一、几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析（论文文献综述）
杜吉腾[1]（2020）在《中国新城疫病毒的系统发育地理学分析及鸡场感染风险评估体系的研究》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引发的以感染禽类为主的烈性传染病。近年来新城疫的流行虽然有所减缓,但其宿主范围却在持续扩大,新的基因型也在产生。因此开展NDV的系统发育地理学研究和构建鸡场NDV感染风险评估模型对ND的防控具有重要的意义。本研究主要包含以下2个部分:1.中国地区NDV的遗传多样性及主要流行基因型的系统发育地理学研究本研究调查了NDV近年来在我国的流行情况,并从Gen Bank收集了中国地区1986-2015年间的NDV融合基因（F）和血凝素神经氨酸酶（HN）基因序列。通过贝叶斯系统发育地理学的方法（Bayesian phylogeography）对我国流行基因型（Ⅵ、Ⅶ基因型毒株的F基因的和Ⅶ型毒株的HN基因）的遗传多样性、区域间传播路径及家禽与野鸟间的潜在传播风险等进行了推断。结果表明近年来NDV的疫情发生整体呈下降趋势,其遗传多样性也不再增加。所研究的基因包括Ⅵ型、Ⅶ型毒株的F基因和Ⅶ型毒株的HN基因均呈现较慢的平均进化速率,分别为8.07×10-4(5.06×10-4～1.09×10-3)位点/年、1.03×10-3(8.54×10-4～1.19×10-3)位点/年和8.78×10-4(7.11×10-4～1.05×10-3)位点/年。系统发育地理学的溯源分析表明各基因型的起源地可能有所不同,基因Ⅵ型最早可能起源于江西省,Ⅶ型为广西省。我国东部和南部是NDV传播扩散的地理活跃区,其中山东省和江苏省最可能是我国的传播中心,未来应该对这些区域进行重点监测和布控。此外,野鸟中ND的散发病例可能主要是由家禽溢出的,野鸟的迁徙对家禽中NDV的传播似乎只起到微弱的作用。2.规模化鸡场NDV感染风险评估模型研究本研究运用德尔菲法和层次分析法（AHP）建立了规模鸡场NDV感染风险评估模型,该风险评估模型共包含43项风险因子,其中“鸡场NDV强毒分离阳性”、“本场未接种新城疫疫苗”和“鸡场上风向1000m以内当前有新城疫流行”3项为特别优先项。模型建立后通过实地走访和问卷调查的形式对西南地区规模鸡场进行评估。结果显示调查的51个规模化鸡场均为低风险和中度风险,未出现高风险的情况。其中大型鸡场风险评估等级全部为低风险。中型鸡场低风险和中风险占比分别约为85%和15%。小型规模化养殖场中低风险占比仅为6%,而中度风险占比94%,且小型规模化鸡场在场区布局、饲养管理、无害化处理与消毒、免疫抗体水平的监测及疫病净化等方面仍存在漏洞。评估结果表明当前我国西南地区的规模化鸡场对于NDV的防控重视程度较高,未来暴发新城疫的风险较低。本研究通过对中国地区NDV主要流行基因型的F和HN基因开展系统发育地理学研究,了解其流行趋势及主要基因型的起源和传播,为ND的防制和重点监测提供了依据;同时,构建的NDV感染风险评估模型可为鸡场新城疫的防控工作提供理论依据和科学指导。
钦琪[2]（2020）在《表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）和鹅细小病毒病（Golsing plague,GP）是分别由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）及鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）引起的严重危害我国养鹅业的两种疾病,均具有高死亡率。疫苗是防控ND和GP的有效手段,但随着病毒不断进化、流行趋势的改变及我国防控力度的加强,常用的传统ND及GP弱毒疫苗株已不能满足防疫需求。NDV只有一个血清型,但基因型众多,当前NDV流行主要以基因VII型毒株为主,但如今商品化ND疫苗株多为基因II型、III型,与基因VII型毒株同源性较低,遗传距离较远,当基因VII型NDV强毒攻击家禽时,传统疫苗并不能提供彻底的保护,且能够从免疫家禽体内分离出NDV强毒株,这不利于ND的防控及净化,因此,使用与流行毒株基因型匹配的疫苗是防控ND的必然趋势。GPV具有严格种属特异性,弱毒疫苗生产上只能使用鹅胚或番鸭胚,这导致疫苗在生产中有诸多不便且成本较高,且弱毒苗在使用中存在潜伏感染的危险,因此,GP新型疫苗的研发是势在必得。为了弥补传统疫苗的缺陷,也为了能够同时防控ND和GP,本实验室前期以鹅源基因VII型NDV NA-1株为研究对象,构建了NDV反向遗传操作平台,同时用此平台将NDV强毒株NA-1株F蛋白裂解位点氨基酸序列致弱突变为弱毒株LaSota F蛋白对应序列,构建了重组NDV rmNA-1,在此基础上,插入GPV主要保护性抗原VP3蛋白基因组,构建了表达GPV VP3基因的重组NDV rmNA-VP3。本研究对重组NDV rmNA-VP3的稳定性,安全性及临床免疫效果进行评价,以判断其是否具有作为新一代防控ND和GP疫苗候选株的潜力。一、重组NDV rmNA-VP3遗传稳定性检测为检测重组NDV rmNA-VP3遗传稳定性,将rmNA-VP3分别在鸡胚及鸡体内进行连续传代。将rmNA-VP3在SPF鸡胚内连续传代至第25代,经氨基酸序列分析后,rmNA-VP3 F蛋白裂解位点氨基酸序列未发生返强突变;将rmNA-VP3在鸡体内连续传代5次,经氨基酸序列分析,F蛋白裂解位点未发生返强突变,结果表明rmNA-VP3可在鸡胚内至少稳定遗传25代,在鸡体内可至少稳定遗传5代,表明重组NDV rmNA-VP3具有较好的稳定性。二、重组NDV rmNA-VP3实验室安全性试验安全性是考察疫苗品质的重要指标之一。本研究通过单剂量多次接种试验及单次超剂量接种试验对重组NDV rmNA-VP3进行安全性评价。将重组NDV rmNA-VP3以106EID50（0.2mL）/只的剂量,以颈部皮下注射的方式接种16日龄雏鹅,两周后以同等剂量同一接种方式再次进行接种,接种后临床观察雏鹅两周发现雏鹅表现正常,剖检组织器官无病理变化。使用常规接种剂量的10倍接种16日龄雏鹅,接种后临床观察雏鹅两周,雏鹅表现正常,剖检组织器官无病理变化。证实重组NDV rmNA-VP3安全性良好。三、重组NDV rmNA-VP3免疫效果评价为测评重组NDV rmNA-VP3临床保护效果,将重组NDV rmNA-VP3对16日龄、30日龄雏鹅两次免疫,两周后使用基因VII型NDV强毒株NA-株及GPV强毒株进行攻毒试验,同时设置ND商品疫苗LaSota组、GP商品疫苗SYG41-50组及PBS对照组,以便通过对比进一步测评rmNA-VP3临床保护效果。存活率观察显示rmNA-VP3能够对雏鹅产生100%的保护。ND抗体监测结果显示,rmNA-VP3组与LaSota疫苗组抗体水平相差无几,但攻毒后rmNA-VP3组ND抗体水平会先下降后再回升至最高,这是由于疫苗株与强毒株基因型匹配所致。GP抗体水平检测显示,rmNA-VP3组与SYG41-50组抗体水平相差无几。排毒检测发现,攻毒后,rmNA-VP3免疫组雏鹅排毒量少,终止排毒时间早于ND及GP商品疫苗组。检测除雏鹅体内病毒分布发现rmNA-VP3免疫组雏鹅体内病毒分布较少,体内病毒清除速度更快。这表明,当NDV疫苗株与流行毒株基因型匹配时,疫苗保护效果更为理想,同时VP3基因在雏鹅体内表达良好,能够诱导雏鹅机体免疫反应,帮助雏鹅抵御GPV强毒的攻击。
