材料和相应保持系的细胞学观察 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 萝卜细胞质雄性不育胞质类型分子鉴定 |
| 3.2 萝卜细胞质雄性不育胞质类型细胞学鉴定 |
| 第三章 萝卜胞质不育基因和恢复基因分子特征及功能标记开发 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株与质粒 |
| 1.3 基因组DNA提取 |
| 1.4 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.5 PCR扩增 |
| 1.6 Rs-Rf_1/Rs-rf_1和orf138基因的克隆与分析 |
| 1.7 Rs-Rf_1和orf138基因的互作分析 |
| 1.8 酶切位点的识别及PCR产物的酶切 |
| 1.9 CMS候选保持系的标记辅助选择 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜Rs-Rf_1/Rs-rf_1和orf138基因的DNA与cDNA扩增 |
| 2.2 萝卜Rs-Rf_1/Rs-rf_1基因的DNA与cDNA克隆及序列分析 |
| 2.3 萝卜orf138基因的DNA与cDNA克隆及序列分析 |
| 2.4 萝卜Rs-Rf_1基因的表达分析 |
| 2.5 萝卜Rs-Rf_1和orf138基因的互作分析 |
| 2.6 基于Rs-Rf_1/Rs-rf_1基因功能标记的开发 |
| 2.7 应用F2群体进行功能标记的验证 |
| 2.8 CMS候选保持系的标记辅助选择 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 萝卜Rs-Rf_1和orf138基因的表达特征分析 |
| 3.2 分子标记辅助选择候选保持系 |
| 第四章 萝卜CMS育性相关基因差异表达分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA提取检测 |
| 2.2 CMS育性相关基因差异表达的DDRT-PCR分析 |
| 2.3 差异片段的回收再扩增 |
| 2.4 CMS育性相关基因差异表达的功能分类 |
| 2.5 RT-PCR分析差异表达片段的时空表达特性 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 萝卜CMS育性相关基因差异表达分析 |
| 3.2 差异表达基因的功能分析 |
| 3.3 差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 第五章 萝卜花粉发育相关基因的克隆与特征分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 RNA提取和cDNA的合成 |
| 1.3 萝卜花粉发育相关基因的克隆 |
| 1.4 生物信息学分析 |
| 1.5 RT-PCR分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜不育系和保持系花蕾中差异片段的获得 |
| 2.2 萝卜花粉发育相关基因的DNA和cDNA扩增 |
| 2.3 萝卜花粉发育相关基因cDNA全长的获得及其氨基酸序列分析 |
| 2.4 萝卜花粉发育相关基因表达特征分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 编码花粉外壳蛋白(PCP)基因的分子特征 |
| 3.2 编码花粉特异蛋白(Bnm)基因的分子特征 |
| 3.3 编码翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的分子特征 |
| 3.4 编码Rac蛋白基因的分子特征 |
| 第六章 萝卜转录因子RsBHLH基因的克隆与表达特征 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 RNA提取和cDNA的合成 |
| 1.3 RsBHLH基因的扩增 |
| 1.4 RsBHLH基因的TA克隆及序列分析 |
| 1.5 RT-PCR和qRT-PCR分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜CMS育性相关基因表达差异片段的获得 |
| 2.2 萝卜RsBHLH基因的DNA和cDNA扩增 |
| 2.3 萝卜RsBHLH cDNA全长的获得及其氨基酸序列分析 |
| 2.4 推测的萝卜RsBHLH的蛋白特征 |
| 2.5 萝卜RsBHLH基因表达特征分析 |
| 3. 讨论 |
| 第七章 萝卜RsCHS基因克隆与表达分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 RNA提取和cDNA的合成 |
| 1.3 RsCHS基因的扩增 |
| 1.4 RsCHS基因的TA克隆及序列分析 |
| 1.5 RT-PCR和qRT-PCR分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜CMS育性相关基因差异片段的获得 |
| 2.2 萝卜RsCHS基因的DNA和cDNA扩增 |
| 2.3 萝卜RsCHS cDNA全长的获得及其氨基酸序列分析 |
