一、同型半胱氨酸对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响（论文文献综述）
王心妍[1]（2020）在《孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究》文中指出目的 围孕期补充叶酸可以有效预防神经管畸形并提高子代认知表现,但孕中晚期是否有必要持续补充叶酸尚无定论。叶酸介导一碳单位代谢参与核酸合成和DNA甲基化,对中枢神经系统发育和功能至关重要。本研究采用大鼠生殖实验探讨孕期叶酸摄入对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的影响,对孕中晚期补充叶酸的必要性进行探讨,为育龄女性合理补充叶酸提供理论依据;并初步探索其通过DNA甲基化影响神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。方法 将雌性SD大鼠分为:孕期叶酸缺乏组（FA-D）、孕期叶酸正常组（FA-N）、围孕期叶酸短期补充组（FA-S）和孕期叶酸长期补充组（FA-L）。收集母鼠外周血;子代新生鼠脑组织,同时体外培养海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）;部分子代鼠继续喂养至成年用于神经行为学检测。（1）血清叶酸检测:采用化学发光免疫法;（2）神经行为发育检测:采用触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射评价;（3）学习记忆能力检测:采用Morris水迷宫测试;（4）脑组织检测:透射电镜观察脑海马区超微结构;组织免疫荧光法检测神经元和增殖NSCs数量;western blots检测脑源生长因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、突触小泡蛋白（synaptophysin,SYP）表达;（5）体外培养新生鼠海马NSCs检测:采用Alamar Blue检测细胞活力,Brd U掺入和细胞免疫荧光法检测增殖和神经元分化潜力;（6）DNA甲基化检测:采用高通量Me DIP-chip检测分析筛选雄性子代新生鼠脑组织甲基化差异基因;结合KEGG通路富集分析筛选与神经发育过程和学习记忆能力相关的通路。结果1.大鼠孕期补充叶酸促进幼年子代大鼠触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射成熟;改善子代大鼠青少年和成年期的空间学习记忆能力和脑海马区超微结构。孕期长期补充叶酸在促进子代触须定位反射和步态反射成熟,提高子代青少年期和成年期空间学习记忆能力方面优于围孕期短期补充叶酸。2.大鼠孕期补充叶酸促进其子代出生时脑海马神经元产生和NSCs增殖。分离海马NSCs进行体外培养,补充叶酸组体外培养的NSCs活力、增殖能力均较高,诱导分化后神经元比例增高。孕期补充叶酸的子代出生时皮层神经元数量增多,BDNF、SYP表达增加。孕期长期补充叶酸在促进子代新生鼠海马神经元产生、NSCs增殖,提高体外培养的NSCs活力、增殖能力方面优于围孕期短期补充叶酸。3.高通量Me DIP-chip检测分析结果显示,母亲孕期叶酸摄入改变雄性子代新生鼠脑组织DNA甲基化谱,FA-D/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、m TOR信号通路、Notch信号通路、神经营养因子信号通路、内质网蛋白加工通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Rap1信号通路和胞吞通路发生差异甲基化。FA-L/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、轴突导向通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Erb B信号通路、谷氨酸能突触、神经活性配体-受体交互作用通路发生差异甲基化。结论 大鼠孕期补充叶酸,尤其是将围孕期补充叶酸的时间延长至整个孕期,促进子代大鼠神经行为发育,并提高其后期学习记忆能力,其机制可能与叶酸对脑海马区NSCs增殖、神经元分化,及皮层突触发育的促进作用有关,研究初步探索了基于DNA甲基化途径孕期叶酸影响子代大鼠神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。本研究为孕期合理补充叶酸提供理论依据,为后续相关机制的深入研究提供新思路。
翟一静[2]（2020）在《S-腺苷同型半胱氨酸代谢检测方法及与脑卒中发病相关性研究》文中研究说明缺血性卒中是常见的脑血管病,由于其高发病率、高死亡率以及高致残率的特点,使之成为我国成年人致残的首位原因,所带来的全球卫生经济负担和家庭损失是不容忽视的。自1969年以来,学者们证实,高同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）是冠心病、卒中以及多种心血管疾病形成的一个可以改变的独立危险因素。越来越多的证据表明,血浆中Hcy的前体物质S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine,SAH）水平很有可能是比Hcy更为敏感的心血管疾病指示物。流行病学研究发现,脑卒中高危人群发生缺血性脑卒中的风险是非高危人群的数倍,并且吸烟、饮酒、体育锻炼等可改变的危险因素,对于脑卒中的发病、治疗及预后的意义更为重大。S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）作为SAH在甲硫氨酸循环中的上游产物,血液中SAH和SAM含量的检测方法对于相关疾病的研究具有重要意义,已受到广泛关注。血液中的SAH和SAM在肾脏代谢重吸收,两种化合物在尿液中含量对于相关疾病的研究同样具有重要意义。目前尿液中SAH和SAM含量检测方法少有报道,尚缺乏一种准确、快速、简单的检测方法。大脑作为人体内耗氧量最高的器官,短时间的缺血缺氧即可造成神经元细胞发生不可逆的坏死。此种低氧微环境参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,对脑卒中等疾病的转归造成影响。SAH作为可能比Hcy更为敏感的心血管疾病指示物,其对于脑卒中发病的潜在作用机制尚不明确。因此,本研究首先通过人群研究,探究缺血性脑卒中的致病因子以及Hcy、SAH与脑血管损伤的关联性,阐明SAH作为缺血性脑卒中敏感筛查指标和治疗靶点的可行性。基于小分子离子对试剂三氟乙酸的运用,在优化了三种用于净化尿液样本的固相萃取小柱并阐述了相关机制后,建立了一种准确、快速、简单测定尿液中SAH和SAM含量的离子对色谱-固相萃取新方法,方法成功用于实际样品检测,为SAH和SAM的后续研究提供了技术支持。再者,利用氧-葡萄糖剥夺细胞模型,探究SAH在缺血性卒中发病中的凋亡相关机制,为进一步明确缺血性卒中的发病机理以及开展临床治疗提供理论依据和新的思路。主要内容如下:第一部分:S-腺苷同型半胱氨酸及其代谢产物与缺血性脑卒中发病的相关性研究目的:探究与缺血性脑卒中发病密切相关的致病因子,阐明Hcy、SAH作为潜在的导致脑微血管内皮损伤因素的关联性,明确SAH作为缺血性脑卒中筛查敏感性指标及治疗靶点的可行性。方法:本研究2018年6月至2019年10月间在河北省石家庄市河北医科大学第一医院招募健康个体240人、脑卒中高危个体143人和脑卒中患者189人为研究对象。通过开展问卷调查,并结合相应的体格检查和实验室检查手段,获取三组人群不良生活方式、既往慢性病史和家族史情况,以及常见临床指标信息,并测得与Hcy代谢密切相关的SAM、SAH等物质的构成与代谢差异情况。结果:通过对各组间研究对象进行性别、年龄匹配并且剔除信息缺失者后,最终将78例健康者、80例脑卒中高危者和88例脑卒中患者纳入统计分析中。BMI指数、腰臀比的测量结果显示,患者组及高危组人群的测量值均大于健康组人群（P<0.05）。患者组及高危组人群中吸烟者所占比例远高于健康组人群,两组中吸烟者人数超过健康组中吸烟人数的二倍（P<0.05）。健康组中有体育锻炼习惯的人数最多,且该项指标在三组人群中的分布情况具有显着的统计学差异（P<0.05）。婚姻状况及是否饮酒这两项指标在三组人群之间未见显着的统计学差异。三组研究对象的收缩压及舒张压测量结果表现为患者组>高危组>健康组（P<0.05）。高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的测定结果表现为,健康组>高危组>患者组（P<0.05）。高危组的甘油三酯水平高于患者组和健康组（P<0.05）。患者组的血糖值略低于高危组和健康组（P<0.05）。超敏C反应蛋白的测定结果表现为,患者组>高危组>健康组（P<0.05）。高危组和患者组的尿酸均值明显高于健康组（P<0.05）。总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的测定结果在三组人群之间未见显着的统计学差异。患者组内有高血压病史的人数最多,高危组次之,健康组内无高血压病史者（P<0.05）。健康组内无糖尿病史者,高危组内有糖尿病史者所占比例略高于患者组（P<0.05）。在既往有TIA发作的个体中,有17人属于患者组,14人属于高危组,健康组内无既往TIA发作的研究对象（P<0.05）。患者组中既往有脑卒中病史的人数远多于高危组和健康组（P<0.05）。高危组人群中有脑卒中家族史的个体数多于患者组和健康组（P<0.05）。患者组血浆中Hcy含量显着高于高危组和健康组,并且三组人群之间Hcy的含量存在显着的统计学差异（P<0.05）。