吴倩倩[3]（2020）在《滑液囊支原体分子流行病学调查分析及新型等温检测方法的建立》文中指出滑液囊支原体病是由滑液囊支原体感染鸡群引起的,被感染的鸡群会出现关节肿胀,足垫肿大,跛足;蛋鸡被感染后会出现蛋壳异型,蛋壳易碎,产蛋量下降等症状。自从滑液囊支原体在世界范围内流行,随着感染地区的不断扩大,感染数量的急速上升,对世界家禽养殖业造成了严重的经济损失。为了了解河南南阳及周边地区滑液囊支原体的流行现状,本研究对2018年南阳各县市的鸡群进行了滑液囊支原体分子流行病学调查。结果显示,通过PCR技术对2018送检的104批次的样品进行滑液囊支原体检测,共检测出阳性样品47份,总阳性率为45.19%。第1季度第4季度这四个季度的阳性总数所占比率分别为29.4%、44%、69%和47%,第二季度和第四季度差别不大,第四季度阳性比率相对较高,第一季度的最低。在4月、7月、12月份的发病率有所升高,即发病率升高与每个季节转化期间相关,可能是由于温度变化易引起呼吸道疾病,使鸡体抵抗力降低更易诱发MS的感染。2月份和3月份的阳性率较低,2月份的样品可能与天气寒冷有关;3月份样品并不高于其他月份,可能是因为饲养环境的提升,预防措施到位。除此之外的其他月份里,可看出阳性率相对偏高,而这一现象可能与天气渐暖,肉鸡养殖户增多,规模逐渐扩大没有做好预防措施有关。基于MS vlhA基因的5’末端保守区域,对分离得到的33株滑液囊支原体的该基因区域进行系统进化树的构建,除了MS180423和MS181210两个分离得到的菌株与数据库下载的国外参考序列B11-85亲缘关系较近,同属于B型;其他序列都与国内参考菌株在相同的进化分支上属于K型。为了更好地对滑液囊支原体进行临床诊断和监控,本研究建立了一种快速、特异、灵敏的滑液囊支原体检测方法。根据MS vlhA基因的保守区设计并筛选出一对引物。最终确定采用该引物对的PSR在水浴中反应的最佳温度和时间分别为62℃和40 min,利用琼脂糖凝胶电泳和染料指示剂显色对PSR结果进行评价。PSR法检测MS的灵敏度是基于琼脂糖凝胶电泳结果和肉眼检测颜色变化的聚合酶链反应法的100倍。进一步的实验表明,该引物特异性地检测到了MS,并没有与其他常见的禽类病原体发生交叉反应。临床样品检测证实,MS─PSR法简便、快速、特异、灵敏,非常适合在基层单位的现场和实验室中推广应用。
张一帆[4]（2019）在《基因VIk亚型PPMV-1分离鉴定及致病性分析》文中研究说明鸽新城疫（Newcastle disease,ND）是近年来可引起鸽严重发病死亡的病毒性传染病,是危害养鸽业的重要传染病之一,其病原为鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigen Paramyxovirus typeⅠ,PPMV-1）,属于基因Ⅵ型新城疫病毒,又称鸽新城疫病毒。PPMV-1的进化速率较快,目前该毒株的传播并未持续扩大,而是维持一定种群内部的不断演变。因此对广东省鸽场的鸽新城疫病毒的传播进行监测,了解当前PPMV-1的传播情况与毒力强弱十分必要。并且,目前市场上新城疫疫苗均为La Sota疫苗和基因Ⅶ型疫苗,无基因Ⅵ的专属疫苗。因此,这些疫苗对防疫鸽PPMV-1的作用效果有待研究。本课题组于2016年12月至2017年6月对广东省鸽场进行流行病学监测,期间使用血凝抑制试验（HI）对350份鸽场送检血清进行抗原检测,发现广东省大多数鸽场的鸽体内新城疫抗体水平均较低。有意义的是,由于鸽场免疫时主要使用La Sota疫苗或基因VII型疫苗,并无针对NDV基因VI型的特异性疫苗,所以在进行HI检测时发现,使用不同基因型的病毒作抗原时,测得的抗体水平有很大差异,用基因VI型毒株作为抗原时,测得的抗体水平偏低,这也再次证明了鸽场使用的疫苗对感染基因VI型毒株的鸽保护程度会偏低。流行病学调查期间本课题组在增城某鸽场送检的病死鸽体内分出两株鸽新城疫（PPMV-1）强毒株,命名为PPMV-1/Guangdong/B5/2017和PPMV-1/Guangdong/SZ/2018,而后进行3次蚀斑纯化,对纯化后的毒株进行全基因序列和种群动态分析。F基因的遗传进化树分析表明,该毒株属于NDV的class II的基因VI型。本实验研究主要针对B5毒株,为了解B5毒株的生物学特性,对该毒株B5进行鸽致病性试验研究,用它感染3组不同日龄的鸽,分别为3周龄、6周龄和12周龄。感染剂量为106 EID50,在感染第3 d和第7 d时,每组剖杀3只,检测病毒在鸽体内的复制情况。感染第3 d时肾脏、脾脏、肺脏含毒量最高,感染第7 d时脑、肾脏、脾脏和腺胃的含毒量有上升,说明病毒已突破血脑屏障,此时神经症状也更为明显,感染鸽有明显的腿部无力,倒地不起伴随脚部向上抽搐震颤、扭头等症状。3周龄鸽感染组最先发病死亡率100%,同居对照组死亡率也为100%;6周龄鸽感染组死亡率100%,同居对照组死亡率为66%;12周龄鸽较慢产生临床症状及死亡现象,感染组死亡率为83.3%,同居对照组死亡率为0%。结果表明,B5毒株为一株导致鸽高致病率和高死亡率的强毒株。为了检测当前新城疫疫苗对B5的保护性,设计了3种疫苗对感染PPMV-1鸽的保护性试验。采用3周龄鸽分别免疫La Sota弱毒苗、La Sota灭活苗和基因Ⅶ型灭活苗,免疫后第21 d采血,测所有鸽对PPMV-1的抗体水平。HI结果显示,所有免疫组鸽的抗体水平均为阳性,但平均抗体水平并不高,免疫第22 d时,感染试验组,感染量为106 EID50。对照组鸽在感染12 d全部死亡,NDV基因Ⅶ型苗免疫组的死亡率达到60%,La Sota弱毒苗免疫组的死亡率达到30%,La Sota灭活苗保护率较好,但也未达到完全保护,死亡率为10%。在感染期间,发病鸽呈现倒地不起,翅膀下垂,脚部蜷缩震颤,双腿无力等明显发病症状,与PPMV-1对鸽的致病性试验结果一致。结果表明3种疫苗对B5均不能完全保护。并且为了评价PPMV-1的免疫原性和生物学特性是否发生变异或相互之间的关联性,对PPMV-1的抗原性变异系数进行了差易分析,不同毒株间抗原分型和抗原差异性大小评价的依据称为R值,PPMV-1与La Sota之间的R值为0.597,PPMV-1与m GM之间的R值为0.672,结果表明PPMV-1与La Sota和m GM为不同亚型。综上所述,广东省某鸽场分离B5毒株可导致不同日龄鸽发病死亡,为一株强毒株,虽然其发病程度随年龄变化可减轻,但12周龄鸽也可产生大量死亡,并且大多数鸽场饲养的鸽基本为3周龄左右,6周龄以上的较少,因此可得出广东省鸽场已面临强毒株PPMV-1的威胁。但目前新城疫疫苗却不能对鸽产生较好的保护性,3种疫苗的保护效果均不能达到100%,其中NDV基因Ⅶ型苗保护效果最差,其次为La Sota弱毒苗,La Sota灭活苗保护效果较其他两组好一些。因此,针对新城疫基因Ⅵ型的疫苗的研发必不可少,只有基因Ⅵ疫苗的尽快上市,才能减少PPMV-1对公共卫生安全和对鸽场的巨大威胁。
李佩瑶[5]（2019）在《赛鸽新城疫病毒的分离鉴定及HB株灭活疫苗研究与应用》文中研究说明鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副粘病毒引起的高接触性传染病,由于赛鸽“集鸽”模式及训放等原因导致该病在鸽群中的流行。目前免疫预防主要采用鸡新城疫疫苗,由于基因型的差异,导致保护率偏低。鉴于上述原因,本研究从赛鸽中分离典型致病性毒株,开展灭活疫苗的相关研究,拟为赛鸽新城疫的防控提供借鉴。本研究从河北、内蒙以及天津等赛鸽公棚送检病料进行新城疫病毒分离、鉴定及致病性试验。选择典型致病性分离毒株进行毒力测定及相关疫苗研究与应用。结果显示:本研究共分离到5株新城疫病毒;其中河北分离毒株在人工感染致病性试验中表现典型新城疫临床症状及剖检变化,死亡率为100%;其MDT为52.8 h,ICPI为1.78,IVPI为2.59,命名为HB株。经基因序列测定及推导氨基酸序列显示该毒株F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,符合新城疫强毒株特点,其基因型为Ⅵ型。本试验测得该疫苗使用的病毒最佳灭活条件为:0.1%甲醛、灭活温度为37℃、灭活时间16h;理想佐剂为法国进口水佐剂。经过安全性、最佳免疫剂量、抗体产生时间、免疫持续期、保存期试验等表明颈部皮下接种0.3ml/只,第7天开始产生抗体,2周后平均抗体效价达到26,4周时达到峰值29,在免疫后90d进行强毒攻击的保护率为100%。临床应用显示该疫苗对鸽新城疫具有较好的防控效果。