| 2.4 萝卜RsCHS基因表达分析 |
| 3. 讨论 |
| 第八章 萝卜细胞壁合成和调控相关基因RsPMEI和RsPG克隆与特征分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 RNA提取和cDNA的合成 |
| 1.3 RsPMEI和RsPG基因的扩增 |
| 1.4 RsPMEI和RsPG基因的TA克隆及序列分析 |
| 1.5 RT-PCR和qRT-PCR分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 萝卜CMS育性相关基因差异片段的获得 |
| 2.2 萝卜细胞壁合成和调控相关基因的DNA和cDNA扩增 |
| 2.3 萝卜细胞壁合成与调控相关基因cDNA全长的获得 |
| 2.4 萝卜RsPMEI和RsPG基因表达特征分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 萝卜细胞壁发育相关基因PMEI的分子特征研究 |
| 3.2 萝卜细胞壁发育相关基因PG的分子特征研究 |
| 全文结论 |
| 本文创新之处 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库构建和Dmcl基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 精子发生调控的研究进展 |
| 第二节 中华绒螯蟹雄性生殖系统研究现状 |
| 第三节 分子生物学技术的应用 |
| 第四节 本研究的研究目的与意义 |
| 第二章 中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库的构建及表达序列分析 |
| 第一节 中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库的构建 |
| 第二节 中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库EST分析 |
| 第三章 中华绒螯蟹Dmc1基因全长cDNA的克隆和表达 |
| 第一节 中华绒螯蟹Dmc1基因全长cDNA的克隆和序列特征分析 |
| 第二节 Dmc1基因的表达特征研究 |
| 第四章 中华绒螯蟹精巢组织差减cDNA文库的构建 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）在苯并（a）芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 近岸海域多环芳烃污染状况 |
| 1.1 多环芳烃的来源及分布 |
| 1.1.1 环境中 PAHs 的来源 |
| 1.1.2 环境中 PAHs 的分布 |
| 1.2 多环芳烃的毒理学特征 |
| 1.2.1 PAHs 的致癌性 |
| 1.2.2 PAHs 的光致毒效应 |
| 1.2.3 PAHs 衍生物的毒理效应 |
| 1.3 海洋环境中 PAHs 污染现状 |
| 1.3.1 海水中 PAHs 污染状况 |
| 1.3.2 海洋沉积物 PAHs 污染状况 |
| 2 PAHs 监测技术研究进展 |
| 2.1 PAHs 化学监测法 |
| 2.2 PAHs 生物监测法 |
| 2.3 生物标志物技术 |
| 2.3.1 生物标志物分类 |
| 2.3.2 生物标志物筛选原则 |
| 2.4 分子生物标志物研究进展 |
| 2.4.1 大分子氧化损伤类生物标志物的研究 |
| 2.4.2 其他酶蛋白作为分子标志物的研究 |
| 2.4.3 基因差异表达作为分子生物标志物的研究 |
| 2.4.4 贝类分子生物标志物研究进展 |
| 3 差异表达基因筛选技术及研究进展 |
| 3.1 几种差异表达基因筛选方法及特点 |
| 3.1.1 mRNA 差异显示技术（DDRT-PCR） |
| 3.1.2 代表性差异分析技术（RDA） |
| 3.1.3 基因表达系列分析技术（SAGE） |
| 3.1.4 DNA 微阵列技术（DNA microarray） |
| 3.1.5 抑制消减杂交技术（SSH） |
| 3.2 抑制性消减杂交原理及主要技术流程 |
| 3.2.1 抑制性消减杂交原理 |
| 3.2.2 抑制性消减杂交主要技术流程 |
| 3.3 抑制性消减杂交技术在水产动物研究中的应用 |
| 3.3.1 生殖、发育相关基因的研究 |
| 3.3.2 免疫相关基因的研究 |
| 3.3.3 逆境胁迫相关基因 |
| 4 论文立题依据、研究内容和意义 |
| 第二章 菲律宾蛤仔芳烃受体（AhR）介导的关键基因克隆与表达分析 |
| 第一节 菲律宾蛤仔 AhR 介导的关键基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 总 RNA 的提取 |
| 1.2.2 去除 RNA 中的基因组 DNA |
| 1.2.3 cDNA 第一链的合成 |
| 1.2.4 AhR、ARNT 和 HSP 90 基因的克隆 |
| 1.2.5 AhR 基因全序列扩增 |
| 1.2.6 AhR、ARNT 和 HSP 90 基因序列的生物信息学分析 |
| 1.2.7 AhR、ARNT 和 HSP 90 实时定量表达分析 |
