一、抑制素基因重组质粒转染大肠杆菌菌种冷藏与冷冻保存的效果分析（论文文献综述）
刘乐诗[1]（2020）在《基于CRISPR/Cas12a高效克隆高GC大片段DNA技术的研究》文中研究表明天然产物（Natural Products,NPs）是药物先导化合物及临床药物的重要来源,其中微生物来源的NPs占比高达1/3。微生物药物发现在上世纪六十年代前后,经历黄金期后,最近几十年却几乎进入停滞状态,人们一度认为微生物药物资源已经枯竭。随着测序技术和生物信息学技术的发展,微生物全基因组被不断揭秘,海量暗物质样沉默基因簇（Biosynthetic Gene Cluster,BGC）被发现。这些暗物质蕴藏了大量的新颖生物活性小分子（Bioactive Small Molecules,BSMs）。通过异源表达激活沉默BGC是获得这些BSMs的主要手段。但克隆获取这些BGC大片段通常比较困难。放线菌作为微生物药物合成的主力,由于其基因组GC含量高的特性,从中直接克隆大片段DNA（≥80kb）目前依旧缺乏简单高效的方法。本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的简单、快速、直接克隆大片段DNA的体外技术平台,称为CAT-FISHING（CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosynthetic gene clustercloning platform）,适用于克隆GC含量高的大片段DNA。本研究首先设计了CAT-FISHING克隆策略,并对CRISPR/Cas12a体外切割DNA大片段的条件进行了考察和优化。随后以大小为137 kb、GC含量达66%的BAC质粒为例,利用CAT-FISHING分别从中成功克隆了50 kb和80 kb的DNA片段,成功率分别达到95%和50%。最后本研究利用BAC文库构建和DNA包埋的方法,利用CAT-FISHING在白色链霉菌J1074基因组中成功克隆到Paulomycin编码基因簇（49 kb,GC含量=71%）和Surugamides编码基因簇（87 kb,GC含量=76%）,其克隆阳性率分别为4～5%和2～4%。本研究克隆获得的87 kb BGC也已成功在链霉菌通用底盘中实现了表达。由此可见,该方法不仅实现80 kb以上高GC大片段DNA的克隆,并且具有简单、快速的优势,可以在数天之内完成从任意基因组捕获目标片段克隆,克隆效率相对于经典地通过BAC文库构建获得基因簇的方法提高了近100倍。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas12a建立的CAT-FISHING技术不仅可以实现大片段DNA（如BAC质粒）的编辑,还能高效的从任意基因组样品中快速克隆获得目标大片段基因簇。本研究利用CRISPR/Cas12a解决了具有高难度大片段高GC基因簇的高效、快速直接克隆问题并实际应用,展示出了优秀的实战效果。CAT-FISHING作为平台技术,将在基因组挖掘中有巨大的应用潜力并促进微生物来源的新颖活性小分子高效发掘。
周子超[2]（2019）在《生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究》文中指出前期研究表明,基因免疫生长抑素可以促使动物产生抗生长抑素（SS）抗体并中和内源性的生长抑素,阻断生长抑素与其受体作用,促进生长激素、胰岛素样因子-1等多种激素的分泌释放,从而促进动物的生长,改善动物的生产性能。本实验室已构建荷载pVGS/2SS-asd的减毒猪霍乱沙门氏菌活载体非抗性DNA疫苗,具备制备成本低、操作方法易、安全性好等优点,并在多种动物的临床试验中取得较好的促生长效果。对肉猪的临床试验,已完成小试与中试研究,亟需开展生产性试验,为申请转基因生物安全评定和新兽药申报及生产应用提供科学依据。本研究将实验室所保存鉴定正确的pVGS/2SS-asd电转化至ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500株制备荷载pVGS/2SS-asd减毒猪霍乱沙门氏菌活载体DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）（以下简称生长抑素DNA疫苗）并鉴定其稳定性,筛选得到最佳代次的基因工程菌作为疫苗用于免疫接种育肥猪。随后重点观察受试动物免疫应答反应、日增重、背膘厚度和背最长肌肉质,并进行抗体水平与相关性状的关联分析,从促生长和改善肉质角度综合评价疫苗的效果。此外,检测接种疫苗后猪的体温变化、猪舍周边环境中工程菌的扩散情况及出栏屠宰后组织中外源基因的整合情况和组织病理学变化,旨在评价疫苗的安全性。主要研究内容和结果如下:1.生长抑素DNA疫苗工程菌的扩大培养与稳定性将实验室保存的pVGS/2SS-asd质粒,扩增后经双酶切和测序鉴定后,电转化至ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500株,制备生长抑素DNA疫苗工程菌C500（pVGS/2SS-asd）。将制备正确的工程菌连续培养10、20、30、40、50与60代后,用PCR方法检测疫苗工程菌的关键基因,发现连续培养60代的工程菌中关键基因GS/2SS、Δasd、invA与Δcrp均稳定存在,提示疫苗工程菌在培养过程中具备良好的遗传稳定性,质粒不丢失,具备侵染性,毒力不返强。用LB培养基恒温振荡培养各代疫苗菌24h,每隔1h取样测定OD 600吸光值并绘制各代疫苗菌生长曲线,发现各代疫苗菌生长至第5h开始进入对数期,第10h进入稳定期,12h达到最大值,菌量显着高于其他代次疫苗菌（P<0.05）。提示第20、30代疫苗菌长势均优于其他代次疫苗菌,是疫苗发酵制备的最佳代次。2.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪的免疫应答反应选择50日龄DLY三元杂交猪147头,分为4组,在65日龄时分别接种（鼻饲）高(4.5×1010,n=39)、中（4.5×109CFU,n=35）、低（4.5×108CFU,n=35）剂量的生长抑素DNA疫苗工程菌和PBS（n=38,阴性对照）。鼻饲接种每日两次,连续三日;45d后加强免疫一次。收集血液,分离血清后采用ELISA方法测定抗SS抗体、相关激素和免疫细胞因子水平。结果显示:三种免疫剂量均能诱导机体产生抗体,首次免疫后高、中、低剂量组的抗体阳性率分别为30.77%、37.14%、40.0%;出栏时上述各组的抗体阳性率分别为20.51%、14.29%和20.0%。与抗体阴性组相比,抗体阳性组血中GH、IGF-1、IL-4和IFN-γ含量升高,但统计差异不显着（P>0.05）。3.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪的促生长效果各组试验猪分别在首次免疫后45d（110日龄）和出栏时（185日龄）逐头称重,结果显示;免疫组全期平均日增重（0.72±0.01 kg/d）显着（P<0.05）高于对照组（0.69±0.01 kg/d）。分析不同时间段的促生长效果,发现在50110日龄期间,免疫组平均日增重（0.73±0.01 kd/d）显着（P<0.05）高于对照组（0.69±0.01 kd/d）,但在110185日龄期间,免疫组的平均日增重（0.72±0.01 kg/d）虽然高于对照组（0.69±0.01kg/d）,但统计差异不显着（P>0.05）。比较剂量关系,发现低剂量组在实验全期的平均日增重（0.73±0.01 kg/d）最高。分析抗体阳性组的促生长效果及抗体水平与促生长的关系,发现抗体阳性组各期平均日增重均显着高于抗体阴性组（P<0.05）,抗体阳性组在50110日龄的平均日增重提高15.14%,在110185日龄期间提高4.33%,全期增重提升9.75%。全期平均日增重与各时期抗体水平呈显着正相关（r=0.396,r=0.446）。4.生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪对肉质的改善在185日龄逐头测定背膘厚度,发现抗体阳性组背膘厚度与110日龄抗体水平呈显着负相关（r=-0.406）。屠宰后分析背最长肌肉质,发现抗体阳性猪肌内脂肪显着低于抗体阴性组（P<0.05）,其他肉质指标与抗体阴性组无统计差异（P>0.05）。5.生长抑素DNA疫苗的安全性评定分别于疫苗接种后第1、3、5、7、10、12、15d测定各试验猪体温并观察行为反应,发现接种前后体温无明显变化（P>0.05）;试验猪的精神、采食和排便等情况也无异常变化。在接种后第3、5、7、10、15、30d,分别采集试验畜舍东西南北1、3、5m和通风口7m处土样,及试验栏内水样、粪样进行DNA疫苗融合片段GS/2SS PCR扩增,发现在第5日水样与第3和5日粪样中检测到重组片段,但在第5日后的样品中均未再次检测到重组片段。屠宰后采集所有试验猪的血液样品和抗体阳性个体的肌肉、肺、肝组织样品,提取基因组DNA后进行DNA疫苗融合片段GS/2SS的扩增,结果显示在PCR灵敏度范围内所有样品中均未检测到目的基因条带。对抗体阳性个体肌肉、肺、肝组织样品制作HE组织学切片并进行观察,并未发现病理学变化。
李昊[3]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中指出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
王明[4]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中认为外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