王茹[6]（2019）在《禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析》文中提出禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）是引起禽类常见传染病鸡病毒性关节炎的主要病原。近年来该病在我国呈上升趋势发展,毒株变异性大,传统疫苗株对其保护效果不理想,影响了我国养禽业的发展。本试验对2017年下半年至2018年上半年期间自山东、河南、河北、辽宁等地家禽养殖场采集的疑似呼肠孤感染鸡的组织病料进行病原分离,经RT-PCR、FA、EM等方法对所分离到的ARV毒株进行生物学特性研究,探究了 ARV分离株的血凝性及其致病性,通过动物回归试验,比较各分离毒株毒力强弱和攻毒后排毒期,通过免疫保护试验验证传统疫苗株对新分离毒株保护效果,试验验证各分离株的理化特性。综合试验结果从分离株中筛选疫苗株,经CEF细胞增殖病毒液,制备油乳灭活疫苗。将筛选的疫苗株与传统疫苗株对比,采用SPF鸡进行免疫攻毒保护试验,从免疫后抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行了分析评价。1 ARV的分离鉴定及生物学特性研究从组织病料中成功分离出6株ARV,试验结果显示,各毒株均无血凝性,EM观察病毒粒子大小约为70～80 nm左右;分离毒株与ARV单抗反应均呈现强阳性信号;各分离毒株在LMH、CEF细胞上均可增殖,但LMH细胞对其更为敏感;动物回归试验中,各分离株攻毒后均可引起受试鸡出现发病症状,但呈现出的毒力强弱不同;通过采集泄殖腔拭子检测部分分离株攻毒后排毒情况,结果显示,在攻毒24h后即可从粪便中检测到感染性病毒粒子,攻毒后首周是病毒粒子脱落的高峰期,第2周粪便排毒量明显减少,部分毒株粪便排毒期可持续2周以上:理化检测结果显示,各毒株对氯仿不敏感,对胰酶轻度敏感,耐热性较好,50℃处理1h对各毒株病毒滴度无显着影响,各项理化特征符合ARV特性;免疫保护试验结果显示,传统疫苗对6株ARV分离株均无法产生完全保护。同时,相较于其它毒株,分离毒株RPVA1306和RPVA1307免疫组与对照组发病情况差异较小且发病情况更为严重更具研究和应用价值。该结果验证了分离株的致病性,丰富了 ARV毒种库,证实了传统疫苗对新分离毒株无法起到理想的保护作用,为ARV新疫苗的研发提供了理论依据。2 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析目前,国内外市场上已有多种ARV疫苗应用于ARV的预防,但临床上病毒性关节炎的发生率仍居高不下。本试验通过测定ARV各分离毒株的TCID50和ELD50,结合动物回归及免疫保护试验结果,筛选出2株毒力较强毒株RPVA1306和RPVA1307,经细胞增殖,制备油乳灭活疫苗。与传统疫苗株对比,采用自制疫苗进行免疫攻毒保护试验,免疫后从抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行分析评价。试验结果表明,2株分离株对原毒株保护效果最佳,其中RPVA1306对2种分离株保护率均能达到80%以上,免疫效果较为理想。
贺奋义[7]（2012）在《鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究》文中认为鸽I型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus1，PPMV-Ⅰ）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus1， PMV-Ⅰ）引起的一种急性、热性、高度性传染病。PPMV-Ⅰ引起鸽群突然发病，迅速蔓延，临床症状上与鸡新城疫嗜神经速发株引起的十分类似，主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型为多见，发病率和死亡率都很高。鸽新城疫病其传播迅速、发病率高，发病后死亡率较高，死亡率可达50-80%以上，严重的可高达95%以上，处于孵化期的种胚感染后可全部死亡。给养鸽业造成的影响和危害巨大，是养鸽业重点防控的传染病之一。鸽新城疫病毒编码两种囊膜糖蛋白，融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN），F蛋白位于囊膜外表面，形成纤突，对鸽新城疫的毒力及感染性起决定性作用，是鸽新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因还具有较高的遗传稳定性，是新城疫基因分型的主要依据，也是决定鸽新城疫致病力强弱的关键因素；F基因的遗传变异与鸽新城疫的变异和流行密切相关，是鸽新城疫分子流行病学研究的首选基因，因此，F基因是研究鸽新城疫核酸疫苗的首选目的基因。本文通过鸽新城疫种毒PL株在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究和病毒的灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了鸽新城制苗用病毒最佳制备方法和最佳灭活条件，在此基础上，研制出鸽新城疫油乳剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗，经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验、最佳免疫剂量测定，效力试验以及田间应用试验表明，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活疫苗不仅均匀度好，粘度低，通针性良好，注射后易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，而且免疫效果好，对鸽群免疫后能起到坚强的保护作用。此外，本文还用RT-PCR方法，从鸽新城疫病毒PL株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因（F基因），并在大肠杆菌中进行了高效表达，以纯化的F表达产物为抗原，建立了鸽新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法；同时，把鸽新城疫F基因插入酵母表达载体pPic9k和真核表达载体PC-DNA3.1/V5-His中，构建了鸽新城疫F基因毕赤酵母表达系统和F基因真核表达体系，为鸽新城疫F基因生物活性的进一步研究及新型核酸疫苗的研制奠定基础。本项目研究的主要内容包括：1、鸽新城疫种毒增殖规律和灭活方法的研究：采用鸽新城疫PL株为种毒，在鸡胚上连续盲传5代，使其扩大增殖，收获尿囊液做为基础种子毒。通过种子毒在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究表明，病毒在羊水、尿囊膜（包含羊膜）、尿囊液中含量较高、增殖动态趋于一致，而在胚体及卵黄中含量较低，接种病毒后72h为最佳收毒时间。经病毒的最佳灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了0.05%甲醛在20℃条件下经过48h；70℃的温度条件下经过20min灭活病毒为最佳灭活方法，不仅能有效的完全灭活病毒，而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上。2、鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶灭活疫苗的制备：用70℃，20min的灭活方法分别制备尿囊液蜂胶佐剂灭活苗和四元材料（鸡胚尿囊液、羊水、尿囊膜、羊膜）混合蜂胶佐剂灭活苗，用0.05%甲醛在20℃条件下经48h的灭活方法分别制备鸽新城疫尿囊液蜂胶佐剂灭活苗、尿囊液油乳剂灭活苗和四元材料（尿囊液、尿囊膜、羊膜、羊水）混合油乳剂灭活苗。制备的六种疫苗经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验综合分析表明，均具有良好的抗原性和安全性。3.鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗的性能比较试验：用制备的六种鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗分别免疫注射乳鸽，结果表明四种蜂胶佐剂灭活苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，二种油乳剂苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，从而证明四元材料的疫苗与尿囊液毒疫苗的性能基本一致；但四元材料蜂胶佐剂灭活苗和油乳剂灭活苗在抗体产生时间及其达到峰值的时间和数值上有差异，蜂胶苗明显优于油苗。蜂胶佐剂灭活苗在免疫后5d抗体开始上升（平均为2.8log2～2.9log2），14d抗体可达到高峰（平均为11.2log2～11.4log2），而油乳剂灭活苗在免疫后9d抗体效价开始上升（平均为3.0log2～3.1log2），21d才达到峰值（平均为9.0log2～9.2log2）。蜂胶佐剂灭活苗180d仍可维持较高水平（平均为6.6log2～6.7log2）；在免疫后30d、90d、180d用200ELD50强毒株攻击，其保护指数均为100%；对1日龄乳鸽接种1个使用剂量进行急性毒性试验观察，15d生长曲线表明，不影响鸽的生长，甚至有提高的趋势；室温保存3个月，4℃-8℃保存6个月，疫苗的物理性状和免疫保护性没有明显变化。