健康组人群血浆中SAM的含量最高,高危组次之,患者组最低（P<0.05）。血浆中SAH含量在三组人群之间无显着的统计学差异（P>0.05）。SAM/SAH比值的结果表现为,患者组<高危组<健康组,且患者组与健康组之间的SAM/SAH存在显着的统计学差异（P<0.05）。小结:Hcy对脑卒中发病的危害性始终存在,SAH与缺血性脑卒之间的关系复杂且密不可分,仍需开展更进一步的调查研究以论证二者之间的确切联系。同时,对脑卒中高危人群的筛查和干预,将对降低脑卒中的发病率及改善预后起到重要影响。第二部分:尿液中S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸检测新方法建立运用及其固相萃取机制研究摘要:目的:建立检测尿中S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的离子对色谱新方法,研究检测SAH和SAM尿液样本的固相萃取相关机制。方法:考察了Elut PBA、Bond Elut PRS、Bond Elut CBA三种固相萃取小柱对尿液样本中SAH和SAM的萃取效果并研究了相关萃取机制。样品加入30%高氯酸沉淀蛋白,上清经最优的固相萃取小柱净化,洗脱液通过0.25μm滤膜过滤后收集于进样小瓶中备用。样品中的SAH和SAM经三氟乙酸作为离子对试剂的离子对色谱分离后在二极管阵列检测器完成检测。结果:确定Elut PBA为最佳的固相萃取小柱,并阐明了相关萃取机制。SAH和SAM在0.1-10μmol/L和0.5-60μmol/L范围内呈良好线性关系,回归方程分别为y=4.6492x-0.0718（R2=0.9998）、y=9.4968x+0.8157（R2=0.9999）。SAM和SAH的检测限（LOD）分别为0.01和0.006μmol/L,定量限（LOQ）分别为0.04和0.02μmol/L。SAM和SAH的日内和日间精度均低于1.38,回收率在83.65%至98.41%之间。小结:建立了一种测定尿中SAH和SAM的离子对色谱新方法,阐明了相关固相萃取机制,方法准确、快速、简单、经济,阐明的相关机制对SAM和SAH的其它研究具有一定的指导意义。方法成功运用于实际样品的测定,结果令人满意。第三部分:S-腺苷同型半胱氨酸在缺血性脑卒中发病中的凋亡相关分子机制研究目的:探究S-腺苷同型半胱氨酸诱导b.End3细胞凋亡的具体分子机制。方法:利用b.End3细胞构建氧-葡萄糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型,并在此基础上添加3-脱氮腺苷（3-deazaadenosine,3-DZA）,使得b.End3细胞内SAH含量堆积。通过对细胞内总乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的检测及CCK-8比色法测定细胞存活率,来分析b.End3细胞受损情况。采用Annexin V-PI双染色流式细胞术测定不同干预组的细胞凋亡率。利用Western Blot免疫印迹法测定各处理组中凋亡相关蛋白以及信号通路有关蛋白的表达量情况。结果:根据不同接种密度时细胞的生长状态,确定以9*103个/100μl接种密度用于后续研究当中。根据不同氧-葡萄糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）时间导致细胞损伤的程度以及细胞存活率的结果,确定OGD 25小时为最适宜干预时长。LDH测定结果显示,与Con组相比,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组的LDH释放量均明显增加,并且各处理组之间LDH释放量依次增加,各组之间的释放量均存在显着的统计学差异（P<0.05）。细胞存活率测定结果显示,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组细胞存活率均显着下降,以3-DZA+OGD组的细胞存活率最低。在Annexin V-PI双染色流式细胞术测得的细胞凋亡率结果中,3-DZA+OGD组的总凋亡率显着高于其余处理组,并且各处理组间的总凋亡率存在显着的统计学差异（P<0.05）。Western blot实验结果显示,与Con组相比,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组中Bcl-2/Bax蛋白的相对表达量均明显下降。促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白的相对表达量在3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组中呈现依次增加的趋势。JNK信号通路蛋白p-JNK/JNK的相对表达量的趋势与Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白的表达趋势相一致。Western blot结果中各组间蛋白表达量的差异均存在显着的统计学差异（P<0.05）。添加阻断剂SP600125后,3-DZA+OGD+IN组细胞内LDH释放量要少于3-DZA+OGD组,并且前者的细胞存活率要显着高于后者（P<0.05）。流式细胞术对三组细胞凋亡率的测定结果表明,3-DZA+OGD+IN组细胞的总凋亡率显着低于3-DZA+OGD组（P<0.05）。3-DZA+OGD+IN组细胞中Bcl-2/Bax蛋白的相对表达量显着高于3-DZA+OGD组。促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白以及信号通路蛋白p-JNK/JNK的相对表达量趋势一致,均表现为3-DZA+OGD+IN组中表达量低于3-DZA+OGD组的现象（P<0.05）。小结:SAH能够造成b.End3细胞损伤并导致b.End3细胞内凋亡率升高和相关促凋亡蛋白表达的升高以及抑凋亡蛋白表达的下降,通过对MAPK信号通路的三条重要分支通路的Western blot检测确定了SAH致凋亡的具体调控信号通路--JNK通路。进一步在回复实验的基础上明确了SAH通过JNK信号通路的激活得以诱导b.End3细胞内凋亡现象的发生。
李艳霞[3]（2020）在《HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究》文中研究指明目的:主要探讨PD模型中HtrA2/Omi功能异常与DA神经元凋亡、内质网应激及Wnt信号通路相关性的分子机制,并评估干预HtrA2/Omi、Wnt、GSK3β等分子靶点的神经保护作用。方法:1.采用6羟基多巴胺（6-OHDA）干预PC12细胞,构建PD细胞损伤模型,观察6-OHDA诱导下细胞形态学变化。CCK8法检测细胞活力,筛选最佳造模浓度。免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶（TH）的表达。流式细胞法检测细胞的凋亡率。利用Western Blot免疫印迹（WB）技术检测内质网应激及凋亡相关蛋白α-syn、CHOP、Grp78、active caspase3、XIAP和TH等蛋白水平的改变。siRNA慢病毒转染沉默HtrA2/Omi基因,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测沉默效率。WB法检测细胞内质网应激、凋亡蛋白、Wnt通路蛋白。2.CCK8法筛选Ucf101（HtrA2/Omi的特异抑制剂）的最佳浓度。WB法检测Ucf101对PD模型细胞的内质网应激的影响;采用脑立体定位技术右侧黑质致密部（SNc）和中脑腹侧被盖（VTA）两点注射6-OHDA法,建造PD大鼠模型。分别于术后2周、3周、4周腹腔注射阿扑吗啡（APO）,诱导动物的旋转行为。WB法检测HtrA2/Omi、activate Caspase3、α-syn,内质网应激、凋亡相关蛋白等蛋白的表达。Ucf101持续干预大鼠4周,观察大鼠的行为,免疫组织化学检测中脑组织TH的表达。WB法检测大鼠中脑组织HtrA2/Omi、TH表达、内质网应激、凋亡相关蛋白及Wnt通路蛋白的表达。3.WB法分析PD细胞模型的Wnt通路蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的Wnt1蛋白浓度,流式细胞术检测Wnt1蛋白对PD模型细胞凋亡的影响,WB法检测内质网应激相关蛋白的表达;CCK8法筛选最佳的LiCL（GSK3β特异抑制剂）浓度,免疫荧光法检测细胞TH、Wnt1的表达。结果:1.细胞存活率与6-OHDA呈时间剂量依赖性下降的趋势,60μM时细胞的存活率为51.37±2.83%,选择60μM作为6-OHDA-PD细胞模型的造模浓度。PD模型细胞0-24h HtrA2/Omi表达呈升高趋势。与对照组比较,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达下调,P<0.05,模型组的凋亡率明显升高。沉默HtrA2/Omi基因,HtrA2/Omi mRNA的表达明显下降,P<0.05。与模型细胞组比较,HtrA2/Omi基因沉默组细胞凋亡率升高,α-syn、Bip/Grp78、CHOP、active caspase3的表达上调,P<0.05;凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达下调,P<0.05,加剧了6-OHDA对细胞的内质网应激损伤。GSK3β磷酸化分子tyr216/Ser9比值升高,Wnt通路受抑制。2.Ucf101的干预浓度,2.5uM使细胞活力明显升高,10uM、20uM均使模型细胞活力下降,P<0.05。2.5uM Ucf101可降低模型细胞的凋亡率,10uM Ucf101可加剧模型细胞的凋亡。