利时雨[5]（2018）在《Sirt3转染BMSC优化的β-磷酸三钙仿生骨支架的构建及成骨能力研究》文中进行了进一步梳理目的:因创伤、感染、肿瘤等疾病造成的骨缺损,面临庞大的临床修复需求。组织工程骨作为一种新型骨修复材料,受到了广泛的关注,但实际应用还存在两大难题:一是从自体提取的骨髓间充质干细胞增殖、分化效率低,难以用作组织工程的种子细胞;二是骨组织工程支架提倡模仿天然骨组织的形态结构,但目前尚无公认的模仿天然骨组织的仿生支架结构。本研究设计、制备三种不同结构的仿生支架,并通过体外生物相容性检测进行筛选。为提高增殖能力,本研究通过Sirt3转染骨髓间充质干细胞,提高细胞的氧化磷酸化水平,从而促进细胞的增殖与分化。进而将细胞/支架复合体植入大鼠颅骨缺损部位,评价体内成骨能力。旨在提供适宜体外细胞富集的仿生支架模型,并构建具有快速增殖分化能力的骨组织工程种子细胞株,为利用组织工程方法进行骨缺损修复提供新的思路和方法。方法:（1）利用参数化建模设计仿生支架的三维模型。通过水热法制备β-磷酸三钙（β-TCP）粉体并利用3D打印制备该仿生支架和0°/90°结构网格支架,通过磷酸二氢铵二次煅烧法制备天然松质骨结构支架。进行红外光谱、X射线衍射分析三种支架的理化性能表征,进行Micro-CT扫描重建、扫描电镜、压缩实验分析三种支架的结构表征。（2）分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过Giemsa染色、流式细胞术鉴定细胞后进行细胞/支架共培养,活/死细胞染色、DNA含量检测评价细胞在三种支架上增殖和粘附的效果,更换成骨诱导培养基后进行碱性磷酸酶活性和RT-PCR检测成骨相关基因表达检测,探究三种支架结构对细胞增殖、粘附、成骨分化的影响,综合实验指标选取体外生物相容性最优的一种支架结构。（3）构建pcDNA3.1-Sirt3真核表达载体,将Sirt3基因转染到SD大鼠骨髓间充质干细胞,并利用荧光显微镜、Western Blot检测蛋白表达,用相应试剂盒检测细胞耗氧量、ATP生成量、关键代谢酶活性上的变化。将细胞附着在仿生支架上,分别利用MTT法和RT-PCR检测细胞增殖和成骨相关基因表达水平的变化。（4）手术构建了 SD大鼠颅骨6.0mm直径圆形缺损动物模型,分别植入成骨诱导后,复合了 Sirt3转染骨髓间充质干细胞和正常骨髓间充质干细胞的β-磷酸三钙仿生支架。于植入后4周、8周分别进行Micro-CT扫描重建和免疫组织化学染色,评价体内骨修复效果。结果:水热法制备的粉体与锻烧法处理的牛股骨余物经检测同为β-磷酸三钙。3D打印制备的仿生支架具有较高的压缩模量、孔隙率和表面积。同时仿生支架上接种SD大鼠骨髓间充质干细胞表现出了良好的体外生物相容性。通过脂质体介导转染SD大鼠骨髓间充质细胞稳定表达Sirt3基因,转染后细胞的氧消耗增加,ATP生成增多,相关代谢酶活力旺盛,细胞增殖、分化速率显着提高。将Sirt3转染骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙仿生支架复合物植入SD大鼠颅骨缺损区域8周后,Micro-CT和免疫组化结果显示有明显新骨组织生成。结论：通过三维建模设计和3D打印制备的仿生支架具有良好的细胞相容性。Sirt3转染骨髓间充质干细胞使细胞氧化磷酸化水平显着提高,促进了细胞的增殖和分化。Sirt3转染骨髓间充质干细胞/β-磷酸三钙仿生支架复合物在体内植入后骨再生效果良好。本研究构建的新型仿生支架结构有望作为组织工程支架模版用于骨缺损修复,同时Sirt3基因有望用于构建快速增殖分化的自体骨髓间充质干细胞株,作为组织工程的种子细胞。
夏丹[6]（2016）在《关岭牛MSTN基因启动子相关转录因子的筛选、克隆及表达纯化》文中研究说明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）,是动物肌肉生长发育过程中一个重要的负调控主效基因,MSTN基因具有组织特异性,主要在骨骼肌中特异性表达;肌抑素能调控肌肉生长、动物脂肪的沉积和骨骼的生长发育,还能影响肌键和韧带的强硬度。转录因子,即反式作用因子,是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上,参与调控靶基因转录效率的蛋白质。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中,转录调控是顺式作用元件,如启动子、增强子与反式作用因子相互作用的结果。研究蛋白质与DNA的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径;生肌决定因子家族蛋白是一种骨骼肌特异性转录因子,能通过与肌肉特异性基因调控区的结合,相互协调地启动肌肉特异性基因的表达,这是骨骼肌细胞分化成熟的关键机制。本研究选择贵州关岭黄牛作为实验对象,根据Gen Bank中牛MSTN基因序列设计PCR引物,采用PCR方法扩增关岭牛MSTN基因启动子区,并利用MSTN基因启动子序列、Promoter-Binding TF Profiling AssayⅡ试剂盒和关岭牛肌肉组织的细胞核提取物,筛选关岭牛MSTN基因启动子区的转录因子结合位点。根据筛选结果,克隆关岭牛Myo D基因的CDS区,并构建重组真核表达载体pc DNA3.1（+）-Myo D和重组载体PGL3-MSTN-Pro。将重组质粒共转染小鼠C2C12细胞系,检测其24h后的双荧光素酶活性,在细胞内验证转录因子Myo D与MSTN启动子的相互作用。构建重组原核表达载体PET32a（+）-Myo D,将重组质粒转化原核表达菌株BL21（DE3）,诱导菌株表达Myo D重组蛋白,纯化目的蛋白并Western Blot验证。研究结果如下:（1）实验筛选出关岭牛MSTN基因启动子区含有Myo D、MEF2、FOXO1、SMAD、TFIID转录因子结合位点。（2）成功克隆关岭牛Myo D基因的CDS区,构建重组载体pc DNA3.1（+）-Myo D、PGL3-MSTN-Pro。（3）双荧光素酶检测结果显示,在小鼠C2C12细胞中,实验组M1/M2比值为对照组的3.6倍,且两组数据差异极显着（P<0.01）。Myo D蛋白对MSTN基因启动子活性有增强作用。（4）成功构建重组原核表达载体PET32a（+）-Myo D,并转化至原核表达菌株BL21（DE3）。（5）成功诱导原核表达菌株BL21（DE3）表达重组目的蛋白,纯化目的蛋白,Western-blot验证目的蛋白为关岭牛Myo D重组蛋白。
胡灿灿[7]（2016）在《淇河鲫MSTN基因相关microRNA的筛选与功能研究》文中进行了进一步梳理淇河鲫（Carassius auratus in Qihe River）属于银鲫的一种,天然雌核发育,脊背宽厚是区别于其它银鲫鱼最主要的特征。目前在淇河鲫育种、疾病免疫、饲料营养等方面已开展较多研究,但是淇河鲫生长性状相关的基础研究还相对薄弱,其脊背宽厚的生长机制尚不清楚。肌肉生长抑制素基因（myostatin,MSTN）是一种负调控因子,它最主要功能是调节动物的骨骼肌肉生长发育。microRNAs（miRNAs）是一类非编码单链小RNAs,近年来它的作用和功能越来越多地被发掘。miRNAs技术的发展为探索淇河鲫脊背宽厚这一问题开辟了一条新的途径。提取淇河鲫总RNA,克隆,得到淇河鲫MSTN3’UTR序列。根据MSTN 3’UTR序列通过TargetScans等软件预测出相关miRNAs,再利用RNAhybrid软件进行验证,最终选取miR-181a和miR-181b作为候选mi RNAs。以肌肉总DNA为模板,获得pri-miR-181a和pri-miR-181b全长。构建真核表达载体和miRNA慢病毒载体,通过双荧光检测和荧光原位杂交技术分别从分子水平和组织细胞定位方面确定MSTN和miR-181a、miR-181b之间的相互关系。采用qRT-PCR分析miR-181a、miR-181b和MSTN在淇河鲫脑、肌肉和心脏等8个组织的表达情况以及miR-181a、miR-181b和MSTN在胚胎发育及其在前期生长不同阶段的表达情况。由此进一步揭示淇河鲫肌肉生长相关基因间的多层次网络调控模式,探索淇河鲫肌肉生长机制。1、淇河鲫MSTN基因3’UTR的克隆提取总RNA,克隆得到MSTN基因3’UTR,拼接后获得3’UTR长度是865bp。在NCBI中,经过Blast比对发现,得到片段与鲤形目鱼类相似度较高,尤其与南亚野鲮（Labeo rohita）（91%,KR052242.1）和鲤鱼（Cyprinus carpio）（92%,LN590705.1）,淇河鲫（Carassius auratus in Qihe river）（88%,KC851952.1）同源性最高。2、淇河鲫MSTN基因相关miRNAs的预测、验证及克隆根据MSTN基因3’UTR序列结果,利用RegRNA、Pictar、TargetScan、miRWalk、miRDB等软件,,预测相关miRNAs,进一步用RNAhybrid软件验证,选取可能与MSTN基因相关的miR-181a和miR-181b作为候选miRNAs。从淇河鲫肌肉中提取总DNA,克隆pri-miR-181a和pri-miR-181b。3、真核载体的构建及双荧光检测本实验中把MSTN 3’UTR序列和加突变位点的3’UTR序列双酶切,连接至pmirGLO载体;pri-miR-181a/b双酶切,连接至Lenti H1载体,分别构建真核表达载体和miRNAs慢病毒载体。构建的两个载体共转染至293T细胞,双荧光检测发现,miR-181a/b对MSTN基因均可能有一定的抑制作用,此外还发现miR-181a/b与MSTN还可能存在其他的结合位点共同作用调节MSTN基因的表达。4、MSTN和miR-181a在肌肉组织中的表达定位取淇河鲫背部和腹部肌肉,制成石蜡切片,合成探针,检测MSTN基因和mi R-181a在肌肉组织中的表达位置。结果表明,MSTN在肌纤维中表达量较高;mi R-181a在肌浆膜中表达量较高,并且在结缔组织中也有表达。此外还发现miR-181a在背部肌肉的表达量低于腹部,在腹部肌纤维中MSTN表达量显着高于背部,因此推测在背部肌肉中miR-181a对MSTN的抑制作用可能没有腹部明显。5、淇河鲫MSTN基因及相关miR-181a/b特异性表达qRT-PCR结果显示,淇河鲫MSTN基因在不同组织表达量存在显着性差异,其中心肌和脑中最高,肌肉其次,肾脏最低;胚胎发育及前期生长不同阶段,MSTN基因在原肠胚以前,出生20d表达量显着高于其他时期。miR-181a在肌肉和鳃的表达丰度显着高于其他组织,在原肠胚以前和孵化10d后也具有较高的含量。miR-181b在脑、肌肉和肠有较高的表达量,原肠胚以前和孵化10d后表达量显着高于其他时期。