4、鸽新城疫F基因的克隆及序列分析：通过设计一对引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆方法，从鸽新城疫病毒PL株中扩增出F基因，将扩增产物克隆进pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性菌落并进行序列测定。结果表明：F基因为1662bp，编码553个氨基酸，与国内外报道的其他NDV毒株的F基因氨基酸数量相同；通过BLAST法与GenBank中国内外17个鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较及对照系统进化树的结果分析，表明我们的分离株（PL株）与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%；对分离的鸽新城疫F融合蛋白的氨基酸序列与国内外8株新城疫氨基酸序列进行对比分析，结果氨基酸同源性为93.6%-96.7%；F0蛋白裂解位点的氨基酸组成为112R-R-R-K-R-F117，符合强毒株的序列。5、鸽新城疫F基因的原核表达及其生物活性研究：用PCR方法获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因片段，将其亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导和SDS-APGE分析，表明目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物分子量约为60Kda；以表达的融合蛋白为抗原初步建立了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60min，与酶标二抗的最佳作用时间为60min，底物显色的最佳作用时间为15min。6、鸽新城疫F基因在毕赤酵母中表达：根据鸽新城疫F基因序列，设计引物，将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K，用SalI内切酶线性化后电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞，用影印法在含G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，用甲醇诱导表达并进行SDS-APGE分析。7、鸽新城疫F基因的真核表达及其生物活性研究：将鸽新城疫PL株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1V5-Hi中，构建出真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F；将构建的真核表达重组质粒免疫接种非免疫新城疫的乳鸽，并在免疫后第28d进行攻毒保护试验。结果表明，在免疫后第7d产生抗体，14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降；攻毒保护试验结果显示，对鸽新城疫强毒攻击保护率为33.33%（5/15），具有一定的免疫保护作用。
王伟伟[8]（2009）在《江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle Disease, ND）是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属中的新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起的多种禽类发生感染和死亡的一种急性、接触性传染病。目前NDV已经在世界范围内引起了四次大的流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。本文对分离自江苏地区的20株NDV进行了囊膜糖蛋白基因（F、HN）的序列测定和遗传进化分析,根据分析结果选取部分毒株进行了生物学特性的研究。同时,为丰富基因Ⅵ型NDV的分子生物学信息,进而为深入了解基因Ⅵ型病毒的致病特性提供依据,本研究对分离到的四株鸽源基因Ⅵ型病毒进行了全基因组序列的测定及分析,并根据这些结果对鸽源基因Ⅵ型病毒的宿主特异性及毒力差异性的可能原因进行了初步探讨。1.新城疫病毒的分离鉴定及分子流行病学2007-2008年自我国江苏部分地区的发病禽群中共分离鉴定到1株鹅源、4株鸽源、1株鸵鸟源和14株鸡源NDV。应用RT-PCR技术获得了20株NDV的F基因序列,遗传进化分析表明,20株NDV中有2株基因?型、6株基因Ⅱ型、4株为基因Ⅵ型,7株基因Ⅶ型,还有一株属于class?毒株。序列相似性分析显示,两株基因?型病毒与疫苗株V4/Queensland/66的相似性最高,6株基因Ⅱ型毒株与疫苗株LaSota的相似性最高,推测为疫苗毒;7株基因Ⅶ型病毒与F48E8的相似性在90%以下,而与Ⅶd亚型病毒的相似性较高,为Ⅶd亚型;一株class?毒株与中国近年分离的毒株相似性高,而与DER49/99的相似性较低。由此看出,目前Ⅶd亚型在我国禽群中仍然十分流行,并且禽群中疫苗株带毒情况比较明显,NDV在我国的流行已呈现出多种基因型并存的状况。对HN基因整个编码区进行扩增,经克隆、测序最终获得了20株NDV的HN基因编码区序列。对其编码多肽长度进行统计分析发现,基因?型病毒编码多肽长度为585或616个,6个基因Ⅱ型病毒均为577个,4个基因Ⅵ型病毒和7个基因Ⅶ型病毒均为571个。根据HN基因编码区绘制的遗传发生树与根据F基因绘制的遗传发生树高度一致,进一步证实了NDV的演化是在基因水平上整体进行的。对基因Ⅵ型、Ⅶ型病毒进行的MDT、ICPI、IVPI的测定结果显示,基因Ⅶ型病毒的毒力与根据F基因裂解位点序列及HN基因编码多肽长度确定的毒力结果一致,而对于基因Ⅵ型病毒,两者之间存在偏差。分离株与针对NDV囊膜糖蛋白（F、HN）的单克隆抗体排谱实验结果显示:与HN蛋白单抗（6B1）不发生反应的毒株有增多的趋势。2.四株鸽源新城疫病毒全基因组序列的测定及序列分析通过RT-PCR技术对四株鸽源NDV的全基因组序列进行了扩增,经克隆、测序获得了四株病毒的全基因组序列。序列分析显示,四株病毒全长均为15192个核苷酸（nucleotide,nt）,其中6碱基插入的位置与基因Ⅶ型病毒相同。根据F基因高变区绘制的遗传发生树显示,这4株病毒与1987-2002年间欧洲及日本的分离株同属于Ⅵb亚型中的EU/re（recent European,EU/re）分支,显示了这些地区在流行病学方面的相关性。根据全基因序列、F基因和HN基因分别绘制的3种遗传发生树高度一致,表明NDV的遗传演化是在全基因组水平上进行的。基因Ⅵ型与其它基因型病毒之间各蛋白氨基酸序列相似性分析显示:NDV 6个基因中P基因的变异最大,而L基因相对保守;基因Ⅵ型病毒与基因Ⅱ型病毒的相似性较低;而与基因Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ型病毒的相似性较高,这反映了基因Ⅵ型病毒与基因Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ型病毒之间在遗传进化上存在一定的相关性。对鸽源病毒与鸡源病毒各个基因编码区氨基酸序列进行比较分析发现,鸽源毒株在NP、P、L上均出现了几个特征性的氨基酸位点,分别是NP蛋白的463（N→D）、469（P→I）及477（P→H）位;P蛋白的10（D→E）、93（T-K/R）及163（R→G）位;HN蛋白的122（G→R）位;L蛋白的1110（L→T/A）及1757（A→V）位。在M、F蛋白上没有发现特异的氨基酸位点,在HN蛋白上只发现了一个（G122R）。鸽源毒株特异性氨基酸的出现可能改变了病毒相关蛋白的结构及其生物学特性,进而对其毒力和宿主特异性产生影响,相关的验证研究工作正在进行之中。
马帝,谢建云,邵伟娟,吴祖立,高诚[9]（2002）在《几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析》文中研究说明以 La Sota毒株和分离到的 4株分别来源于信鸽、肉鸽和鸡的新城疫毒株为研究对象 ,设计了 3对引物用反转录 -聚合酶链反应 （RT-PCR）对它们的融合蛋白基因 （F）进行分段扩增 ,并且采用 SDS-PAGE进行结构蛋白分析。两者的综合结果显示毒株之间存在着差异关系 ,具有显着的多态性 :来源于肉鸽的毒株与 La Sota株最为接近 ,而来源于鸡的强毒株与La Sota株差异最显着 ;来源不同的 2株信鸽之间有程度较轻的差异 ,肉鸽和信鸽的毒株之间差异较为明显 ,鸽新城疫和鸡新城疫之间的差异关系较为复杂。表明新城疫病毒存在高度变异性。