| 1.3 数据处理与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 菲律宾蛤仔 AhR 克隆与序列分析 |
| 2.2 菲律宾蛤仔 ARNT 克隆与序列分析 |
| 2.3 菲律宾蛤仔 HSP 90 克隆与序列分析 |
| 2.4 菲律宾蛤仔中 AhR、ARNT 和 HSP 90 基因组织特异性分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下解毒代谢相关基因的表达分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.1.3 主要试剂和实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 染毒实验 |
| 1.2.2 菲律宾蛤仔解毒代谢基因 mRNA 表达分析 |
| 1.3 数据处理与分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下 cDNA 消减文库的构建与分析 |
| 第一节 菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下 cDNA 消减文库的构建 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 接头和引物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 染毒实验 |
| 1.2.2 总 RNA 的提取及去除 RNA 中的基因组 DNA |
| 1.2.3 Poly A+RNA 的分离纯化与浓缩 |
| 1.2.4 抑制性消减杂交 |
| 1.2.5 cDNA 消减文库构建 |
| 2 结果 |
| 2.1 总 RNA 质量鉴定 |
| 2.2 双链 cDNA 合成和 Rsa I 酶切效率验证 |
| 2.3 接头连接效率检测 |
| 2.4 抑制性 PCR 扩增消减杂交产物的鉴定 |
| 2.5 消减杂交效率验证 |
| 2.6 消减 cDNA 文库的构建 |
| 3 讨论 |
| 第二节 菲律宾蛤仔在苯并(a)芘胁迫下差异基因表达分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 载体通用引物 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 文库质量分析 |
| 1.2.2 重组质粒测序 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 文库重组率及重组克隆中插入片段大小分析 |
| 2.2 消减 cDNA ESTs 序列统计与分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 染毒实验 |
| 1.2.2 总 RNA 的提取及 cDNA 模板的合成 |
| 1.2.3 实时定量 PCR 及 mRNA 表达分析 |
| 1.2.4 分子生物标志物技术的现场验证 |
| 1.3 数据处理与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 BaP 胁迫对菲律宾蛤仔不同功能基因表达的影响 |
| 2.2 不同站点表层海水和菲律宾蛤仔组织中 PAHs 含量的测定 |
| 2.3 不同站点菲律宾蛤仔的功能基因 mRNA 表达分析 |
| 3 讨论 |
| 论文结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 炔雌醇对淡水贝 Ellipsaria lineolata 生殖发育的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 贻贝的性别鉴定 |
| 2.2.2 染毒实验 |
| 2.2.3 生殖发育指标的检测 |
| 2.3 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 蝴蝶贻贝的性别鉴定 |
| 3.2 EE2对蝴蝶贻贝排卵、排精的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 论文发表情况 |
（6）鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 差异表达基因的研究方法及应用 |
| 1 抑制性消减杂交技术在动物生殖与发育学上的应用 |
| 1.1 SSH的原理 |
| 1.2 SSH技术路线 |
| 1.3 SSH的优缺点 |
| 1.4 SSH技术在动物繁育研究中的应用 |
| 2 mRNA差异显示技术及其在动物生殖生理研究中的应用 |
| 2.1 DDRT-PCR技术原理 |
| 2.2 DDRT-PCR技术的优点 |
| 2.3 DDRT-PCR技术的缺点及其改进 |
| 2.4 DDRT-PCR技术在动物发育研究中的应用 |
| 3 基因表达系列分析及其在动物科学研究中的应用 |
| 3.1 SAGE原理及操作步骤 |
| 3.2 SAGE技术的优势,存在的问题及改进 |
| 3.3 SAGE在动物科学研究中的应用 |
| 4 基因芯片及其在动物基因研究中的应用 |