2.5uM Ucf101预处理PD模型细胞,内质网应激标志分子Bip/Grp78和CHOP的表达下降,P<0.05;Ucf101可改善PD大鼠APO诱导的旋转行为,中脑TH表达增加。Ucf101减少PD大鼠中脑α-syn的积聚,降低ERS水平,下调caspase3,上调TH和XIAP,保护DA神经元。PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin下调,p-GSK3β（ser9）/p-GSK3β（tyr216）的比率降低。Ucf101上调PD大鼠的Wnt-3α、β-catenin和p-GSK3β（ser9）,下调p-GSK3β（tyr216）。Ucf101激活PD大鼠DA神经元的Wnt通路,降低GSK3β的活性,保护DA神经元。3.PD模型细胞24h内的p-GSK3β（ser9）、β-catenin、p-Akt的表达呈下降趋势,p-GSK3β（Tyr216）的表达呈上升趋势。6-OHDA抑制了Wnt通路的激活,升高GSK3β的活性。CCK8法筛选Wnt1的最佳浓度为100ng/mL,Wnt1使PD模型细胞的Bip/Grp78和CHOP的表达明显降低。Wnt1可减缓6-OHDA所致的内质网应激及凋亡。LiCL的最佳浓度为2mM,LiCl可使模型细胞的存活率增高,上调Wnt和TH的表达,激活了Wnt信号通路,减轻6-OHDA导致的细胞损伤。结论:1.6-OHDA使体内和体外PD模型上调α-syn、HtrA2/Omi、ER应激及凋亡相关蛋白,抑制Wnt通路,激活GSK3β,促进DA神经元凋亡;2.沉默HtrA2/Omi基因可加剧PD模型细胞的ER应激及凋亡,进一步抑制Wnt通路,激活GSK3β,加重细胞损伤;3.轻度抑制HtrA2/Omi能缓解6-OHDA所致的ER应激,减轻DA神经元的凋亡,激活Wnt通路,抑制GSK3β,具有一定的神经保护价值;4.Wnt1缓解PD模型细胞的ERS,减少细胞凋亡;LiCl下调模型细胞的ERS,减少细胞凋亡,抑制GSK3β,激活Wnt通路,具有一定的神经修复价值;5.证明HtrA2/Omi功能异常与ERS在PD发病机制中可能发挥重要作用,Wnt通路及Wnt、GSK3β等分子在细胞凋亡的级联反应中起关键作用,可能作为PD研究及治疗的靶点。
刘玉思[4]（2020）在《神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究》文中研究表明目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是一种常见的出生缺陷,通常是由胚胎发育早期神经管闭合不完全或者闭合失败引起的。NTDs的发病率在1‰-5‰,其危险因素涉及环境、生物、遗传、辐射和化学药品等。NTDs作为一种复杂的多基因疾病,目前尚不清楚其具体病因,其遗传因素中的基因突变或各信号通路中分子间的相互作用和表达调控机制异常,可能在NTDs的发生中起着重要作用。细胞凋亡又称细胞程序性死亡,在胚胎发育、组织器官形态形成和功能确定等生命活动中普遍存在并发挥着重要作用。研究表明,在神经管发育过程中,由于自身基因缺陷或其他因素引起的细胞凋亡相关基因的功能紊乱,打破了细胞增殖与凋亡的动态平衡,则会导致NTDs的发生。在前期研究中,我们分别发现microRNA-322（miR-322）和前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）在NTDs中低表达:在糖尿病引起的NTDs中,mi R-322低表达,且抑制高糖诱导的小鼠神经干细胞凋亡;在对E11孕鼠血清的蛋白质组的分析中发现,与对照组相比,NTDs组中PCSK9的蛋白表达水平明显降低。这些发现提示mi R-322、PCSK9具有成为NTDs早期筛查的分子标志物及干预治疗新靶点的潜能,但其参与NTDs发生具体分子机制并不清楚。因此,本研究旨在通过全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）建立NTDs动物模型,探索miR-322和PCSK9在NTDs中的表达规律及其对细胞凋亡的影响,明确其参与NTDs发生的具体分子机制。方法:本研究分为以下两个部分:1、miR-322通过沉默NOX4参与NTDs的形成1.1使用ATRA建立小鼠NTDs模型并于胚胎发育的E9.5取材。通过qRT-PCR检测miR-322、NOX4的表达水平;通过western blot方法检测NOX4蛋白的表达水平。1.2生物信息学预测miR-322的靶基因。培养小鼠神经干细胞C17.2并转染生物素标记的mi R-322和阴性对照。收集细胞裂解液,通过RNA pull down验证miR-322与NOX4的结合。1.3将构建的NOX4萤光素酶报告基因质粒与miR-322 mimic或阴性对照共转染C17.2细胞,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-322与NOX4的相互作用。之后在细胞内进一步明确miR-322与NOX4的负向调控关系。1.4在C17.2细胞中干扰NOX4的表达,通过western blot检测相关凋亡指标的变化情况;在C17.2细胞中过表达NOX4,同时再转染miR-322 mimic,通过western blot检测相关凋亡指标的变化情况,并通过TUNEL实验检测细胞凋亡水平。1.5在体外胚胎培养中,向NTDs组的胚胎羊膜腔内注射miR-322模拟物。通过观察组织形态、western blot检测NOX4和凋亡相关指标的表达、TUNEL检测细胞凋亡水平,从而评估miR-322对减少细胞凋亡及治疗NTDs的效果。2、PCSK9在大鼠NTDs中的表达情况及抑制PCSK9增加NTDs发生风险的机制探究2.1使用ATRA建立大鼠NTDs模型,分别于胚胎发育的E11-E20取脊髓组织。2.2分别采用qRT-PCR、Western Blot检测PCSK9在大鼠胚胎发育过程中E11-E20的表达情况。2.3采用血药浓度测定和Western Blot评价PCSK9抑制剂SBC115076效果。2.4探究PCSK9抑制剂SBC115076与ATRA联合使用,是否能导致NTDs发生率增加,或是否能增加胎鼠对ATRA的致畸敏感性。2.5使用PCSK9敲除小鼠进一步验证PCSK9是否增加胎鼠对ATRA的致畸敏感性。2.6使用Western Blot验证抑制PCSK9后,C17.2神经干细胞和胚胎脊髓组织中caspase3、Bcl2、Bax的表达变化,探究PCSK9与凋亡的关系。2.7使用脂质组学技术分析孕鼠血清样本和胚胎脊髓组织样本中的脂质成分及表达量。结果:1.miR-322通过沉默NOX4参与NTDs的形成1.1在ATRA构建的NTDs小鼠模型中,mi R-322表达下调。相反,NOX4的蛋白表达水平发生了明显上调,但mRNA水平并没有明显改变。1.2 NOX4是miR-322的潜在靶基因,且二者之间的相互作用是通过存在于NOX4 mRNA的3’端非翻译区上的结合位点实现的。当过表达miR-322时,NOX4的蛋白表达水平相应地降低,但mRNA水平没有明显改变;当抑制miR-322时,NOX4的蛋白表达水平明显升高,mRNA水平同样无明显变化。1.2在C17.2细胞中,干扰NOX4的表达,促凋亡蛋白caspase3和Bax的表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加;而过表达NOX4后,促凋亡蛋白caspase3和Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少,且细胞凋亡水平增加;在此基础上,同时转染miR-322 mimic,可以挽回NOX4过表达导致的凋亡相关蛋白的改变,同时减少细胞凋亡。1.3向胚胎羊膜腔内注射miR-322 mimic治疗后,检测到胚胎中NOX4的蛋白表达明显降低。与此同时,Bcl-2表达水平升高,caspase3和Bax的表达发生下调,细胞凋亡减少。2、PCSK9在大鼠NTDs中的表达情况及抑制PCSK9增加NTDs发生风险的机制探究2.1在胚胎发育的E11-E20,与对照组相比,NTDs组PCSK9的mRNA和蛋白水平发生明显下调。2.2 SBC115076可抑制大鼠体内PCSK9的表达。SBC115076与ATRA联用可以增加胚胎的畸形率。在PCSK9-/-小鼠中也得到一致结论。2.3抑制PCSK9可增加C17.2神经干细胞和胚胎脊髓组织中促凋亡蛋白caspase3、Bax的表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论:1.NOX4是mi R-322的新靶点,并通过位于NOX4 mRNA 3’端非翻译区的结合位点与miR-322相互作用2.低表达的miR-322可增加NOX4蛋白表达水平引起细胞凋亡,参与NTDs发生。3.miR-322对NTDs胚胎细胞凋亡的治疗作用,可成为治疗NTDs的新靶点。4.PCSK9在NTDs脊髓组织发育过程中持续低表达。5.抑制PCSK9能够增加胚胎对ATRA的致畸敏感性。6.抑制PCSK9可通过上调Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2促进细胞凋亡,从而参与NTDs发生。