姜永厚[10]（2000）在《新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究》文中指出本文在成功构建鸡新城疫F基因疫苗，并观察了免疫SPF雏鸡后诱导的免疫应答及免疫保护作用基础上，首次系统研究了鸡IL-2在鸡新城疫F基因疫苗免疫中的作用，证实了国内首次克隆成功的鸡IL-2基因的免疫增强作用，及作为免疫佐剂应用于禽类基因免疫的可行性；在此基础上，为进一步提高F基因疫苗免疫效率，又成功地构建了鸡新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗，研究了其接种SPF雏鸡后免疫鸡只T、B淋巴细胞增殖反应和抗体变化规律，以及强毒攻击后的免疫保护作用。研究结果如下：1．新城疫病毒F基因疫苗研究 用新城疫病毒D26株F基因的cDNA与含人巨细胞病毒CMV启动子的真核表达载体pcDNA3重组，构建了新城疫F基因疫苗（pcDNA-F）。直接免疫接种SPF鸡后免疫鸡产生了针对新城疫病毒的抗体，免疫接种后前2周，免疫鸡的抗体产生并不明显，第3周后出现稍为明显的抗体反应。攻毒后，免疫鸡的抗体回忆反应十分迅速和强烈，出现一个较陡而又较高的峰值。而非免疫鸡在攻毒后，抗体反应相当弱。免疫组有部分试验鸡（30％）耐过强毒攻击。说明重组质粒的F基因已在体内得到表达，并诱导了机体的免疫应答反应和免疫保护作用。证明以F基因做为新城疫基因免疫的免疫原基因是可行的。2．鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用研究 用含鸡IL-2基因真核质粒与新城疫F基因疫苗联合免疫SPF雏鸡。抗体监测结果显示添加鸡IL-2质粒试验鸡的抗体滴度高于单独接种F基因疫苗试验鸡的抗体滴度；其中两种质粒混合接种组（pcDNA-F+IL2）抗体滴度又明显高于这两种质粒的分别接种组（pcDNA-F/IL-2）抗体滴度。 MTT法检测免疫鸡T、B淋巴细胞增殖反应：免疫后不同周龄，各免疫组试验鸡胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA均有明显的反应性。接种鸡IL-2质粒试验鸡胸腺T淋巴细胞对ConA的反应性、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应性又显着高于单独接种F基因疫苗组，差异极显着（P＜0.01）。说明接种鸡IL-2表达质粒后，F基因疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答均得到了加强。在添加IL-2质粒的两组中，混和接种IL-2质粒组的T、B淋巴细胞增殖反应又明显高于分别接种组，差异极显着（P＜0.01）。表明鸡IL-2质粒免疫增强作用的发挥有赖于同抗原基因的共同接种。 攻毒保护试验显示：混合接种组（pcDNA-F+IL2）中有50％的试验鸡耐过；分别接种组（pcDNA-F/IL-2）有40％试验鸡耐过。 添加IL-2质粒组试验鸡体液免疫、细胞免疫的增强及免疫保护率（50％）的提高，说明IL-2真核质粒在鸡体内得到表达，并且具有免疫增强作用。一方面刺激T淋巴细 东北农业大学 中文摘要 博士学位论文 胞的增殖、分化，增强细胞免疫应答；另一方面作用B细胞，促进其活化分泌Ig，加 速抗体生成，进而加强体液免疫。 3．新城疫病毒F基因与鸡thZ重组DNA疫苗的研究 利用国内首次克隆得到的鸡IL2与新城疫弱毒D26株的F基因，经载体改建，将 二者以非融合表达形式共同克隆于真核表达质粒pCDNA3上，经酶切分析、PCR鉴定 证实成功构建了共表达鸡 IL－2与新城疫 F蛋白的重组质粒（pCDNA－F－ILZ）。采用胸肌 多点注射方法接种 14日龄 SPF雏鸡，免疫后每周采集试验鸡胸腺、法氏囊、血液，无 菌分离T、B淋巴细胞和血清，以 MTT法和 ELISA分别检测免疫鸡 T。B淋巴细胞增 殖反应和抗体变化规律。结果显示：与单独接种F基因疫苗试验组相比，接种重组质 粒试验组鸡只的体液免疫和细胞免疫均明显增强；且免疫效果优于两种质粒的混合注 射。免疫后以新城疫标准强毒F。。巳攻击，接种重组质粒试验鸡有70％存活；混合接种 F基因和几－2质粒试验鸡有 5（）％存活；单独接种 F基因疫苗试验鸡只有 3（）％存活。试 验结果表明共表达IL．2可极大提高新城疫DNA疫亩的效力。 新城疫F基因与鸡IL。二重组质粒的成功构建在国内外尚未见报道，不仅首次证实 了鸡IL－2在新城疫基因免疫中的免疫增强作用，而且为鸡IL2这一新型佐剂在禽类基 因免疫中的应用提供了试验依据。同时山为探讨禽类重组基因疫苗的构建奠定了基础。 4．新城疫基因疫苗、鸡IL．2质粒免疫SPF雏鸡免疫器官的组织学变化 新城疫基因疫苗免疫后．试验鸡胸腺皮质增厚，其中淋巴细胞数目增客。法氏囊 淋巴滤泡明显增大，淋巳细胞数目增多。脾脏白髓区增大，淋巴小结数量增多，体积增 大，其中淋巴细胞数量增多。以上主要免疫器官在免疫后的组织学变化再次证实了基因 疫苗免疫可以诱导体液免疫和细胞免疫的结论。 另外，将几．2免疫鸡与空白对照鸡、F基固疫苗免疫鸡进行了形态学和组织学的 比较，接种IL．2质粒试验鸡剖检末见病理变化：整个免疫过程中，接种几－2质粒试验 鸡的
二、几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析（论文提纲范文）
（1）中国新城疫病毒的系统发育地理学分析及鸡场感染风险评估体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一部分 文献综述及选题意义 |
| 1 新城疫概述 |
| 1.1 病原学分类及病毒粒子结构 |
| 1.2 NDV的基因组结构 |
| 1.3 NDV的主要功能蛋白 |
| 1.4 NDV的分子流行病学 |
| 1.4.1 基因分型 |
| 1.4.2 NDV的流行情况 |
| 2 系统发育地理学概述 |
| 2.1 系统发育地理学 |
| 2.2 系统发育地理学的理论基础 |
| 2.3 系统发育地理学的分析方法 |
| 3.风险评估研究 |
| 3.1 风险评估定义 |
| 3.2 构建风险评估模型的方法 |
| 3.3 风险评估的应用现状 |
| 4.研究目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 中国地区新城疫病毒的遗传多样性及主要流行基因型的系统发育地理学研究 |
| 1 试验方法 |
| 1.1 软件 |
| 1.2 数据来源及处理 |
| 1.2.1 NDV疫情数据 |
| 1.2.2 序列数据收集与处理 |
| 1.3 遗传多样性分析及系统发育地理学分析 |
| 1.3.1 NDV的遗传多样性分析 |
| 1.3.2 系统发育地理学分析 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 我国NDV的流行情况 |
| 2.2 序列数据的描述性分析 |
| 2.3 NDV毒株的时间信号检测 |
| 2.4 最佳进化模型的设置 |
| 2.5 NDV的遗传多样性分析 |
| 2.5.1 单核苷酸多态性分析(SNPs) |
| 2.5.2 Bayesian skyline plots分析 |
| 2.6 NDV各基因型的系统发育地理学 |
| 2.6.1 Ⅵ型毒株F基因的系统发育地理学 |
| 2.6.2 Ⅶ型毒株F基因的系统发育地理学 |
| 2.6.3 Ⅶ型毒株HN基因的系统发育地理学 |
| 3.讨论 |
| 第二章 规模化鸡场NDV感染风险评估体系研究 |
| 1 风险评估模型的构建方法 |
| 1.1 评估模型构建的技术路线 |
| 1.2 评估设计 |
| 1.3 评价指标的选取 |
| 1.4 评价指标权重值的确定 |
| 1.5 风险等级的划分 |
| 1.5.1 客观评分 |
| 1.5.2 分级标准 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 评价指标的确定 |
| 2.2 评价指标权重值的确定 |
| 2.3 风险评估等级的划分确定 |
| 2.3.1 评分标准的确定 |
| 2.3.2 风险等级的划分标准 |
| 2.4 风险评估模型的建立 |
| 2.5 风险评估模型的应用 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 作者简历 |