张雯[8]（2015）在《关岭牛MyoD1基因启动子上转录因子结合位点的筛选及其功能研究》文中研究指明本实验以贵州关岭牛为实验动物,对其MyoD1基因的启动子区进行研究。主要内容包括:根据GenBank中牛的MyoD1基因序列设计PCR引物,采用PCR技术扩增关岭牛MyoD1基因的启动子区,利用转录因子筛选试剂盒筛选出关岭牛MyoD1基因启动子区的转录因子结合位点;根据筛选出的结果,克隆关岭牛MyoD家族的CDS区,并构建重组克隆载体pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P1-MD、pGL3-P2-MD、pGL3-P1-MEF1和pGL3-P2-MEF1,将重组质粒转染小鼠C2C12细胞,检测其30 h后的双荧光素酶活性,分析转录因子MyoD家族和部分转录调控元件对MyoD1基因启动子启动活性的影响。研究结果如下:（1）根据实验筛选出关岭牛MyoD1基因启动子区含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、MEF2和VDR转录因子结合位点。（2）成功克隆关岭牛MyoD家族的CDS区,构建重组克隆载体pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P1-MD、pGL3-P2-MD、pGL3-P1-MEF1和pGL3-P2-MEF1。（3）重组质粒的转染结果显示,外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显着提高关岭牛MyoD1基因启动子全长P1的转录活性（P<0.05）;而外源过表达转录因子MyoD家族不能显着提高关岭牛MyoD1基因启动子核心区P2的转录活性。（4）点突变实验表明,关岭牛MyoD1基因启动子核心区的MyoD转录因子结合位点和MEF1元件突变对关岭牛MyoD1基因启动子全长P1转录活性的影响不显着;而重组突变质粒pGL3-P2-MD和pGL3-P2-MEF1在小鼠C2C12细胞中的荧光素酶活性比野生型pGL3-P2高出很多,pGL3-P2的MyoD转录因子结合位点和MEF1元件的突变能使其启动活性明显上调（P<0.01）,这2个位点对关岭牛MyoD1基因启动子核心区起着负调控的作用。
赵利亮[9]（2013）在《生长抑素基因疫苗工程菌保存方法与免疫泌乳后期奶牛的研究》文中认为本研究应用以减毒沙门氏菌为载体的新型生长抑素基因疫苗,从工程菌保存和免疫两方面开展研究：第一部分通过比较几种保存方法的效果,旨在开发提高DNA疫苗保存效果的方法,第二部分从免疫剂量方面探讨新型生长抑素DNA疫苗喷雾免疫泌乳后期奶牛的效果和安全性,旨在为生长抑素基因疫苗应用于奶牛提供试验依据。1工程菌的保存方法将发酵离心后的600mLpVGS/2SS-asd初始浓度为8.43×1010cfu/mL的菌液按照低温液态保存、低温干燥保存和冷冻干燥保存,菌液分成三个等份,在不同时期使用活菌平板计数法测定细菌存活率。其中低温液态保存探讨了pH（6.8、7.0、7.4、7.8）、保护剂（蔗糖、葡萄糖、海藻糖）及浓度（3%、5%、10%）、菌液浓度（8.43×1010cfu/mL、 8.43×109cfu/mL、8.43 X 108cfu/mL）等条件下的保存效果；低温干燥保存探讨了100g麸皮中加入不同菌液量（1mL、2mL、L、8mL）的保存效果；冷冻干燥保存探讨了不同冷冻保护剂（A、B、C）和初始菌液浓度（8.43 X 1010cfu/mL、8.43 X 109cfu/mL、8.43×108cfu/mL）的保存效果。结果表明,低温液态保存各因素中存活率最高的分别为pH7.0、3%蔗糖、菌液浓度8.43×1010cfu/mL,在相同时期下又以pH7.0存活率最高；低温4℃干燥保存方法中以1%菌液量细菌存活率相对较高,但1周后存活率仅为0.31%,不适合细菌保存；冷冻干燥保存方法中以配方A为冷冻保护剂的细菌存活率高,且初始菌液浓度越高越利于细菌保存。在15天时低温液态保存（pH7.0、未加糖类、菌液浓度8.43×1010cfu/mL）细菌存活率仍有50.2%,优于存活率在15%左右的冷冻保存法,15天以上低温液态保存细菌存活率显着下降,以冷冻干燥保存（冷冻保护剂A、初始菌液浓度8.43×1010cfu/mL）最好。2生长抑素基因疫苗免疫泌乳后期奶牛的研究为了探讨新型生长抑素DNA疫苗-pVGS/2SS-asd对泌乳后期奶牛安全性和泌乳性能的影响以及免疫剂量的关系,选择80头遗传背景和产奶量相对一致的泌乳后期奶牛,分为4组,每组20头。菌液浓度调整为1×1010cfu/mL,每天2次,分高（每次15mL）、中（每次10mL）、低（每次5mL）三种剂量处理奶牛,对照组（每次10mL）鼻饲10%铝胶生理盐水。结果表明pVGS/2SS-asd生长抑素DNA疫苗经过免疫后7天的连续观测对奶牛无安全性影响；免疫12周后仍可检出抗体,中剂量组在诱导产生抗体效价水平和抗体阳性牛的比例优势明显；各剂量组均有一定程度促进奶牛泌乳,低剂量组表现突出,第2周时相比对照组提高了2kg/d；各剂量组在4周前可提高乳脂率和蛋白率,对体细胞数无影响,以中剂量组最为明显。
陈建文[10]（2012）在《利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究》文中研究指明仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，给世界养猪业造成了极大地经济损失。传统预防和治疗猪腹泻的方法如改善环境、服食抗菌素和免疫接种等缺点日渐明显，存在很多风险和问题，因此，迫切需要我们用新的方法和手段来有效控制这种疾病的发生。随着分子生物学技术的快速发展，通过转基因操作改良性状的生物育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，直接跨越基因互作的消极影响，可以同时改良多个重要经济性状，这是一种新的富有生命力的疾病控制方法，具有传统的免疫学方法控制疾病所无法比拟的优势。因此，利用转基因技术开展猪抗病育种研究，开发出具有自主知识产权和抗腹泻病转基因猪抗病新品种，提高疾病控制水平，有效控制这种疾病，意义重大。本研究主要从两个方面入手创制转基因抗病育种新材料：一是通过RNAi技术，培育特殊抗病力（ETEC F18）的转基因猪生物育种新材料；二是通过乳腺生物反应器模型培育一般抗病力抗病转基因猪生物育种新材料。主要结果如下：1.通过RNAi技术培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)建立了一种基于Cre-LoxP的多启动子介导多个shRNA的方法，获得了干扰FUT1的转基因囊胚；2)建立了一种由慢病毒介导shRNA的方法，获得了7头转基因猪，并从其相关免疫学指标及小肠粘附抑制等生物学功能进行了抗病性研究；3)利用2)中获得的慢病毒感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），结果显示RNA干扰前后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附能力无显着差异，结合国内外研究，证明了FUT1不是F18大肠杆菌致病的主要受体基因；2.通过乳腺生物反应器模型培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)为探讨转pBD-1基因小鼠在疾病方面的抗病作用，利用小鼠可以在SPF这一环境下饲养的这一优势，开展pBD-1在动物水平群体抗病性及上的功能研究，建立了一种猪防御素-1（pBD-1）转基因小鼠模型，为建立大动物抗病育种模型奠定了基础；2)为了评估表达载体设计的合理性和高效性，为进一步开展利用乳腺生物反应器模型培育一般抗病力的生物新品种奠定基础，建立了一种乳腺生物反应器载体验证的细胞模型，同时通过细胞模型预测转基因成体动物相关免疫应答通路奠定了基础及建立了研究模型；3)建立了转人溶菌酶的转基因细胞系，并进行移植，获得了9头胎儿；4)建立了转pBD-1的转基因细胞系，并进行移植，获得了转基因囊胚。本研究的创新点：首次建立了一种由4启动子介导4个shRNA的全部筛选标记可去除的表达载体，并首次获得了干扰FUT1的转基因囊胚；首次通过体细胞核移植获得了慢病毒介导的RNA干扰的大动物模型；首次在细胞学水平上证明了FUT1不是导致仔猪腹泻与水肿病的主效受体基因；首次利用细胞模型对猪防御素进行了研究，初步建立了一种乳腺生物反应器的细胞模型；首次获得了转pBD-1的转基因小鼠与转基因猪囊胚。