杨树[5]（2018）在《母鼠日粮添加甜菜碱对大鼠肝脏IGF2表达的继代影响及机制》文中研究说明胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）是胰岛素/IGF系统的一个重要组成部分,能调节细胞生长、增殖及代谢。血液中的IGF2主要来源于肝脏。IGF2是哺乳动物中几百个印记基因之一,其转录活性不仅会受到启动子区甲基化状态的影响,还受到印记控制区（imprinting control region,ICR）甲基化状态的调控。甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物,它在机体内的来源有两个。一是通过饮食摄入,二是在肝脏与肾脏中通过胆碱内源性合成。在肝脏中甜菜碱的主要作用是作为甲基供体参与代谢。过去人们发现饲料添加甜菜碱能促进动物生长,可能和提高的血液GH/IGF1水平有关。甜菜碱对生长因子IGF2表达的影响少有报道。此外,过去对甜菜碱的研究多集中在直接添加的促生长作用,或通过妊娠期日粮添加对新生儿代谢的作用,而缺乏母体甜菜碱对F1子代动物出生后的生长发育影响的相关报道,对F2代动物的生长发育的研究更是罕有报道。本研究的目的是阐述母鼠日粮添加甜菜碱对F1/F2子代大鼠肝脏IGF2表达的继代影响,并揭示其机制。1母鼠日粮添加甜菜碱对F1代断奶仔鼠肝脏IGF2表达的影响及机制40只平均体重约400g的3月龄Sprague-Dawley雌鼠（F0）交配后饲喂不同日粮并分组。对照组母鼠饲喂基础日粮,甜菜碱组饲喂添加甜菜碱的日粮。甜菜碱（纯度98%,Sigma-Aldrich）以10g/kg的水平混匀在基础饲料中。所有大鼠均在受控的温度（22±0.5℃）、湿度（50±5%）和光照（12小时光照/12小时黑暗）的环境下饲养,动物可以自由进食和饮水。F1代仔鼠出生后,记录产仔数和出生重后,将每窝幼仔数调整为10只（5只雄性和5只雌性）。在第21天（D21）断奶,此后所有鼠的日粮都使用基础日粮。除断奶采样的仔鼠外,其余的F1仔鼠饲养至45日龄（D45）,然后从每组中挑选10只雄性仔鼠,并每笼单只饲养至63日龄（D63）。母鼠日粮添加甜菜碱显着增加了产仔数和窝重（P<0.05）,而F1代雄鼠出生重、断奶重和45日龄体重低于对照组（P<0.05）。甜菜碱组45日龄到63日龄期间的平均日增重显着高于对照组（P<0.05）,至63日龄体重在两组无显着差异。免疫组化染色发现,甜菜碱组F1断奶雄性仔鼠肝脏增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞数高于对照组（P<0.05）。肝组织中PCNA蛋白水平,以及周期蛋白1（cyclin D1,CCND1）和PCNA的mRNA水平在甜菜碱组显着高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的增殖增加。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）结果发现,甜菜碱组的TUNEL 阳性细胞数高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的凋亡也增强。细胞内信号通路检测发现,甜菜碱组ERK介导的增殖和AMPK介导的凋亡途径均被激活。断奶时,甜菜碱组大鼠肝脏IGF2免疫组化阳性染色、肝组织中IGF2蛋白水平和血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。在转录水平,甜菜碱组肝脏4种IGF2变体mRNA水平均高于对照组（P<0.05）,且总IGF2与H19mRNA的比值高于对照组（P<0.05）。进一步研究发现,IGF2基因启动子区甲基化水平在甜菜碱组不变,但是4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点中有3个位点在甜菜碱组显着升高（P<0.05）。另外,甜菜碱组的肝脏中甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（betaine homocysteine methyltransferase,BHMT）和 DNA 甲基转移酶 1（DNA（cytosine-5）-methyltransferase 1,DNMT1）蛋白水平显着高于对照组（P<0.05）。以上结果推测,断奶时甜菜碱组F1雄鼠肝脏甲基化过程增强,改变了 ICR甲基化状态。ICR的高甲基化状态可能与IGF2转录升高有关。另一方面,母体甜菜碱组子代可能通过母乳或者采食的方式接触了额外的甜菜碱,激活了肝脏凋亡信号通路。2母鼠日粮添加甜菜碱对F1代成年子鼠肝脏IGF 2表达的影响及机制甜菜碱通过母体影响后代新生儿生长以及代谢的研究已有报道。但是对于后代成年期的研究尚未见报道。前面的研究结果发现,尽管母鼠日粮添加甜菜碱的F1子代雄鼠的出生体重和断奶体重较低,但在成年时表现出追赶性生长。为揭示这一现象,我们进一步研究了 D63时雄性仔鼠肝脏细胞增殖和凋亡状况,以及肝脏IGF2表达及其调控的相关机制。免疫组化染色发现,在甜菜碱组F1成年雄性仔鼠肝脏PCNA 阳性细胞核数高于对照（P<0.05）。和断奶时相似,肝组织中PCNA蛋白水平和PCNA的mRNA水平,在甜菜碱组显着高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞增殖增加。但是,成年时甜菜碱组肝脏TUNEL 阳性细胞核数低于对照组（P<0.05）,相应的Caspase 3活性也降低,说明此时肝细胞的凋亡减弱。细胞内信号通路检测发现,甜菜碱组肝脏AKT/ERK介导的增殖被激活,而AMPK介导的凋亡途径减弱。成年时,肝脏IGF2免疫组化阳性染色、IGF2蛋白水平和血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。和断奶时相似,成年时甜菜碱组肝脏4种IGF2变体mRNA水平均高于（P<0.05）对照组,总IGF2与H19mRNA的比值高于对照（P<0.05）。通过MeDIP检测发现,肝脏4个IGF2启动子区甲基化水平在甜菜碱组不变,然而在4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点中有3个位点在甜菜碱组显着高于对照（P<0.05）。成年雄鼠肝脏中BHMT和DNMT1等相关蛋白水平均在两组中未有显着差异。从以上结果推测,肝脏IGF2转录水平上升可能与ICR高甲基化状态有关。从断奶到成年期间,两组饲喂的都是基础日粮,这暗示着成年时的ICR甲基化印记可能是从断奶时保留至成年。另一方面,在成年时甜菜碱组较高的血清IGF2可能与该时期生长快有关。3祖代母鼠日粮添加甜菜碱对F2代断奶仔鼠肝脏IGF 2表达的影响及机制前面我们研究了母体甜菜碱对F1代仔鼠生长及肝脏的IGF2表达的影响,但是对于F2代仔鼠有无影响还未见相关报道。为了认识祖代母鼠甜菜碱对大鼠生长及肝脏IGF2表达的继代影响,我们观察了 F2代雄性仔鼠在断奶时的生长状况,并进一步研究了 F2代断奶肝脏细胞增殖和凋亡状况,以及IGF2表达调控中相关的机制。本实验使用40只交配后的雌性F1大鼠繁育F2子代大鼠,按照雌鼠不同来源分成F2对照组和F2甜菜碱组,每组20只。F2代仔鼠出生后,记录产仔数和出生重后将每窝幼仔数调整为10只（5只雄性和5只雌性）。在第21天将F2雄性后代断奶并采样。祖代母鼠日粮添加甜菜碱没有影响F2代的产仔数、窝重和F2雄鼠出生重,但是断奶重高于对照组（P<0.05）。F2断奶时,甜菜碱组肝脏PCNA阳性细胞数高于对照组（P<0.05）。肝脏PCNA蛋白和mRNA水平在甜菜碱组高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞增殖增加。另外,甜菜碱组肝脏TUNEL 阳细胞数低于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的凋亡减弱。细胞内信号通路检测发现,在甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖被激活,而AMPK介导的凋亡途径减弱。F2断奶时,甜菜碱组肝脏IGF2免疫组化阳性染色和肝脏IGF2蛋白水平,以及血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。在转录水平,甜菜碱组肝脏4种IGF2转录变体mRNA、总IGF2和H19 mRNA水平均高于对照（P<0.05）,但总IGF2与H19mRNA比值不变。MeDIP结果显示,F2代断奶时4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点甲基化状态在两组没有差异,但4个不同IGF2启动子区甲基化水平均在甜菜碱组降低（P<0.05）。与甲基化过程相关的蛋白只有DNA甲基转移酶3A在甜菜碱组表达降低（P<0.05）。据以上结果推测,祖代母鼠日粮添加甜菜碱可能影响F2代断奶仔鼠肝脏IGF2启动子甲基化而非印记控制区甲基化,提高了 IGF2转录水平,进而影响肝脏IGF2蛋白表达。较高的IGF2血清浓度与断奶时体重增加有关。4甜菜碱对HepG2细胞IGF2基因表达的继代影响及机制前面的在体实验发现,母鼠日粮添加甜菜碱可以促进F1子代断奶和成年时肝脏的IGF2基因表达,同时还改变了 IGF2/H19印记控制区的甲基化修饰。我们使用甜菜碱处理HepG2细胞为模型,以研究甜菜碱添加能否直接影响肝细胞的IGF2基因表达,是否同样改变印记控制区甲基化状态,以及能否通过有丝分裂传递到子代细胞。HepG2细胞使用完全培养基（含10%FBS、抗生素的高糖DMEM培养基）培养。六孔板每孔种下5×105个细胞,48h后使用甜菜碱处理细胞,处理24h后收样（P0细胞）。P0细胞消化传代种板48 h后,无添加甜菜碱继续培养24 h后收获（P1细胞）。前期在Cell Counting Kit-8（CCK8）实验中,使用不同浓度甜菜碱处理HepG2细胞后,发现20 mM浓度处理48 h后P0代HepG2细胞的CCK8活力显着高于对照（P<0.05）。根据CCK8的结果,选择20 mM甜菜碱浓度进行后续实验。