（2）表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫 |
| 1.1 新城疫概况 |
| 1.2 新城疫病毒形态结构及蛋白功能 |
| 1.3 新城疫病毒毒力及基因分型 |
| 1.4 新城疫在鹅群内流行现状 |
| 1.5 新城疫防控及疫苗研究进展 |
| 第二章 鹅细小病毒病 |
| 1.1 鹅细小病毒病概况 |
| 1.2 鹅细小病毒形态结构及蛋白功能 |
| 1.3 鹅细小病毒病流行特点及诊断 |
| 1.4 鹅细小病毒疫苗研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 重组NDV rmNA-VP3 遗传稳定性检测 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组NDV rmNA-VP3 实验室安全性试验 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组NDV rmNA-VP3 免疫效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）滑液囊支原体分子流行病学调查分析及新型等温检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 滑液囊支原体的研究进展 |
| 1.1 禽滑液囊支原体的流行状况 |
| 1.2 滑液囊支原体的概述 |
| 1.2.1 病原学及分离 |
| 1.2.2 致病机制 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.3 诊断 |
| 1.3.1 血清学诊断 |
| 1.3.2 分子学诊断 |
| 1.4 防控 |
| 第二章 禽滑液囊支原体的分子流行病学调查 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验室一般试剂的配制 |
| 2.2.2 样品的统计和处理 |
| 2.2.3 引物的设计和合成 |
| 2.2.4 基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 目的基因vlhA的 PCR检测和扩增 |
| 2.2.6 目的片段的回收和纯化 |
| 2.2.7 克隆基因与pMD-19T连接 |
| 2.2.8 菌液鉴定 |
| 2.2.9 序列测定及分析 |
| 2.2.10 提取质粒并保存 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床症状 |
| 2.3.2 收集样品的MS检测结果 |
| 2.3.3 菌液PCR检测 |
| 2.3.4 流行病学调查 |
| 2.3.5 系统进化树的构建和遗传进化分析 |
| 2.3.6 同源性分析 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 第三章 禽滑液囊支原体的聚合酶螺旋反应检测方法的建立与应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 病毒基因组的提取 |
| 3.2.3 构建MS vlhA基因的载体质粒 |
| 3.2.4 恒温扩增体系 |
| 3.2.5 引物的筛选 |
| 3.2.6 最佳反应温度的优化 |
| 3.2.7 最佳反应时间的优化 |
| 3.2.8 特异性实验 |
| 3.2.9 灵敏性实验 |
| 3.2.10 扩增产物的酶切鉴定 |
| 3.2.11 临床样品检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MS-vlhA基因的PSR反应体系的确定 |
| 3.3.2 引物的确定 |
| 3.3.3 最佳反应温度 |
| 3.3.4 最佳反应时间 |
| 3.3.5特异性实验 |
| 3.3.6灵敏性实验 |
| 3.3.7 PSR产物的酶切结果 |
| 3.3.8 临床样品检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）基因VIk亚型PPMV-1分离鉴定及致病性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 新城疫概述 |
| 1.2 新城疫病原学特点 |
| 1.3 新城疫基因VI型 Pigeon paramyxovirus typeⅠ |
| 1.3.1 PPMV-1的流行状况与遗传变异 |
| 1.3.2 PPMV-1的生物学特性 |
| 1.3.3 PPMV-1的培养特性 |
| 1.3.4 PPMV-1的敏感性 |
| 1.3.5 PPMV-1的实验室诊断 |
| 1.3.6 PPMV-1的公共卫生学意义 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 病料和毒株来源 |
| 2.2 实验用SPF胚、实验动物 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 分子生物学试剂和细胞 |
| 2.5 主要分子生物学软件 |
| 3 方法 |
| 3.1 对各鸽场送检血清进行HI检测 |
| 3.2 PPMV-1病毒的分离 |
| 3.3 PPMV-1的F基因的分子生物学鉴定 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 PPMV-1的RNA的提取 |
| 3.3.3 PPMV-1的c DNA的合成 |
| 3.3.4 PCR鉴定及产物纯化 |
| 3.3.5 目的片段的连接转化及筛选 |
| 3.3.6 序列分析 |
| 3.4 PPMV-1的纯化 |
| 3.4.1 有限稀释法纯化病毒 |
| 3.4.2 蚀斑纯化 |
| 3.5 鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 3.6 PPMV-1全基因序列的扩增 |
| 3.6.1 引物设计 |
| 3.6.2 PPMV-1的RNA提取 |
| 3.6.3 PPMV-1的c DNA合成 |
| 3.6.4 PPMV-1 全基因的PCR扩增 |
| 3.6.5 目的片段的检测及产物纯化 |
| 3.6.6 目的片段的连接转化及筛选 |
| 3.6.7 各片段序列的测定与拼接 |
| 3.7 PPMV-1对不同日龄组鸽的致病性试验 |
| 3.7.1 PPMV-1感染不同日龄鸽的临床症状观察与记录 |
| 3.7.2 PPMV-1感染不同日龄鸽体内的复制 |
| 3.7.3 PPMV-1感染不同日龄鸽后咽和泄殖腔排毒情况 |
| 3.8 3种疫苗对感染PPMV-1的鸽的保护性试验 |
| 3.8.1 3种疫苗免疫鸽后抗体产生 |
| 3.8.2 PPMV-1感染鸽后的临床症状的观察与记录 |
| 3.8.3 PPMV-1感染鸽后咽和泄殖腔排毒情况 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 广东省鸽场送检350份血清HI检测结果 |
| 4.2 病毒的分离鉴定结果 |
| 4.3 病毒的分子生物学鉴定结果 |
| 4.4 病毒的纯化 |
| 4.5 鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 4.6 PPMV-1的进化史及全基因序列结果分析 |
| 4.7 PPMV-1对不同日龄组鸽的致病性试验 |
| 4.7.1 PPMV-1感染3组年龄鸽后存活情况 |
| 4.7.2 PPMV-1感染3组年龄鸽后口咽和泄殖腔排毒情况 |
| 4.7.3 PPMV-1感染3组不同日龄鸽后其在体内复制情况 |
| 4.7.4 感染21d时存活鸽血清抗体测定 |
| 4.8 3种疫苗对感染PPMV-1的鸽的保护性试验 |
| 4.8.1 3种疫苗免疫后鸽产生的抗体水平 |
| 4.8.2 免疫鸽感染PPMV-1的存活死亡情况 |
| 4.8.3 免疫鸽感染PPMV-1的咽和泄殖腔排毒情况 |
| 4.8.4 PPMV-1与La Sota及 m GM的抗原相关系数 |
| 5 全文讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :攻读硕士学位期间的科研成果 |