二、抑制素基因重组质粒转染大肠杆菌菌种冷藏与冷冻保存的效果分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抑制素基因重组质粒转染大肠杆菌菌种冷藏与冷冻保存的效果分析（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR/Cas12a高效克隆高GC大片段DNA技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 耐药菌与抗生素等微生物药物的困局 |
| 1.2 后基因组时代微生物药物发掘策略 |
| 1.3 基因簇异源表达与基因簇克隆 |
| 1.4 CRISPR/Cas技术及其在DNA编辑组装中的应用 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas12a的特性及其应用 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas12a与DNA组装 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用菌种和质粒 |
| 2.1.2 试剂和溶液 |
| 2.1.3 培养基的配置 |
| 2.1.4 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 微生物培养和发酵 |
| 2.2.2 发酵样品的处理 |
| 2.2.3 分子生物学基本操作 |
| 第3章 CRISPR/Cas12a切割体系优化与CAT-FISHING技术的建立与表征 |
| 3.1 CAT-FISHING技术设计原理 |
| 3.2 捕捉质粒的设计与构建 |
| 3.3 CRISPR/Cas12a体外切割体系的优化 |
| 3.4 CAT-FISHING克隆效率评估 |
| 3.5 利用CAT-FISHING从BAC质粒中直接克隆大片段DNA |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 基于CAT-FISHING技术的链霉菌基因簇快速高效克隆与表达 |
| 4.1 链霉菌基因组酶切条件的优化 |
| 4.2 链霉菌基因簇克隆流程设计与优化 |
| 4.3 49kb与87kb基因簇的直接克隆与验证 |
| 4.4 Surugamides基因簇在无簇底盘菌中的异源表达及产物分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 |
（2）生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 生长抑素基因免疫研究进展 |
| 1.1.1 生长抑素DNA疫苗的构建 |
| 1.1.2 生长抑素DNA疫苗的稳定性 |
| 1.1.3 生长抑素DNA疫苗的免疫效果 |
| 1.1.4 生长抑素DNA疫苗免疫程序的优化 |
| 1.2 生长抑素DNA疫苗安全性的研究进展 |
| 1.2.1 DNA整合 |
| 1.2.2 自身免疫反应 |
| 1.2.3 生殖毒性 |
| 1.2.4 免疫耐受 |
| 1.2.5 其他辅助因子的副作用 |
| 1.2.6 DNA疫苗环境安全 |
| 1.3 生产性试验的必要性 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 质粒与菌株 |
| 2.2 主要药品和试剂 |
| 2.3 试剂盒与工具酶 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.1.1 质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.2 质粒序列的测序比对 |
| 3.2 生长抑素DNA疫苗工程菌的制备 |
| 3.2.1 沙门氏菌感受态的制备 |
| 3.2.2 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 3.2.3 ΔasdΔcrp双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500 株的电转化 |
| 3.3 生长抑素DNA疫苗工程菌稳定性检测 |
| 3.3.1 工程菌体外的传代培养 |
| 3.3.2 传代菌株关键基因稳定性检测 |
| 3.3.3 工程菌生长性能稳定性检测 |
| 3.4 生长抑素DNA疫苗工程菌对育肥猪生长性能及免疫应答的影响 |
| 3.4.1 疫苗的发酵制备 |
| 3.4.2 试验动物的挑选与饲养管理 |
| 3.4.3 免疫试验设计 |
| 3.4.4 试验猪称重与血液采集 |
| 3.4.5 相关抗体、激素和细胞因子检测 |
| 3.4.6 组织采集 |
| 3.4.7 肉质分析 |
| 3.5 生长抑素DNA疫苗的安全性评价 |
| 3.5.1 疫苗环境安全检测 |
| 3.5.2 基因整合检测 |
| 3.5.3 组织病理学变化观察 |
| 3.6 数据分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 生长抑素DNA疫苗的鉴定 |
| 4.1.1 质粒的鉴定 |
| 4.1.2 生长抑素DNA疫苗工程菌的鉴定 |
| 4.2 生长抑素DNA疫苗工程菌稳定性 |
| 4.2.1 生长抑素DNA疫苗工程菌关键基因的稳定性 |
| 4.2.2 生长抑素DNA疫苗工程菌生长性能的稳定性 |
| 4.3 生长抑素DNA疫苗促生长效果的整体表现 |
| 4.4 生长抑素DNA疫苗的免疫应答 |
| 4.4.1 生长抑素抗体效价与阳性率 |
| 4.4.2 血清IL-4与IFN-γ水平 |
| 4.4.3 血清GH与IGF-1水平 |
| 4.5 抗体阳性猪的体重变化及其与抗体水平的相关性分析 |
| 4.6 抗体阳性猪背膘厚度变化及其与抗体水平的相关分析 |
| 4.7 抗体阳性猪肉质分析 |
| 4.8 生长抑素DNA疫苗的安全性评价 |
| 4.8.1 生长抑素DNA疫苗接种后的体温反应 |
| 4.8.2 疫苗环境安全检测 |
| 4.8.3 DNA整合检测 |
| 4.8.4 组织病理学变化观察 |
| 5 讨论 |
| 5.1 生长抑素DNA疫苗的鉴定与稳定性 |
| 5.2 生长抑素DNA疫苗的免疫应答与促生长效果 |
| 5.3 生长抑素DNA疫苗对肉质的影响 |
| 5.4 生长抑素DNA疫苗的安全性 |
| 全文总结 |
| 创新与不足 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（5）Sirt3转染BMSC优化的β-磷酸三钙仿生骨支架的构建及成骨能力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨组织工程用于骨缺损修复 |
| 1.2 骨髓间充质干细胞 |
| 1.3 成骨诱导分化 |
| 1.4 Sirt3基因对氧化磷酸化的调控 |
| 1.5 基因转染骨髓间充质干细胞用于组织工程 |
| 1.6 组织工程仿生支架 |
| 1.7 3D打印技术用于制备组织工程支架 |
| 1.8 研究内容及创新点 |
| 第二章 松质骨仿生支架的设计制备及检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 松质骨仿生支架三维建模 |
| 2.4 水热法制备β-磷酸三钙粉体与初步表征检测 |
| 2.5 3D打印制备支架 |
| 2.6 磷酸二氢铵法煅烧牛松质骨骨块 |
| 2.7 材料表征检测 |
| 2.8 支架结构检测 |
| 2.9 实验结果与讨论 |
| 2.10 小结 |
| 第三章 仿生支架的体外生物相容性检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定 |
| 3.4 细胞/支架共培养及细胞粘附检测 |
| 3.5 成骨诱导分化及检测 |
| 3.6 统计学方法 |
| 3.7 实验结果与讨论 |
| 3.8 小结 |
| 第四章 Sirt3转染骨髓间充质干细胞的构建及细胞增殖、分化检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 Sirt3目的基因的获取、扩增与纯化 |
| 4.4 目的片段和克隆载体的体外重组 |
| 4.5 感受态大肠杆菌DH5α的制备与重组质粒转化 |
| 4.6 重组质粒的提取与鉴定 |
| 4.7 骨髓间充质干细胞的转染 |
| 4.8 Sirt3蛋白表达水平检测 |
| 4.9 细胞呼吸代谢水平检测 |
| 4.10 细胞增殖检测 |
| 4.11 细胞/支架共培养及细胞粘附检测 |
| 4.12 成骨诱导分化 |
| 4.13 成骨相关基因表达水平检测 |
| 4.14 统计学方法 |
| 4.15 实验结果及讨论 |
| 4.16 小结 |
| 第五章 动物实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 动物实验分组及造模 |
| 5.4 颅骨缺损修复动物实验 |
| 5.5 Micro-CT分析 |
| 5.6 组织学及免疫组化染色分析 |
| 5.7 实验结果与讨论 |
| 5.8 小结 |
| 第六章 本文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（6）关岭牛MSTN基因启动子相关转录因子的筛选、克隆及表达纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 MSTN基因 |