P1代HepG2细胞,在种下48 h和72 h后CCK8活力均显着高于对照（P<0.05）。流式细胞仪检测细胞周期结果发现,甜菜碱组P0和P1细胞的增殖均高于对照（P<0.05）。同样,甜菜碱组P0和P1细胞的PCNA蛋白水平均高于对照组（P<0.05）。在甜菜碱组,P0细胞的Caspase 3酶活高于对照组（P<0.05）,但是P1细胞的Caspase 3酶活低于对照组（P<0.05）。相应的甜菜碱组P0细胞的凋亡水平高于对照组（P<0.05）,但P1细胞的低于对照组（P<0.05）。细胞内信号通路检测发现,在P0代细胞,甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖和AMPK介导的凋亡途径均被激活。在P1代细胞,甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖被激活,但是AMPK介导的凋亡途径减弱。与在体F1代大鼠断奶和成年实验相似,甜菜碱组P0和P1细胞IGF2蛋白水平高于对照（P<0.05）。甜菜碱组IGF2与H19 mRNA 比值升高（P<0.05）,同时4种IGF2转录变体mRNA水平也在甜菜碱处理组P0和P1细胞中增加（P<0.05）。MeDIP结果发现,在甜菜碱组P0和P1细胞中,4个IGF2启动子区甲基化水平不变,但是IGF2/H19印记控制区的CTCF结合位点甲基化水平升高（P<0.05）。甲硫氨酸循环相关蛋白检测,发现甜菜碱使P0细胞甘氨酸N-甲基转移酶（glycine N-methyltransferase,GNMT）升高（P<0.05）。两组的P1细胞中,甲硫氨酸循环相关蛋白和DNMT1都没有改变。以上结果表明,甜菜碱处理可以增强HepG2细胞的IGF2表达,同时HepG2细胞的印记控制区CTCF位点高甲基化。甜菜碱处理影响到无甜菜碱处理的P1代细胞的IGF2表达,伴随着甲基化印记传递到P1细胞。综上所述,母鼠日粮添加甜菜碱提高了 F1子代断奶和成年时大鼠肝脏IGF2表达伴随着IGF2/H19印记控制区高甲基化,提高了 F2子代断奶时大鼠肝脏IGF2表达伴随着IGF2启动子低甲基化。在体外,甜菜碱提高了 HepG2细胞IGF2的表达,同时IGF2/H19印记控制区高甲基化状态可传递到子代细胞。
李丹[6]（2018）在《基于iTRAQ蛋白质组RNA剪接相关蛋白HNRNPs低表达对神经管缺陷的影响》文中认为目的:研究体内高同型半胱氨酸（Hcy）水平下,人神经管畸形（NTDs）胎儿脑组织蛋白质组的表达变化谱,并筛选差异表达蛋白。进一步在HTL诱导鸡胚模型和体外高HTL处理的小鼠神经干细胞（NE4C）模型中验证差异蛋白表达水平的变化。探究在高Hcy的NTDs样本中差异表达蛋白的变化,为临床上预防和降低NTDs缺陷儿的出生提供可能的试验依据。方法:一方面应用已有的人类NTDs库中高Hcy脑组织样本,采用基于质谱的同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术,筛选NTDs胚胎脑组织中的差异表达蛋白,通过生物信息学分析,进一步筛选到与NTDs发生相关的RNA结合蛋白,利用质谱平行反应监测（PRM）技术对目标蛋白进行绝对定量以验证其表达差异。另一方面,构建高同型半胱氨酸诱导的鸡胚NTDs模型,在E2期进行同型半胱氨酸代谢物同型半胱氨酸硫代内酯（HTL）的神经沟注射,在胚胎发育的E5时期收集正常组和HTL处理组鸡胚,利用PRM技术对RNA相关蛋白进行绝对定量以验证蛋白在两组中的差异。同时采用RT-PCR验证差异蛋白的mRNA水平,免疫组化验证差异蛋白的蛋白水平表达变化。另外在体外细胞水平上,应用5mM的HTL处理小鼠神经干NE4C细胞,用RT-PCR验证差异蛋白的mRNA水平,用WB及免疫荧光验证差异表达蛋白的表达变化。结果:（1）在人胚胎脑组织中共检测到6076种蛋白。通过对比高Hcy NTDs脑组织样本和正常对照组样本,共发现448个差异蛋白表达水平发生显着改变,其中表达水平上升的有214个,下降的有234个。经生物信息学分析,发现差异表达蛋白与RNA剪接、核糖体合成、RNA转运、RNA降解、mRNA监管等生物学过程相关,且RNA相关蛋白的表达呈下降趋势。（2）进一步在4例正常和4例NTDs样本中用PRM技术验证了差异表达蛋白的变化,发现六种蛋白（ALYREF,RBMX,HNRNPA1,HNRNPA3,HNRNPAB,EEF1A1）在NTDs样品中的水平显着降低,这与iTRAQ结果一致。（3）首次应用HTL鸡胚神经沟注射诱导获得鸡胚NTDs模型。（4）在HTL诱导的鸡胚NTDs模型中,经PRM分析,发现与剪接体相关的RNA结合蛋白HNRNPA1和HNRNPAB呈下降趋势,且mRNA表达水平也降低,免疫组化进一步确证HNRNPA1和HNRNPAB的低表达。（5）在HTL处理的NE4C细胞中,WB提示HNRNPA1和HNRNPAB的表达水平降低且mRNA表达水平也降低,免疫荧光提示HNRNPA1和HNRNPAB的细胞亚定位异常。（6）在NTDs胎儿脑组织中WB显示HNRNPA1和HNRNPAB的表达下降。结论:（1）提示高Hcy通过影响RNA代谢途径的HNRNPA1和HNRNPAB低表达可能是NTDs发生的新机制。（2）0.5mM HTL神经沟注射的新方法成功构建NTDs鸡胚动物模型。
王天舒[7]（2016）在《Hsa-let-7g对甲基丙二酸血症中MMACHC影响的研究》文中提出研究背景甲基丙二酸血症（Methylmalonic acidemia, MMA）是有机酸血症中最常见的类型,属于常染色体隐性遗传。根据代谢酶缺陷的不同,将MMA分为甲基丙二酰辅酶A变位酶（MCM）缺陷及其辅酶钻胺素（cobalamin, cbl）代谢障碍两大类。钻胺素代谢障碍又根据其不同活性形式的损伤分为甲基钻胺素（MeCbl）缺陷和腺苷钻胺素（AdoCbl）缺陷两类。其中甲基钻胺素（MeCbl）缺陷临床表现为甲基丙二酸血症合并高同型半胱氨酸血症,包括Cb1C, Cb1D和Cb1F三个临床亚型。MMACHC、MMADHC、 LMBRD1基因突变分别是导致cb1C亚型、cb1D亚型和Cb1F亚型发病的遗传基础。在我国大陆的最常见的是cb1C亚型。MicroRNAs参与诸多生物学过程。Let-7作为miRNA家族中的重要成员之一,在肿瘤、炎症等多种疾病的发生发展中起着重要的作用。有研究认为,Let-7是MMA的可能生物标志物。本研究着眼于Let-7家族成员之一hsa-let-7g在晚发型甲基丙二酸血症合并高同型半胱氨酸血症疾病中所起的调控作用。进而探讨hsa-let-7g在MMA中的具体生物学功能,为hsa-let-7g在MMA的临床诊断、治疗、预后评估提供理论基础。主要研究内容及结果如下第一部分Hsa-let-7g在甲基丙二酸血症患者血浆的表达特征目的对hsa-let-7g在甲基丙二酸血症患者血浆的表达特征进行研究。方法选取2011年8月到2016年1月在郑州大学第一附属医院及郑州大学第三附属医院神经内科及儿科住院治疗的晚发型MMA患者21例为病例组,所有患者经气相色谱-质谱（GC/MS）明确诊断并于治疗3周后复查。选择患者同年龄段未患病健康亲属19例作为对照组。留取血浆,采用实时定量PCR测定hsa-let-7g的血浆表达。结果1. GC/MS结果提示,MMA组治疗前尿甲基丙二酸值倍率2360.532±1589.506,治疗后所有患者尿甲基丙二酸值倍率均不同程度的降低,为624.540±420.946,两者有显着性差异（P<0.011）。对照组尿甲基丙二酸值倍率均小于100,为8.284±2.615,与MMA组治疗前、后均有显着性差异（P<0.01）.2. Q-PCR吉果提示：与健康对照组相比较,hsa-let-7g在治疗前组呈高表达（p<0.01）。治疗前组与治疗后组相比较,hsa-let-7g在进行治疗后表达有所下降（p<0.01）。结论Hsa-let-7g在合并高同型半胱氨酸血症的甲基丙二酸血症患者血清中呈现高表达,治疗后表达水平明显下降。第二部分Hsa-let-7g与靶基因关系的验证目的对hsa-let-7g的可能靶基因进行预测并对两者关系进行验证。方法1过Ensemble Genome Brower database对hsa-let-7g的基因序列进行查找,并通过分子生物学方法对hsa-let-7g在MMA中的可能靶基因进行预测2基于预测结果,将与hsa-let-7g勺seed区域相结合的MMACHC 3’UTR作用位点及作用位点碱基突变的片段克隆到psiCHECK2质粒上,构建了含hsa-let-7g作用位点的MMACHC 3’UTR荧光素酶报告系统载体,并同时构建了其作用位点突变的载体MMACHC-3’-UTR-MUT作为阴性对照。应用psi-CHECK2载体进行转染细胞,通过对psicHECK2载体所表达的荧光素酶的活性进行检测。结果1.甲基丙二酸血症cb1C亚型致病基因MMACHC是hsa-let-7g的可能靶基因。2.成功构建含有3’UTR MMACHC勺荧光素酶报告载体系统。mir组与空白组相比较,*P<0.05,mir组与NC组相比,*P<0.05, hsa-let-7g能通过结合MMACHC基因3‘UTR影响其荧光活性改变。 hsa-let-7g inhibitor组与空白组相比产，**P<0.01,hsa-let-7g inhibitor组与NC inhibitor组相比,*P<0.05,hsa-let-7g inhibitor能封闭hsa-let-7g抑制其与MMACHC基因3’UTR结合,从而影响萤光素酶的活性。3.成功构建含有mut3’UTR MMACHC勺荧光素酶报告载体系统。mir组与空白组和NC组相比较,P>0.05,无统计学显着。hsa-let-7g不能通过结合mut3’UTR MMACHC基因3‘UTR影响其荧光活性改变,结合位点突变完全。