（5）赛鸽新城疫病毒的分离鉴定及HB株灭活疫苗研究与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 国内赛鸽养殖及防控情况 |
| 1.2 鸽新城疫的研究概况 |
| 1.3 鸽新城疫疫苗的概况 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离鉴定 |
| 3.2 致病性试验 |
| 3.3 HB 株毒力测定 |
| 3.4 分子特征 |
| 3.5 灭活条件的筛选 |
| 3.6 疫苗效力评价 |
| 3.7 大田试验 |
| 3.8 临床应用 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（6）禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 ARV的形态结构 |
| 1.2 ARV的理化特性 |
| 1.3 ARV的培养特性 |
| 2 分子生物学特性 |
| 2.1 ARV的基因组 |
| 2.2 编码的蛋白与功能 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 致病性 |
| 3.2 临床症状及病理变化 |
| 3.3 流行概况 |
| 4 实验室诊断 |
| 4.1 病毒分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断方法 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 5 防治 |
| 5.1 弱毒疫苗 |
| 5.2 灭活疫苗 |
| 5.3 基因工程苗 |
| 6 本课题研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 ARV的分离鉴定及生物特性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 RT-PCR鉴定 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.4 直接免疫荧光(FA)鉴定结果 |
| 2.5 形态学鉴定结果 |
| 2.6 ARV的部分生物学特性 |
| 2.7 部分理化特性研究 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒液检验 |
| 2.2 疫苗质量检验 |
| 2.3 疫苗安全性检验结果 |
| 2.4 疫苗效力检验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸽新城疫的研究概况 |
| 1.1.1 病原学特性 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状和剖检病变 |
| 1.1.4 诊断 |
| 1.1.5 防治 |
| 1.2 新城疫分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 新城疫病毒的形态和分子结构蛋白及功能 |
| 1.2.2 新城疫病毒致病力的分子基础 |
| 1.2.3 新城疫的分子流行病学研究 |
| 1.2.4 鸽新城疫基因工程疫苗研究 |
| 第二章 鸽新城疫疫苗的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 制苗用毒株 |
| 2.1.1.2 试验动物 |
| 2.1.1.3 试剂药品 |
| 2.1.1.4 仪器设备 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 种毒的制备 |
| 2.1.2.2 病毒的灭活 |
| 2.1.2.3 油乳剂灭活疫苗的制备 |
| 2.1.2.4 蜂胶苗的配制 |
| 2.1.2.5 油乳剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.6 蜂胶佐剂灭活苗物理性状检验 |
| 2.1.2.7 疫苗免疫抗体产生时间的测定 |
| 2.1.2.8 疫苗最佳免疫剂量测定 |
| 2.1.2.9 疫苗免疫持续期的测定 |
| 2.1.2.10 疫苗保存期试验 |
| 2.1.2.11 对比试验 |
| 2.1.2.12 区域试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 制苗用毒在鸡胚上增殖 |
| 2.2.2 病毒的灭活 |
| 2.2.2.1 温度对病毒灭活 |
| 2.2.2.2 甲醛对病毒灭活 |
| 2.2.2.3 安全性检查 |
| 2.2.3 油乳剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.3.1 外观检查 |
| 2.2.3.2 粘度检验 |
| 2.2.3.3 均匀度检验 |
| 2.2.3.4 剂型检验 |
| 2.2.3.5 稳定性检验 |
| 2.2.4 蜂胶佐剂灭活疫苗物理性状检验 |
| 2.2.4.1 外观检查 |
| 2.2.4.2 无菌检验 |
| 2.2.4.3 安全性检验 |
| 2.2.4.4 急性毒性试验 |
| 2.2.5 疫苗免疫效力对比试验 |
| 2.2.6 疫苗免疫持续期试验 |
| 2.2.7 疫苗保存期试验 |
| 2.2.8 鸽源和鸡源油乳剂灭活苗对比试验 |
| 2.2.9 区域试验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 鸽新城疫 F 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 病毒 |
| 3.1.1.2 菌株、载体 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 主要仪器 |
| 3.1.1.5 培养基与溶液配制 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 引物设计与合成 |
| 3.1.2.2 病毒 RNA 的提取 |
| 3.1.2.3 RT-PCR 扩增 |
| 3.1.2.4 基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 F 基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 F 基因 DNA 序列测定结果 |
| 3.2.3 核苷酸相似性分析 |
| 3.2.4 氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 裂解位点的氨基酸序列分析 |
| 3.2.6 系统发育树的建立 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 鸽新城疫 F 基因的原核表达分析及其生物活性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、载体 |
| 4.1.2 酶与试剂 |
| 4.1.3 培养基与溶液配制 |
| 4.1.4 仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸽新城疫 F 基因原核表达载体的构建 |
| 4.2.1.1 表达引物的设计 |
| 4.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 4.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 4.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 4.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 4.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 4.2.1.7 连接产物的转化 |
| 4.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 4.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.2 重组菌的诱导表达与表达条件的优化 |
| 4.2.2.1 重组菌的诱导表达 |