| 1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.2 MSTN基因的结构 |
| 1.3 MSTN基因的生物学功能 |
| 1.3.1 MSTN基因对骨骼肌的影响 |
| 1.3.2 MSTN基因对脂肪组织的影响 |
| 1.3.3 MSTN基因的其他功能 |
| 1.4 MSTN基因的作用机制及信号传导 |
| 1.4.1 MSTN基因的作用机制 |
| 1.4.2 MSTN基因的信号传导 |
| 2 MyoD基因 |
| 3 真核生物的基因转录调控 |
| 3.1 启动子 |
| 3.2 转录因子 |
| 3.3 启动子与转录因子相互作用的研究方法 |
| 4 研究的目的与意义 |
| 第二章 关岭牛MSTN基因启动子区转录因子结合位点的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 关岭牛组织DNA的提取 |
| 1.2.2 关岭牛MSTN基因启动子的克隆 |
| 1.2.3 pUCm-T-MSTN-pro重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.4 关岭牛MSTN基因启动子区转录因子结合位点的筛选 |
| 1.2.5 实验数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 关岭牛组织DNA的提取 |
| 2.2 MSTN基因启动子的克隆 |
| 2.3 pUCm-T-MSTN-pro重组质粒的构建和鉴定 |
| 2.4 关岭牛MSTN基因启动子区目的片段和细胞核提取物的浓度测定 |
| 2.5 关岭牛MSTN基因启动子区转录因子结合位点的筛选 |
| 2.5.1 利用Promoter-Binding TF Profiling Assay Ⅱ试剂盒筛选MSTN基因启动子区转录因子结合位点 |
| 2.5.2 MSTN基因启动子序列生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 转录因子MyoD对关岭牛MSTN基因启动子活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 组织RNA的提取及反转录 |
| 1.2.2 MyoD基因CDS区的克隆及与pcDNA3.1(+)载体的连接 |
| 1.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.4 重组质粒pcDNA3.1(+)-MyoD的构建 |
| 1.2.5 重组报告载体PGL3-MSTN-Pro的构建 |
| 1.2.6 重组质粒的提取 |
| 1.2.7 关岭牛MyoD基因CDS区的生物信息学分析 |
| 1.2.8 小鼠C2C12细胞的培养 |
| 1.2.9 转录因子MyoD对PGL3-MSTN-Pro活性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 关岭牛MyoD基因CDS区的克隆 |
| 2.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1(+)-MyoD的鉴定 |
| 2.2.2 重组报告载体PGL3-MSTN-Pro的鉴定 |
| 2.3 关岭牛MyoD基因CDS区的生物信息学分析 |
| 2.4 荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.4.1 细胞的转染效率 |
| 2.4.2 双荧光素酶活性检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 关岭牛MyoD基因原核表达载体的构建及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 关岭牛MyoD基因CDS区的克隆 |
| 1.2.2 关岭牛MyoD基因CDS区片段与PET32a（+）载体连接 |
| 1.2.3 大肠杆菌表达感受态细胞BL21（DE3）的制备 |
| 1.2.4 MyoD基因原核表达载体的构建 |
| 1.2.5 重组质粒菌种的保存 |
| 1.2.6 MyoD基因CDS区的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组载体PET32a(+)-MyoD的鉴定结果 |
| 2.2 关岭牛MyoD基因CDS区的生物信息学分析 |
| 2.2.1 MyoD基因CDS区的序列分析 |
| 2.2.2 MyoD蛋白理化性质分析 |
| 2.2.3 MyoD蛋白二级结构分析 |
| 2.2.4 MyoD蛋白结构域预测 |
| 2.2.5 MyoD蛋白的定位预测 |
| 2.3 PET-32a(+)-MyoD重组载体的分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 关岭牛MyoD基因原核表达及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组蛋白表达形式的确定 |
| 1.2.2 诱导温度和IPTG浓度、时间对表达结果的影响 |
| 1.2.3 SDS-PAGE分析 |
| 1.2.4 可溶性蛋白的纯化 |
| 1.2.5 蛋白的浓度测定 |
| 1.2.6 重组蛋白的Western-blot检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组蛋白的表达形式 |
| 2.2 诱导温度和IPTG浓度、时间对表达结果的影响 |
| 2.2.1 诱导温度和IPTG浓度对表达结果的影响 |
| 2.2.2 诱导时间对表达结果的影响 |
| 2.3 重组蛋白的纯化和浓度测定 |
| 2.4 重组蛋白的Western-blot检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）淇河鲫MSTN基因相关microRNA的筛选与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鱼类MSTN基因研究进展 |
| 1.1.1 鱼类MSTN基因的结构和表达类型 |
| 1.1.2 MSTN基因在鱼类生产中的研究进展 |
| 1.2 miRNAs的研究现状及其应用功能 |
| 1.2.1 miRNAs的研究背景及简介 |
| 1.2.2 miRNAs合成机制 |
| 1.2.3 miRNAs目标基因的预测方法 |
| 1.2.4 miRNAs在不同组织中的表达研究 |
| 1.2.5 鱼类miRNAs的相关功能 |
| 1.3 鱼类肌肉生长相关miRNAs的研究进展 |
| 1.3.1 鱼类肌肉发育相关miRNAs研究进展 |
| 1.3.2 鱼类MSTN基因相关miRNAs的研究进展 |
| 1.4 miRNAs在本实验中的应用讨论 |
| 第二章 淇河鲫MSTN基因 3’UTR的克隆 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 载体和菌种 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 试剂配制与实验准备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 组织取样及总RNA提取 |
| 2.2.2 引物的设计 |
| 2.2.3 第一链cDNA合成 |
| 2.2.4 淇河鲫MSTN基因部分片段的克隆 |
| 2.2.5 3’UTR片段和加突变位点的 3’UTR片段的双酶切 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 Total RNA的质量检测 |
| 2.3.2 淇河鲫MSTN基因 3’UTR序列全长 |
| 2.3.3 淇河鲫MSTN基因 3’UTR序列 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 淇河鲫MSTN基因相关miRNAs的预测、验证及克隆 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验样本 |
| 3.1.2 实验试剂、耗材及仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 预测MSTN相关miRNAs |
| 3.2.1 预测miRNAs的相关软件 |
| 3.2.2 MSTN相关miRNAs的预测结果 |
| 3.2.3 预测相关miRNAs的验证 |
| 3.3 候选miRNAs的克隆与双酶切 |
| 3.3.1 miRNAs的克隆 |
| 3.3.2 miRNAs的双酶切 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 真核载体的构建及双荧光检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要载体 |
| 4.1.2 构建载体所需要的主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 真核载体的构建 |
| 4.2.2 构建含有miR-181a和miR-181b的慢病毒载体 |
| 4.2.3 293T细胞的培养 |
| 4.2.4 构建的真核表达载体和含有miRNAs的慢病毒载体共转染 293T细胞 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 293T细胞形态学观察 |