结论MMACHC基因是Hsa-let-7g勺可能靶基因。第三部分hsa-l et-7g对MACHC表达趋势的影响目的在前两部分研究的基础上,研究hsa-let-7g对MMACHC基因的表达趋势的影响。方法在人胚胎肾细胞293T中,分别转染hsa-let-7g及Hsa-let-7g inhibitor并进行细胞培养。应用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Q-PCR）对MMACHC基因对应RNA及hsa-let-7g表达水平分别进行检测。应用Western Blotting研究技术检测细胞中MMACHC蛋白质组分的表达水平。结果1.与对照组相比, hsa-let-7g mimics转染组细胞中MMACHCmRNA表达水平明显下调（p<0.05）；hsa-let-7g inhibitor转染组MMACHCmRNA表达水平明显上调（p<0.05）。2.转染hsa-let-7g mimics后48 h,与对照组mimics negative control相比较,实验组中hsa-let-7g的水平明显升高（p<0.05）。3.Western Blotting示人胚胎肾细胞293T中jAPDH（内参）的表达不受hsa-let-7g勺影响,MMACHC蛋白的表达受到hsa-let-7g的负向调节,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论Hsa-let-7g以MMACHC为靶基因,可负性调控MMACHC的RNA转录表达,负性调控MMACHC的蛋白表达。
杜陈陈[8]（2014）在《硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖分化的作用及其机制的研究》文中研究表明硫化氢是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。研究表明,硫化氢具有重要的生物学功能,参与体内多个病理生理过程的调节。在中枢神经系统,硫化氢发挥神经调质样作用,能够调节NMDA受体介导的神经传导,易化长时程增强效应形成。但是,硫化氢是否影响神经再生,这方面的研究报道较少。因此,本研究主要探讨硫化氢是否影响小鼠SVZ区神经干细胞的增殖与分化及其信号机制,为揭示硫化氢的神经生物学功能提供实验依据。目的:研究硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖及分化的影响,并探讨相关的分子机制。方法:（1）分离C57BL小鼠胚胎（E13-14）SVZ区神经干细胞进行体外培养,悬浮培养的神经球传代贴壁培养2次后用于实验;干细胞表面标记物nestin及Sox2免疫荧光共染鉴定神经干细胞。（2）免疫荧光结合western blot及反转录PCR的方法鉴定胚胎神经干细胞内硫化氢内源性合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine β-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase,CSE）的表达,Q-PCR 测定 CBS 与CSE mRNA的相对含量;免疫荧光方法鉴定成年C57BL小鼠SVZ区及胎鼠E14脑组织切片中CBS、CSE及nestin的表达;（3）神经球计数法检测硫化氢供体（NaHS及缓释剂GYY4137）作用后神经干细胞的自我更新;Brdu免疫荧光染色法检测神经干细胞的增殖;免疫荧光方法标记神经元标记物Tuj-1与星形胶质细胞标记物GFAP,检测硫化氢供体作用后神经干细胞的分化;MTT方法检测神经干细胞的存活率;Caspase-3免疫荧光染色检测神经干细胞凋亡;反转录PCR检测胶质源性神经营养因子mRNA水平的影响;采用western blot测定CREB的磷酸化水平。结果:（1）免疫荧光方法标记约99%的体外培养细胞表达干细胞表面标记物nestin及Sox2,说明成功分离培养纯度较高的胚胎神经干细胞,可以用于本研究。（2）免疫荧光法检测显示,在成年C57BL小鼠SVZ区、胎鼠E14脑组织切片及体外培养的神经干细胞内CBS均有较高含量的表达,RT-PCR及western blot进一步验证了 CBS的表达;免疫荧光方法、PCR及western blot检测到胎鼠E14脑组织切片及体外培养的神经干细胞内CSE的表达,但在成年的C57BL小鼠SVZ区未检测到CSE的阳性表达;Q-PCR法提示体外培养的神经干细胞内CBS mRNA水平约是CSE的3倍。（3）神经球计数法及Brdu免疫荧光染色显示硫化氢供体可促进体外培养的神经干细胞的增殖。在体实验也表明硫化氢供体NaHS在一定剂量范围内,呈剂量依赖性地促进SVZ区神经干细胞增殖。体外分化实验显示硫化氢可促进神经干细胞向神经元的分化。MTT法显示,硫化氢供体NaHS对细胞活力没有影响。Caspase-3免疫荧光染色表明,外源性硫化氢不影响神经干细胞凋亡。此外,NaHS呈浓度依赖性的升高星形胶质细胞中胶质源性神经营养因子mRNA的表达。Western blot显示NaHS不改变神经干细胞内CREB的磷酸化水平。结论:外源性硫化氢可促进胚胎和成年小鼠SVZ区神经干细胞的增殖,同时促进神经干细胞向神经元分化,而不影响细胞凋亡;硫化氢促进神经干细胞增殖可能与其升高胶质源性神经营养因子的表达有关。
林宁宁[9]（2014）在《基于DNA甲基化途径同型半胱氨酸对大鼠神经干细胞增殖作用机制的研究》文中认为目的研究同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）对体外培养神经干细胞（neural stem cells, NSCs）增殖作用的影响,以及通过建立大脑中动脉栓塞（middle cerebral artrty occlusion, MCAO）模型,观察Hcy对局灶性脑缺血损伤大鼠神经干细胞增殖的作用,探讨Hcy基于DNA甲基化途径调控NSCs增殖的作用机制。方法采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs,将细胞随机分成4组：正常对照组（培养液中添加Hcy0μmol/l, Hcy-C组）、Hey低剂量组（培养液中添加Hey30μmol/l, Hcy-L组）、Hcy中剂量组（培养液中添加Hey300μmol/l, Hcy-M组）、Hcy高剂量组（培养液中添加Hey1mmol/l,Hcy-H组,）。采用Cell Dimension软件对神经球直径进行测量；采用免疫荧光（Immunofluorescent, IF）检测NSCs标记物Brdu和Sox2的表达：采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）测定试剂盒检测不同浓度Hcy作用下培养液中LDH的活力；采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同Hcy浓度下细胞总甲基化水平；采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性以及Western Blot检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）的蛋白表达；采用高效液相法（HPLC）检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸（s-adenosylmethionine, SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine, SAH）的水平。成年雄性SD（sprague-nawley）大鼠随机分假手术组（sham operation group, SO组）、大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion group, MCAO组）以及大脑中动脉栓塞模型+同型半胱氨酸（middle cerebral artery occlusion+Hcy group, MCAO+Hcy组）3组。SO组和MCAO组腹腔注射生理盐水5ml/kg·bw·d, MCAO+Hcy组腹腔注射2%Hcy溶液5ml/kg·bw·d,注射28d。通过Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力；采用免疫组化法以及Western blot检测Sox2蛋白的表达；采用DNA甲基化定量试剂盒检测总甲基化水平；采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性；采用Western Blot检测DNA甲基转移酶的蛋白表达。采用高效液相法（HPLC）检测大鼠血浆内Hey、SAM、SAH的水平。结果用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs6d后,细胞聚集成球形团块,呈悬浮状态,Hcy添加组细胞神经球直径较对照组小,且差异均有统计学意义（P<0.05）。Brdu和Sox2经免疫荧光双标记法鉴定均呈双阳性表达,Hcy添加组Brdu/Sox2双标阳性率较对照组小,且差异均有统计学意义（P<0.05）。经LDH测定试剂盒检测,Hcy添加组细胞培养液中LDH活性较对照组升高,且差异均有统计学意义（P<0.05）。DNA总甲基化水平检测结果显示：与对照组相比,Hey添加组细胞总甲基化水平降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。