| 4.1 基因芯片概述 |
| 4.2 基因芯片主要技术流程 |
| 4.3 基因芯片的改进 |
| 4.4 基因芯片的应用 |
| 第二章 禽类卵泡发育调节的研究进展 |
| 1 禽类卵巢及卵泡发育的结构特点 |
| 2 禽类卵泡生长发育的调节 |
| 2.1 促性腺激素释放激素(GnRH)对卵泡发育的调节 |
| 2.2 促卵泡素(FSH)对卵泡发育的调节 |
| 2.3 促黄体素(LH)对卵泡发育的调节 |
| 2.4 雌激素对卵泡发育的调节 |
| 2.5 孕激素对卵泡发育的调节 |
| 2.6 促乳素(Prolactin,PRL)对卵泡发育的调节 |
| 2.7 抑制素(INH)对卵泡发育的调节 |
| 2.8 前列腺素(PG)对卵泡发育的调节 |
| 2.9 8-精催产素对卵泡发育的调节 |
| 2.10 细胞因子对卵泡发育的调节 |
| 2.11 褪黑素(MLT)对卵泡发育的调节 |
| 2.12 肾上腺皮质激素对卵泡发育的调节 |
| 3 卵泡闭锁的调节 |
| 4 禽类卵巢卵泡与产蛋 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 鸭最大等级卵泡与等级前卵泡正反消减文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 样品总RNA提取 |
| 1.6 DSN介导的消减杂交 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的结果检测 |
| 2.2 cDNA的合成质量检测 |
| 2.3 消减产物的PCR扩增结果 |
| 2.4 消减效率检测 |
| 2.5 消减文库cDNA的检测 |
| 2.6 测序与序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于抑制消减杂交技术 |
| 3.2 关于引物的设计 |
| 3.3 关于差异表达的基因 |
| 4 小结 |
| 第四章 鸭最大与最小等级卵泡正反消减文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 样品总RNA提取 |
| 1.6 DSN介导的消减杂交 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的结果检测 |
| 2.2 cDNA的合成质量检测 |
| 2.3 消减产物的PCR扩增结果 |
| 2.4 消减效率检测 |
| 2.5 消减文库cDNA的检测 |
| 2.6 测序与序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 文库消减文库中重要的差异表达基因 |
| 3.2 文库间差异基因的比较 |
| 4 小结 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）黄河鲤性别特异片段的鉴定与性腺差异cDNA文库的构建及相关ESTS功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 基因组水平上寻找性别决定信息的研究概况 |
| 1.1.1 DNA 分子标记的研究历程 |
| 1.1.2 抑制性消减杂交—性别特异片段鉴定的有效技术 |
| 1.2 mRNA 水平上寻找性别决定信息的研究概况 |
| 1.2.1 性别决定基因的寻找历程 |
| 1.2.2 鱼类性腺发育机制的研究概况 |
| 1.2.3 抑制性杂交技术在鱼类相关基因克隆中的研究概况 |
| 1.3 EST 技术在鱼类性别发育相关基因克隆中的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 多种分子技术分离、鉴定黄河鲤性别特异片段的研究 |
| 2.1 利用RAPD、SSR、ISSR 分离性别特异片段 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 2.2 SSH 技术筛选、鉴定黄河鲤性别特异片段 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 本研究常用溶液配方 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.2.6 结果 |
| 2.2.7 小结 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 性别特异标记与单性养殖 |
| 2.3.2 三种分子标记技术与性别特异片段的鉴定 |
| 2.3.3 关于重组及性染色体分子类型的多样性 |
| 2.3.4 性别特异片段与性染色体识别 |
| 2.3.5 关于抑制消减杂交技术 |
| 第三章 黄河鲤性成熟期雌、雄消减cDNA 文库的构建及性别相关ESTS 分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.2 分子克隆用载体及宿主菌 |
| 3.3 主要试剂 |
| 3.4 引物序列 |
| 3.5 试验方法 |
| 3.5.1 RNA 的提取 |
| 3.5.2 mRNA 的分离 |
| 3.5.3 cDNA 第一链的合成 |
| 3.5.4 cDNA 第二链的合成 |
| 3.5.5 Rsa 1 酶切 |