| 4.3.2 293T细胞转染效率观察 |
| 4.3.3 双荧光检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 MSTN和miR-181a在肌肉组织中的表达定位 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用鱼 |
| 5.1.2 试剂及配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 石蜡包埋 |
| 5.2.2 探针序列 |
| 5.2.3 荧光检测步骤 |
| 5.2.4 注意事项 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 肌肉细胞形态学结构 |
| 5.3.2 原位杂交荧光分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 淇河鲫MSTN基因和miR-181a/b特异性表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验用鱼 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 组织取样及总RNA提取 |
| 6.2.2 第一链cDNA合成 |
| 6.2.3 淇河鲫MSTN基因和miR-181a和miR-181b实时定量PCR |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 Total RNA的质量检测 |
| 6.3.2 淇河鲫不同组织中MSTN基因和miR-181a、mi R-181b特异性分析 |
| 6.3.3 淇河鲫胚胎发育不同时期MSTN基因和miR-181a、miR-181b特异性表达分析 |
| 6.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间学术业绩 |
（8）关岭牛MyoD1基因启动子上转录因子结合位点的筛选及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 MyoD基因家族 |
| 1.1 MyoD1基因 |
| 1.2 Myf5基因 |
| 1.3 Myf6基因 |
| 1.4 MyoG基因 |
| 2 启动子的结构、功能和研究概述 |
| 2.1 动物启动子的结构和功能 |
| 2.2 启动子的研究概述 |
| 2.2.1 启动子的生物信息学分析和预测 |
| 2.2.2 启动子缺失分析 |
| 2.2.3 点突变分析 |
| 2.2.4 启动子与转录因子的互作分析 |
| 2.2.5 启动子的甲基化和多态性研究 |
| 2.3 启动子研究的意义 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 关岭牛MyoD1基因启动子区转录因子结合位点的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物与样品 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 关岭牛基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 关岭牛MyoD1基因启动子的克隆 |
| 1.2.3 pUCm-T-MyoD1-pro重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.4 关岭牛MyoD1基因启动子上转录因子结合位点的筛选 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2 MyoD1基因启动子克隆 |
| 2.3 pUCm-T-MyoD1-pro重组质粒的构建和鉴定 |
| 2.4 关岭牛MyoD1基因启动子区目的片段和细胞核提取物的浓度测定 |
| 2.5 关岭牛MyoD1基因启动子区转录因子结合位点的筛选 |
| 2.5.1 Promoter-Binding TF Profiling AssayⅡ的筛选结果 |
| 2.5.2 在线软件对关岭牛MyoD1基因启动子上转录因子结合位点的预测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 关岭牛MyoD家族CDS区的扩增、生物信息学分析及其真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品与菌种 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 提取RNA前的准备工作 |
| 1.2.2 关岭牛背最长肌总RNA提取和cDNA合成 |
| 1.2.3 引物的设计 |
| 1.2.4 关岭牛MyoD家族CDS区的扩增 |
| 1.2.5 MyoD基因家族的序列分析 |
| 1.2.6 关岭牛MyoD家族CDS区扩增产物的回收纯化 |
| 1.2.7 回收纯化的关岭牛MyoD家族CDS区和pcDNA3.1(+)质粒的双酶切 |
| 1.2.8 DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.9 重组质粒pcDNA3.1(+)-MyoD家族的构建 |
| 1.2.10 重组质粒pcDNA3.1(+)-MyoD家族的鉴定 |
| 1.2.11 重组质粒的菌种保藏 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2 关岭牛MyoD家族CDS区的扩增 |
| 2.3 关岭牛MyoD基因家族的序列分析 |
| 2.3.1 序列比对 |
| 2.3.2 关岭牛MyoD家族蛋白理化性质分析 |
| 2.3.3 关岭牛MyoD家族蛋白疏(亲)水性预测 |
| 2.3.4 关岭牛MyoD家族蛋白二级结构预测 |
| 2.3.5 关岭牛MyoD家族蛋白的结构域分析 |
| 2.3.6 关岭牛MyoD家族蛋白的跨膜螺旋特征 |
| 2.3.7 MyoD家族基因序列的同源性分析 |
| 2.4 重组质粒的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 关岭牛MyoD家族对MyoD1基因启动子活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品与菌种 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计 |
| 1.2.2 重组质粒pGL3-P1和pGL3-P2 的构建 |
| 1.2.3 重组质粒pGL3-P1和pGL3-P2 的鉴定及菌液保存 |
| 1.2.4 小鼠C2C12 细胞的培养 |
| 1.2.5 无内毒素的重组质粒的提取及浓度和纯度测定 |
| 1.2.6 MyoD家族对pGL3-P1和pGL3-P2 的转录活性的影响 |
| 1.2.7 荧光素酶活性检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.2 重组质粒pGL3-P1和pGL3-P2 的酶切鉴定 |
| 2.3 测序结果及序列分析 |
| 2.4 荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.4.1 不同剂量MyoD家族对pGL3-P1 转录活性的影响 |
| 2.4.2 MyoD家族对pGL3-P2 转录活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 MyoD转录因子结合位点和MEF1 元件的突变对关岭牛MyoD1启动子活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验样品与菌种 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 常用试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计 |
| 1.2.2 突变质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.3 突变质粒的菌液保存 |
| 1.2.4 小鼠C2C12 细胞的培养 |
| 1.2.5 无内毒素的重组质粒的提取及浓度和纯度测定 |
| 1.2.6 突变质粒的转染 |
| 1.2.7 荧光素酶活性检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 突变质粒的构建 |
| 2.2 突变质粒的鉴定 |
| 2.3 MyoD转录因子结合位点和MEF1 元件突变对pGL3-P1 转录活性的影响 |
| 2.4 MyoD转录因子结合位点和MEF1 元件突变对pGL3-P2 转录活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）生长抑素基因疫苗工程菌保存方法与免疫泌乳后期奶牛的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 工程菌保存方法研究进展 |
| 1 菌种保存主要方法 |
| 1.1 传代培养保存法 |
| 1.1.1 斜面传代培养保存 |
| 1.1.2 高层半固体培养保存 |
| 1.1.3 液体石蜡保存法 |
| 1.2 载体保存法 |
| 1.2.1 砂土保存法 |
| 1.2.2 滤纸法 |
| 1.3 冷冻保存法 |