DNMTs总活性检测结果显示：与对照组相比,Hcy添加组较对照组DNMTs总活性均下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示,与对照组相比,Hcy添加组DNMT1蛋白表达均下降,差异均有统计学意义（P<0.05）,Hcy-H组较Hcy-L组和Hcy-M组DNMT1蛋白表达下降,差异均有统计学意义（P<0.05）；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3a蛋白表达均下降,差异均有统计学意义（P<0.05）；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3b蛋白表达均下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。HPLC检测结果显示：与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组SAH的水平升高,差异均有统计学意义（P<0.05）；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组SAM/SAH比值降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。腹腔注射及造模成功后Morris水迷宫实验显示,与MCAO组相比,MCAO+Hcy组大鼠逃避潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义（P<0.05）；与MCAO组相比,及MCAO+Hcy组单位时间内穿越平台区域次数明显减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。DNA,总甲基化水平检测结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组总甲基化水平下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。经免疫组化及Western blot检测：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。DNMTs,总活性检测结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低DNMTs活性下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组DNMT1、 DNMT3a蛋白表达降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。经HPLC检测显示,与SO组及MCAO组相比,MCAO+Hcy组Hcy浓度下降,差异均有统计学意义（P<0.05）；与SO组及MCAO组相比,MCAO+Hcy组SAM/SAH比值下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,Sox2呈阳性表达,且MCAO+Hcy组表达较SO组及MCAO组降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论本实验成功的分离培养大鼠新生鼠NSCs以及建立大鼠大脑中动脉栓塞模型。Hcy抑制NSCs的增殖其机制可能是：Hcy通过改变甲基化途径中关键代谢物SAH的浓度,降低SAM/SAH的比值,同时降低甲基化转移酶的活性及蛋白的表达,抑制了甲基化反应的发生,进而抑制了NSCs的增殖。
闫海[10]（2012）在《同型半胱氨酸对神经干细胞增殖的蛋白组学研究》文中提出目的通过体外培养胚胎期SD大鼠神经干细胞（neural stem cells, NSCs）,添加同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）进行干预,观察Hcy对神经干细胞增殖能力的影响,并进一步观察其增殖期蛋白表达谱的变化,探讨Hcy对神经干细胞增殖影响的机制；建立HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。方法采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎期大鼠NSCs,将NSCs分为四组：①正常对照组（normal control group）培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为0μg/mL;②叶酸缺乏组（Folic acid-D group）培养基中叶酸含量为0.65μg/mL,同型半胱氨酸含量为0μg/mL;③同型半胱氨酸中度增高组（Hey-medium group）培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为100μg/mL;④同型半胱氨酸高度增高组（Hcy-high group）培养基中叶酸含量为4μg/mL,同型半胱氨酸含量为300μg/mLc采用MTT法检测神经干细胞增殖能力,绘制生长曲线；计数神经球的数量及直径以检测神经球的结球能力；采用台盼蓝染色法检测神经干细胞活力；培养6天后收集增殖期细胞,提取细胞蛋白,进行双向电泳,经考马斯亮蓝染色后使用PD-Quest软件比对蛋白差异点,将筛选出的蛋白点进行质谱鉴定。采用Real-time PCR法检测经质谱鉴定蛋白mRNA表达水平。采用试剂盒检测神经干细胞内ATP含量、SOD活力、MDA水平、ROS含量；测定神经干细胞线粒体呼吸链酶复合物NADH-Q还原酶（CⅠ）、琥珀酸-Q还原酶（CⅡ）、细胞色素还原酶（CⅢ）及细胞色素氧化酶（CⅣ）的活性。采用HuSH shRNA Plasmid为载体建立RNA干扰技术体系。结果添加Hcy后,NSCs增殖水平受到抑制。MTT结果显示,添加Hcy后各时间点细胞活力较正常对照组有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在Hcy添加组,神经球直径明显减少,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；但神经球数目各组间差异不明显（P>0.05）。将神经球裂解后,计数神经干细胞数目发现,在两组Hcy添加组,细胞数目较对照组有所减少,且呈浓度依赖性趋势（P<0.05）。经台盼蓝染色,发现各组间神经干细胞活力差异不明显（P>0.05）。蛋白质组学结果显示,添加Hcy后神经干细胞增殖期蛋白表达谱发生了明显变化；我们从差异蛋白中挑选出7种蛋白进行质谱鉴定,成功鉴定6种蛋白；其中细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶为线粒体呼吸链和三羧酸循环涉及蛋白,提示Hcy可能是通过影响线粒体的功能而降低神经干细胞增殖的。Real-time PCR结果显示,细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶mRNA水平同样被Hcy抑制。采用试剂盒检测ATP含量发现Hcy降低了神经干细胞的能量合成（P<0.05）；降低了SOD活性（P<0.05）,升高了MDA和ROS水平（P<0.05）；且线粒体呼吸链复合酶Ⅰ～Ⅳ的活性均受到不同程度的抑制（P<0.05）。成功建立经HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。结论本实验成功分离、培养了体外胚胎期SD大鼠NSCs,研究结果显示同型半胱氨酸可以抑制NSCs的增殖,降低神经球的结球能力,影响NSCs增殖期蛋白表达谱的水平；在mRNA和蛋白水平均降低细胞色素b-c1复合体-亚基2和乌头酸水合酶的表达；减少细胞内ATP的含量,增加活性氧自由基生成,降低其抗氧化能力,降低线粒体呼吸链复合酶Ⅰ～Ⅳ的活性。建立经HuSH shRNA Plasmid介导的RNA干扰技术体系。
二、同型半胱氨酸对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、同型半胱氨酸对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响（论文提纲范文）
（1）孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、孕期叶酸对子代大鼠神经行为发育及学习记忆能力的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 孕期叶酸对受孕率和产前体重的影响 |
| 1.2.2 孕期叶酸摄入对母鼠孕期血清叶酸水平的影响 |
| 1.2.3 孕期叶酸对子代大鼠神经行为发育的作用 |
| 1.2.4 孕期叶酸对子代大鼠空间学习记忆能力的影响 |
| 1.2.5 孕期叶酸对子代大鼠脑海马区超微结构的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 孕期叶酸干预的剂量选择 |
| 1.3.2 孕期补充叶酸促进子代大鼠幼年神经发育 |
| 1.3.3 孕期补充叶酸对提高子代大鼠学习记忆能力具有长期效应 |
| 1.3.4 孕期全程比围孕期补充叶酸更利于提高子代的神经行为表现 |
| 1.4 小结 |
| 二、孕期叶酸对子代新生大鼠脑海马神经干细胞增殖分化及皮层突触的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 孕期叶酸对子代新生鼠脑海马区神经元数量及NSCs增殖的影响 |
| 2.2.2 体外培养新生鼠脑海马区NSCs的鉴定 |
| 2.2.3 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs细胞活力的影响 |