| 4.2.2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.2.2.3 表达条件的优化 |
| 4.2.2.4 包涵体蛋白的提取 |
| 4.2.3 ELISA 方法的初步建立 |
| 4.2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.3.2 间接 ELISA 各工作条件的摸索 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.2 融合蛋白的可溶性鉴定 |
| 4.3.2.1 最佳诱导时间的确定 |
| 4.3.2.2 最佳诱导温度的确定 |
| 4.3.2.3 纯化蛋白的浓度 |
| 4.3.3 ELISA 筛选方法的建立 |
| 4.3.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定 |
| 4.3.3.2 一抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.3 二抗作用时间的确定 |
| 4.3.3.4 底物显色液作用时间的确定 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 鸽新城疫 F 基因在毕赤酵母中的表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种和载体 |
| 5.1.2 试剂和培养基 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.1.4 仪器与设备 |
| 5.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-的构建 |
| 5.2.1 引物的设计与合成 |
| 5.2.1.1 目的基因的扩增 |
| 5.2.1.2 胶回收目的基因 |
| 5.2.1.3 目的基因与 pPIC9K 空载体的双酶切 |
| 5.2.1.4 双酶切目的片段与 pPIC9K 空载体的电泳回收 |
| 5.2.1.5 JM109 感受态细胞的制备 |
| 5.2.1.6 目的基因与 pPIC9K 空载体的连接 |
| 5.2.1.7 连接产物的转化 |
| 5.2.1.8 重组表达质粒的提取与鉴定 |
| 5.2.2 重组表达载体 pPIC9K- PPMV-1-F 电转化毕赤酵母 GS115 |
| 5.2.2.1 重组表达载体的线性化 |
| 5.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.3 电激法转化 |
| 5.2.3 高拷贝重组酵母菌株的筛选鉴定 |
| 5.2.3.1 影印接种法筛选 G418 抗性菌株 |
| 5.2.3.2 PCR 法鉴定重组菌株 |
| 5.2.4 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 5.2.5 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达质粒 pPIC9K- PPMV-1-F 的 PCR 与双酶切鉴定 |
| 5.3.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 鸽新城疫 F 基因的真核表达分析及其生物活性研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌种和载体 |
| 6.1.2 试剂和培养基 |
| 6.1.3 培养基 |
| 6.1.4 仪器与设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 鸽新城疫真核表达载体的构建 |
| 6.2.1.1 表达引物的设计 |
| 6.2.1.2 目的片段的 PCR 扩增 |
| 6.2.1.3 进行 PCR 产物凝胶回收与纯化 |
| 6.2.1.4 目的片段和载体的酶切与回收 |
| 6.2.1.5 目的片段与载体的连接 |
| 6.2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 6.2.1.7 连接产物的转化 |
| 6.2.1.8 重组质粒的提取 |
| 6.2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 6.2.2 鸽新城疫真核表达质粒免疫原性研究 |
| 6.2.2.1 免疫用重组质粒的制备与纯化 |
| 6.2.2.2 动物基因免疫 |
| 6.2.2.3 攻毒保护试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.3.2 动物基因免疫 |
| 6.3.3 攻毒保护试验 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.5 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（8）江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述 新城疫病毒基因组的分子生物学研究进展 |
| 一、新城疫病毒的概述 |
| 1、NDV 的基因组演化 |
| 2、NDV 的毒株分类 |
| 二、NDV 各个基因结构蛋白的分子生物学研究 |
| 参考文献 |
| 第一章 新城疫病毒的分离鉴定及分子流行病学 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 四株鸽源新城疫病毒全基因序列的测定及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1. 新城疫及新城疫病毒研究进展 |
| 2. DNA疫苗研究进展 |
| 3. IL-2研究进展 |
| 实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 1. 新城疫病毒F基因疫苗的构建及应用 |
| 2. 鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用研究 |
| 3. 新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究 |
| 4. 基因疫苗、IL-2质粒免疫鸡主要免疫器官的组织学变化研究 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
| 结 论 |
| 致 谢 |
| 参考文献 |
| 附 图 |
四、几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析（论文参考文献）
- [1]中国新城疫病毒的系统发育地理学分析及鸡场感染风险评估体系的研究[D]. 杜吉腾. 四川农业大学, 2020
- [2]表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒rmNA-VP3免疫效果评价[D]. 钦琪. 吉林大学, 2020(08)
- [3]滑液囊支原体分子流行病学调查分析及新型等温检测方法的建立[D]. 吴倩倩. 南阳师范学院, 2020(12)
- [4]基因VIk亚型PPMV-1分离鉴定及致病性分析[D]. 张一帆. 华南农业大学, 2019
- [5]赛鸽新城疫病毒的分离鉴定及HB株灭活疫苗研究与应用[D]. 李佩瑶. 河北北方学院, 2019(01)
- [6]禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析[D]. 王茹. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究[D]. 贺奋义. 甘肃农业大学, 2012(07)
- [8]江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析[D]. 王伟伟. 扬州大学, 2009(01)
- [9]几株鸽新城疫病毒的核酸和蛋白质多态性分析[J]. 马帝,谢建云,邵伟娟,吴祖立,高诚. 上海交通大学学报(农业科学版), 2002(04)
- [10]新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D]. 姜永厚. 东北农业大学, 2000(01)