| 1.3.1 甘油冷冻保存法 |
| 1.3.2 低温冷冻法 |
| 1.4 液氮超低温保存法 |
| 1.5 冷冻干燥保存法 |
| 1.5.1 冷冻保护剂对保存效果的影响 |
| 1.5.2 冻干曲线对保存效果的影响 |
| 2 菌种保存其他方法 |
| 2.1 细菌湿种牛奶冻存法 |
| 2.2 悬液保存法 |
| 2.3 脱纤维羊血冷冻保存法 |
| 第二章 生长抑素基因免疫研究进展 |
| 1 生长抑素基因疫苗的构建和安全性评价 |
| 1.1 生长抑素基因疫苗的构建 |
| 1.2 生长抑素基因疫苗的安全性评价 |
| 1.2.1 基因整合 |
| 1.2.2 抗DNA抗体 |
| 1.2.3 免疫耐受 |
| 1.2.4 免疫佐剂 |
| 1.2.5 其它问题 |
| 2 生长抑素基因疫苗的接种方式和免疫途径研究进展 |
| 2.1 注射免疫 |
| 2.1.1 肌肉注射 |
| 2.1.2 皮内注射 |
| 2.1.3 静脉注射和腹腔注射 |
| 2.2 粘膜免疫 |
| 2.3 基因枪 |
| 2.4 电穿孔 |
| 3 生长抑素基因疫苗的免疫效果研究进展 |
| 3.1 生长抑素基因疫苗促进动物生长 |
| 3.2 生长抑素基因疫苗促进动物泌乳 |
| 4 生长抑素基因疫苗存在的问题和发展前景 |
| 4.1 生长抑素基因疫苗存在的问题 |
| 4.2 生长抑素基因疫苗存在的发展前景 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 工程菌保存方法研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验菌株 |
| 2.2 溶液配制 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 质粒小提鉴定 |
| 2.6 细菌发酵与浓缩 |
| 2.7 细菌平板计数 |
| 2.8 不同菌种保存方法 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同pH值的细菌存活率 |
| 3.2 不同保护剂及浓度的细菌存活率 |
| 3.3 不同初始浓度的细菌存活率 |
| 3.4 低温干燥保存的细菌存活率 |
| 3.5 菌液冻干后的形状 |
| 3.6 不同冷冻保护剂冷冻干燥保存的细菌存活率 |
| 3.7 三种不同保存方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 第四章 生长抑素基因疫苗免疫泌乳后期奶牛的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 基因疫苗和试验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 疫苗制备 |
| 2.5 动物免疫 |
| 2.6 安全性观察 |
| 2.7 样采集 |
| 2.8 抗体效价检测 |
| 2.9 产奶量和DHI检测 |
| 2.10 激素测定 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 双酶切鉴定结果 |
| 3.2 安全性观察 |
| 3.3 抗体效价和抗体阳性牛比例 |
| 3.4 奶牛日常奶量分析 |
| 3.5 奶牛免疫后不同时期DHI结果分析 |
| 3.6 奶牛免疫12周后GH、PRL、SS结果分析 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图（表）清单 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 猪腹泻与水肿病概况 |
| 1.1 猪腹泻与水肿病现状 |
| 1.2 猪腹泻与水肿病病原学基础 |
| 1.2.1 肠毒素大肠杆菌 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.3 猪腹泻与水肿病的免疫学与营养学调控基础 |
| 1.4 主要抗性与功能基因 |
| 1.4.1 ETEC 受体基因 |
| 1.4.2 抗菌肽基因 |
| 1.4.3 人溶菌酶基因 |
| 2 RNA 干扰技术与转基因育种研究概况 |
| 2.1 RNA 干扰技术的发现 |
| 2.2 RNA 干扰技术在畜禽哺乳类动物中的应用 |
| 2.2.1 RNAi 在口蹄疫中的应用 |
| 2.2.2 RNAi 在阮病毒中的应用 |
| 2.2.3 RNAi 在抗流感中的应用 |
| 2.2.4 RNAi 在其他疾病中的应用 |
| 2.2.5 RNAi 在肉质改良中的的应用 |
| 3 转基因猪研究概况 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 利用 RNA 干扰技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 |
| 引言 |
| 第一节 利用 CRE-LOXP 介导的多启动子 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪胚胎 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.1.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 |
| 2.1.2 表达载体的线性化 |
| 2.1.3 pGenesil1.1，pGenesil1.2，pGenesil1.3，pGenesil1.4 表达载体的构建 |
| 2.1.4 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2.1 MCS-3s-LoxP-GFP 多功能全标记去除骨架载体的构建 |
| 2.2.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.3 猪胎儿成纤维细胞培养和转基因稳定细胞系的建立 |
| 2.3.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立(组织块法) |
| 2.3.2 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 |
| 2.3.3 猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系目的基因整合检测 |
| 2.3.4 Real-time PCR 对转基因稳定细胞系的检测 |
| 2.4 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.5 体细胞核移植显微操作 |
| 2.6 重构卵的融合与激活 |
| 2.7 转基因胚胎的鉴定 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 3.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 3.3 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立与鉴定 |
| 3.4 转基因克隆胚的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于 RNAi 研究策略 |
| 4.2 关于转基因动物生物安全 |
| 5 小结 |
| 第二节 慢病毒介导的 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞、载体与菌株 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 |
| 2.1.1 siRNA 的设计 |
| 2.1.2 双链 Oligo（ds oligo）的制备 |
| 2.1.3 FUT1 基因 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2 FUT1 基因过表达载体的构建 |
| 2.2.1 FUT1 基因的克隆 |
| 2.2.2 pEGFP-N1-FUT1 表达载体的构建 |
| 2.3 RNA 干扰有效靶点筛选 |
| 2.3.1 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 2.3.2 RNA 干扰有效靶点蛋白水平的验证 |
| 2.4 RNA 干扰有效靶点慢病毒表达载体的构建 |
| 2.4.1 miR-3 靶点慢病毒载体的构建 |
| 2.4.2 miR-1 靶点慢病毒载体的构建 |
| 2.5 慢病毒包装和病毒滴度的测定 |
| 2.5.1 慢病毒包装 |
| 2.5.2 慢病毒滴度测定 |
| 2.6 猪胎儿成纤维细胞培养和药物（Blasticidin）致死曲线的摸索 |
| 2.7 猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系的建立 |
| 2.8 转基因细胞系整合与干扰效率检测 |
| 2.9 转基因细胞系相关通路基因检测 |
| 2.10 ELISA 检测转基因细胞上清液中干扰素和细胞因子应答反应 |
| 2.11 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.12 体细胞核移植显微操作 |
| 2.13 重构卵的融合与激活 |
| 2.14 转基因核移植胚胎体外发育研究 |
| 2.15 转基因核移植胚胎移植和妊娠检测 |