| 3.5.6 接头连接 |
| 3.5.7 接头效率检测 |
| 3.5.8 抑制性消减杂交 |
| 3.5.9 PCR 扩增 |
| 3.5.10 cDNA 消减文库的构建 |
| 3.5.11 斑点杂交筛选 |
| 3.5.12 同源性比对 |
| 3.5.13 组织特异性表达 |
| 3.5.14 性别相关基因的全长扩增 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 性腺总RNA 的提取 |
| 3.6.2 双链cDNA 的合成及Rsa Ⅰ酶切效率检测 |
| 3.6.3 接头连接效率检测 |
| 3.6.4 两轮PCR 扩增 |
| 3.6.5 消减效率检测 |
| 3.6.6 阳性克隆的鉴定 |
| 3.6.7 候选差异克隆的筛选 |
| 3.6.8 性腺相关ESTS 分析 |
| 3.6.9 部分同源基因在黄河鲤精卵巢中差异表达分析 |
| 3.6.10 Hmwt1α 基因全长的克隆 |
| 3.6.11 Hmwt1α 基因的同源性比对及聚类分析 |
| 3.6.12 黄河鲤HmSetd6 基因的全长克隆 |
| 3.6.13 HmSetd6 基因的同源性比对及聚类分析 |
| 3.6.14 黄河鲤卵巢特异基因HmPsmb2 的全长克隆 |
| 3.6.15 Psmb2 基因的同源性比对及聚类分析 |
| 3.6.16 三个差异表达基因的成体表达模式分析 |
| 3.7 小结 |
| 3.8 讨论 |
| 3.8.1 雄性EST 文库相关基因功能探析 |
| 3.8.2 雌性EST 文库相关基因功能探析 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 本研究取得的主要研究成果 |
| 4.1.1 黄河鲤性别特异片段的鉴定及功能探索 |
| 4.1.2 黄河鲤雌、雄cDNA 消减文库的构建 |
| 4.2 后续研究设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）生物信息挖掘新基因预测平台的建立与TSEG-3的克隆和功能初步研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分:生物信息数据挖掘新基因预测平台的建立 |
| 材料 |
| 方法与结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3的克隆、组织定位及表达谱分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:小鼠睾丸特异表达基因TSEG-3生物信息学分析及TSEG-3多克隆抗体制备与鉴定 |
| 材料 |
| 方法与结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分:过表达TSEG-3基因对小鼠精母细胞系GC-2 spd增殖、凋亡的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分:TSEG-3过表达诱导小鼠睾丸精原细胞凋亡及其睾丸疾病模型表达谱分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 数据挖掘在生物信息学中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录1 (攻读学位期间发表论文目录) |
| 附录2 (英文缩略词表) |
| 附录3 (睾丸新基因检索报告) |
| 致谢 |
（9）发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景与科学意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 胚胎早期发育的相关研究 |
| 1.2.2 孤雌生殖 |
| 1.2.3 有关胚胎初次卵裂时间的研究 |
| 1.2.4 mRNA 差异显示技术 |
| 1.3 研究的目标与内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 孤雌胚胎的培养与收集 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 缓冲液与常用试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 差异表达 mRNA 的筛选 |
| 2.2.2 差异表达片段的鉴定及测序 |
| 2.2.3 CPEB2 cDNA 的克隆 |
| 2.2.4 不同阶段胚胎中 CPEB2 的荧光定量 PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 差异表达mRNA 的筛选结果 |
| 3.1.1 两组胚胎DDRT-PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳的比较结果 |
| 3.1.2 差异条带的回收及二次PCR 的结果 |
| 3.2 差异条带的鉴定、克隆、测序及生物信息学分析结果 |
| 3.2.1 探针标记效价的检测结果 |
| 3.2.2 反向Northern-blot 鉴定结果 |
| 3.2.3 阳性片段的克隆及测序 |