| 2.16 转基因克隆猪的产生及鉴定 |
| 2.17 转基因克隆猪耳缘成纤维细胞系的建立 |
| 2.18 转基因猪相关基因组织表达谱检测 |
| 2.19 转基因猪生理生化指标检测 |
| 2.20 转基因猪相关免疫学指标检测 |
| 2.21 转基因猪小肠上皮细胞体外黏附抑制 |
| 2.22 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 |
| 2.23 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因黏附检测 |
| 2.24 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体和过表达载体的构建 |
| 3.2 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.2.1 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.2.2 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.3 RNA 干扰有效靶点慢病毒的包转及病毒滴度测定 |
| 3.4 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 |
| 3.5 转基因细胞整合鉴定 |
| 3.6 猪胎儿成纤维转基因细胞干扰效率及凋亡基因检测 |
| 3.7 猪胎儿成纤维转基因细胞相关通路基因表达检测 |
| 3.8 猪胎儿成纤维转基因细胞上清液细胞因子及干扰素应答检测 |
| 3.9 转基因克隆胚胎体外发育 |
| 3.10 转基因克隆胚胎胚胎移植和产生 |
| 3.11 转基因克隆猪的鉴定 |
| 3.12 克隆猪耳成纤维细胞建系 |
| 3.14 转基因猪相关生理生化指标检测 |
| 3.15 转基因猪相关免疫学指标检测 |
| 3.16 转基因猪相关基因组织表达谱检测 |
| 3.17 转基因克隆猪小肠组织黏附实验 |
| 3.18 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 |
| 3.19 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系黏附实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNAi 研究策略的选取 |
| 4.1.1 有效靶点筛选策略 |
| 4.1.2 RNAi 对照组的选取 |
| 4.1.3 RNAi 效应的检测 |
| 4.1.4 RNAi 系统的选择 |
| 4.1.5 RNAi 中细胞来源的选择 |
| 4.2 转基因细胞系质量评价 |
| 4.3 核移植程序改进 |
| 4.4 转基因克隆胚胎体外发育研究 |
| 4.5 转基因猪抗病验证 |
| 4.5.1 转基因猪免疫指标检测 |
| 4.5.2 重组菌与仔猪小肠上皮细胞的体外黏附抑制试验 |
| 4.6 F18 受体鉴定 |
| 5 小结 |
| 第二章 利用乳腺组织特异性表达技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 |
| 引言 |
| 第三节 乳腺特异性表达猪防御素转基因小鼠模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 实验动物与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pBD-1 基因片段的设计与合成 |
| 2.2 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.3 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的提取与纯化 |
| 2.4 转基因小鼠的制备 |
| 2.4.1 Founder 转基因小鼠制备流程 |
| 2.4.2 Founder 转基因小鼠鉴定 |
| 2.4.3 F1~F2 代转基因鼠的产生与鉴定 |
| 2.4.4 转基因小鼠表达鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 3.2 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体显微注射 DNA 片段的获取 |
| 3.3 Founder 转基因小鼠鉴定 |
| 3.4 pBD-1 基因的遗传检测 |
| 3.5 pBD-1 基因的表达检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于乳腺特异性表达载体的构建 |
| 4.2 关于转基因小鼠的表达分析 |
| 5 小结 |
| 第四节 利用乳腺特异性表达人溶菌酶生产转基因猪克隆胎儿的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞、载体与菌株 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 药物 G418 致死曲线的摸索 |
| 2.2 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与整合鉴定 |
| 2.3 外源激素诱导 hLYZ 在转基因细胞中的表达及浓缩 |
| 2.4 hLYZ 在 C127 转基因细胞 mRNA 水平上的表达 |
| 2.5 hLYZ 在 C127 转基因细胞重组蛋白的表达 |
| 2.6 C127 转基因细胞上清液中重组人溶菌酶活性分析 |
| 2.7 猪胎儿成纤维细胞转染 hLYZ 基因稳定细胞系的建立与鉴定 |
| 2.8 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.9 体细胞核移植显微操作 |
| 2.10 重构卵的融合与激活 |
| 2.11 转基因胚胎胚胎移植 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 乳腺表达载体的抽提及纯化 |
| 3.2 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与整合鉴定 |
| 3.3 RT-PCR 检测 hLYZ 基因在 C127 细胞中的表达 |
| 3.4 Western blotting 检测目的蛋白在转基因细胞中的分泌 |
| 3.5 重组人溶菌酶生物学活性检测 |
| 3.6 转 hLYZ 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立与胚胎移植 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五节 利用乳腺特异性表达猪防御素生产转基因猪克隆胚胎的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与表达验证 |
| 2.2 PBD-1 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立 |
| 2.3 转 PBD-1 基因克隆胚的构建 |
| 2.4 转 PBD-1 基因克隆胚的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与表达鉴定 |
| 3.2 猪胎儿成纤维细胞转染 pBD-1 基因稳定细胞系的建立与鉴定 |
| 3.3 转 pBD-1 基因克隆胚的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于重组蛋白的检测和纯化 |
| 4.2 关于乳腺特异性表达载体的构建 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、抑制素基因重组质粒转染大肠杆菌菌种冷藏与冷冻保存的效果分析（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR/Cas12a高效克隆高GC大片段DNA技术的研究[D]. 刘乐诗. 华东理工大学, 2020(01)
- [2]生长抑素DNA疫苗C500（pVGS/2SS-asd）对于育肥猪的生产性试验研究[D]. 周子超. 华中农业大学, 2019
- [3]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [4]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [5]Sirt3转染BMSC优化的β-磷酸三钙仿生骨支架的构建及成骨能力研究[D]. 利时雨. 南方医科大学, 2018(01)
- [6]关岭牛MSTN基因启动子相关转录因子的筛选、克隆及表达纯化[D]. 夏丹. 贵州大学, 2016(03)
- [7]淇河鲫MSTN基因相关microRNA的筛选与功能研究[D]. 胡灿灿. 河南师范大学, 2016(05)
- [8]关岭牛MyoD1基因启动子上转录因子结合位点的筛选及其功能研究[D]. 张雯. 贵州大学, 2015(01)
- [9]生长抑素基因疫苗工程菌保存方法与免疫泌乳后期奶牛的研究[D]. 赵利亮. 华中农业大学, 2013(02)
- [10]利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究[D]. 陈建文. 安徽农业大学, 2012(07)