| 3.2.4 差异表达序列的生物信息学分析 |
| 3.3 CPEB2 cDNA 克隆结果 |
| 3.3.1 细胞RNA 提取结果 |
| 3.3.2 CPEB2 中间片段扩增结果 |
| 3.3.3 CPEB2 cDNA 5'末端的扩增(5'RACE)结果 |
| 3.3.4 序列拼接 |
| 3.3.5 CPEB2 的生物信息学分析 |
| 3.4 不同发育阶段胚胎 CPEB2 的荧光定量 PCR 结果 |
| 3.4.1 标准曲线的绘制结果 |
| 3.4.2 不同阶段胚胎 CPEB2 的定量结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DDRT-RCR 技术及结果鉴定 |
| 4.2 试验材料的选择 |
| 4.2.1 胚胎卵裂时间点的划分 |
| 4.2.2 孤雌胚胎的选择 |
| 4.3 关于差异表达mRNA 片段 |
| 4.4 猪 CPEB2 功能的预测 |
| 4.4.1 猪 CPEB2 cDNA 和蛋白序列分析 |
| 4.4.2 不同阶段胚胎中 CPEB2 表达规律 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 卵泡的发育模式及调控 |
| 1.1.1 卵泡发育的基本模式 |
| 1.1.2 下丘脑-垂体-卵巢轴在卵泡发育过程中的作用 |
| 1.1.3 生长因子对卵泡发育的调控 |
| 1.2 BMPR-IB 基因作为绵羊繁殖性状候选基因的研究进展 |
| 1.2.1 骨形态发生蛋白家族及BMPR-IB 基因的发现 |
| 1.2.2 BMPR-IB 基因的结构及染色体定位 |
| 1.2.3 BMPR-IB 基因对绵羊繁殖性能的影响 |
| 1.3 FSHβ基因的研究进展 |
| 1.3.1 FSHβ基因的结构 |
| 1.3.2 FSHβ基因与动物繁殖性状的关系 |
| 1.4 FSH 与 BMPs 信号传导通路及相互调控机制 |
| 1.5 本研究中所采用主要方法简介 |
| 1.5.1 实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR，RQ-PCR） |
| 1.5.2 抑制性消减杂交技术 |
| 1.5.3 电子克隆技术（Silicon Cloning） |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容 |
| 2 实验一 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的cDNA 克隆与序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及其组织 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 实验常用溶液和试剂的配制 |
| 2.1.6 主要分子生物学软件及相关网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR 反应过程 |
| 2.2.3 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的克隆与测序 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蒙古羊卵巢组织总RNA 的提取结果 |
| 2.3.2 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的RT-PCR 扩增结果 |
| 2.3.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.3.4 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的测序结果及序列拼接 |
| 2.3.5 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因序列分析 |
| 2.3.6 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ蛋白结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 BMPR-IB 基因对绵羊繁殖性能的调控 |
| 2.4.2 FSHβ基因对绵羊繁殖性能的调控 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因在不同组织差异表达研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及其组织 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 3.2.2 RQ-PCR 反应过程 |
| 3.2.3 标准品的制备及标准曲线制作 |
| 3.2.4 差异表达分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蒙古羊各组织总RNA 的提取结果 |
| 3.3.2 蒙古羊β-Actin、BMPR-IB 和FSHβ基因的RQ-PCR 扩增结果分析 |
| 3.3.3 蒙古羊β-Actin、BMPR-IB 和FSHβ基因的RQ-PCR 定量结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于荧光定量PCR 的引物设计 |
| 3.4.2 关于标准品的制备 |
| 3.4.3 关于相对定量的必要性 |
| 3.4.4 关于定量结果的可信度 |
| 3.4.5 BMPR-IB 和 FSHβ基因的表达与绵羊繁殖性能的关系 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三 单、双羔蒙古羊卵巢组织差异表达基因的筛选及鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物及其组织 |
| 4.1.2 主要仪器和设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 载体和菌株 |
| 4.1.5 实验中所需的引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 4.2.2 单、双羔蒙古羊卵巢组织mRNA 的分离与纯化 |
| 4.2.3 抑制性消减杂交过程 |
| 4.2.4 差减文库的构建 |
| 4.2.5 斑点杂交（Dot Blot） |
| 4.2.6 部分差异表达基因的RQ-PCR 验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 总RNA 检测及纯化结果 |
| 4.3.2 cDNA 合成与 RsaI 酶切结果 |
| 4.3.3 第二轮PCR 扩增结果 |
| 4.3.4 差减文库的PCR 鉴定结果 |
| 4.3.5 斑点杂交筛选 |
| 4.3.6 差异克隆测序及序列同源性检索 |
| 4.3.7 差异表达基因的功能分析 |
| 4.3.8 部分差异表达基因的RQ-PCR 验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于差异表达基因的筛选 |
| 4.4.2 部分差异表达基因的功能分析 |
| 4.4.3 关于部分差异表达基因验证结果分析 |
| 4.5 小结 |
| 5 实验四 部分差异表达基因的电子克隆及RT-PCR 验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 电子克隆方法 |
| 5.2.2 RT-PCR 实验验证方法 |
| 5.2.3 蒙古羊ADAMT51 和Id3 基因的克隆与测序 |
| 5.2.4 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 电子延伸结果 |
| 5.3.2 RT-PCR 扩增结果 |
| 5.3.3 测序结果及序列分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 关于电子克隆技术 |
| 5.4.2 ADAMT51 基因结构及在排卵中的作用 |
| 5.4.3 Id3 基因结构及生物学功能 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论、创新点及进一步研究问题 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 需进一步研究问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST（论文参考文献）
- [1]半滑舌鳎精子发生相关基因的研究及大菱鲆免疫相关EST的筛选[D]. 孟亮. 中国海洋大学, 2014(01)
- [2]东北梅花鹿茸生长期顶端组织差异表达基因的筛选和鉴定[D]. 丁玲. 东北林业大学, 2013(03)
- [3]萝卜CMS育性相关基因分离鉴定与表达特征分析[D]. 孙新菊. 南京农业大学, 2012(12)
- [4]中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库构建和Dmcl基因的克隆与序列分析[D]. 张伟. 华东师范大学, 2012(11)
- [5]菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）在苯并（a）芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究[D]. 刘娜. 中国海洋大学, 2012(01)
- [6]鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析[D]. 卢立志. 浙江大学, 2011(12)
- [7]黄河鲤性别特异片段的鉴定与性腺差异cDNA文库的构建及相关ESTS功能分析[D]. 陈建军. 河南师范大学, 2011(06)
- [8]生物信息挖掘新基因预测平台的建立与TSEG-3的克隆和功能初步研究[D]. 顾朝辉. 华中科技大学, 2010(11)
- [9]发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选[D]. 陆芳. 东北农业大学, 2010(05)
- [10]蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究[D]. 何小龙. 内蒙古农业大学, 2010(10)