| 2.2.4 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs增殖潜力的影响 |
| 2.2.5 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs神经元分化潜力的影响 |
| 2.2.6 孕期叶酸对新生鼠脑皮层神经元数量及BDNF、SYP表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 孕期补充叶酸通过提高新生鼠海马区NSCs增殖及神经元分化潜力促进海马神经发育 |
| 2.3.2 孕期补充叶酸促进新生鼠皮层突触发育 |
| 2.3.3 孕期全程比围孕期补充叶酸更利于新生鼠脑海马区神经发育 |
| 2.4 小结 |
| 三、孕期叶酸对雄性子代大鼠神经发育及学习记忆能力相关通路甲基化的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 分析研究过程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 孕期叶酸对雄性子代新生大鼠脑组织DNA甲基化谱的影响 |
| 3.2.2 孕期叶酸对雄性子代神经发育及学习记忆相关基因甲基化的作用 |
| 3.2.3 孕期叶酸对雄性子代神经发育相关通路甲基化的作用 |
| 3.2.4 孕期叶酸对雄性子代学习记忆能力相关通路甲基化的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 孕期叶酸改变雄性子代新生大鼠脑组织DNA甲基化谱 |
| 3.3.2 孕期叶酸通过DNA甲基化影响子代神经发育的潜在机制 |
| 3.3.3 孕期叶酸通过DNA甲基化影响子代学习记忆能力的潜在机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 DNA甲基化调控神经发育的研究进展及叶酸的潜在作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）S-腺苷同型半胱氨酸代谢检测方法及与脑卒中发病相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 S-腺苷同型半胱氨酸及其代谢产物与缺血性脑卒中发病的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 尿液中S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸检测新方法建立运用及其固相萃取机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 S-腺苷同型半胱氨酸在缺血性脑卒中发病中的凋亡相关分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 同型半胱氨酸代谢与心脑血管疾病关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸检测方法及其在生物样本中运用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HTRA2/OMI沉默在PD细胞模型中对DA神经元凋亡的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 细胞实验方法 |
| 1.3 HtrA2/Omi基因沉默实验 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HTRA2/OMI功能抑制在PD模型中对DA神经元凋亡的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 实验条件 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 WNT信号通路功能改变与PD模型细胞凋亡的相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 实验条件 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :miR-322 通过沉默NOX4 减少细胞凋亡治疗神经管畸形 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠NTDs模型制备及组织样本收集 |
| 2.2.2 体外全胚胎培养 |
| 2.2.3 细胞复苏、培养和传代 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 RNA pull down实验 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.7 TUNEL实验 |
| 2.2.8 细胞、组织中总RNA和 microRNA提取 |
| 2.2.9 RNA定量、逆转录及实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 蛋白质提取、定量及Western Blot实验 |
| 2.2.11 组织切片制备、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫组化和免疫荧光染色 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在ATRA诱导NTDs模型中mi R-322和NOX4 表达改变 |
| 3.2 NOX4是miR-322 新的靶基因且可以与miR-322 相互作用 |
| 3.3 miR-322 抑制NOX4 的翻译 |
| 3.4 miR-322 减少NOX4 诱导产生的细胞凋亡 |
| 3.5 体外miR-322 治疗可减少NTDs胚胎中的细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :PCSK9 在大鼠NTDs中的表达规律及抑制PCSK9 增加NTDs发生风险的机制探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠NTDs模型制备及组织样本收集 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养和传代 |
| 2.2.3 组织总RNA提取 |
| 2.2.4 RNA定量、逆转录及实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 蛋白质提取、定量及Western Blot实验 |
| 2.2.6 SBC115076与ATRA联用对大鼠NTDs发生率的影响实验 |
| 2.2.7 PCSK9~(-/-)鼠与ATRA联用对 NTDs 发生率的影响实验 |
| 2.2.8 血药浓度测定 |
| 2.2.9 脂质组学分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCSK9在NTDs大鼠胚胎发育过程中低表达 |
| 3.2 抑制PCSK9 表达可增加大鼠胚胎对ATRA的致畸敏感性 |
| 3.3 抑制PCSK9 可增加神经干细胞和NTDs胚胎组织的细胞凋亡 |
| 3.4 孕鼠血清及胎鼠脊髓组织脂质代谢分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）母鼠日粮添加甜菜碱对大鼠肝脏IGF2表达的继代影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 IGF2的生物学功能及作用机制 |
| 1 IGF2蛋白的结构与功能 |
| 2 IGF2的分布 |
| 3 IGF2作用的信号通路 |
| 第二章 IGF2转录调控及机制 |
| 1 IGF2启动子结构 |
| 2 甲基化印记调控IGF2转录 |
| 3 母体影响子代IGF2 DNA甲基化的研究 |
| 第三章 甜菜碱调控基因表达的研究进展 |
| 1 甜菜碱结构与功能概述 |
| 2 甜菜碱对糖脂代谢基因表达的调控及其机制 |
| 3 甜菜碱对生长和细胞增殖的调控及其机制 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 母鼠日粮添加甜菜碱对F1代断奶仔鼠肝脏IGF2表达的影响及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 母鼠日粮添加甜菜碱对F1代成年子鼠肝脏IGF2表达的影响及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 祖代母鼠日粮添加甜菜碱对F2代断奶仔鼠肝脏IGF2表达的影响及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第七章 甜菜碱对HepG2细胞IGF2基因表达的继代影响及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 总体讨论 |
| 1 母鼠日粮添加甜菜碱影响F1代断奶和成年时生长和肝脏IGF2基因表达的机制 |
| 2 母鼠日粮添加甜菜碱影响F2代断奶时生长和肝脏IGF2基因表达的机制 |
| 3 甜菜碱影响HepG2细胞增殖和IGF2基因表达的机制 |
| 4 尚待解决的问题和今后的研究方向 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
（6）基于iTRAQ蛋白质组RNA剪接相关蛋白HNRNPs低表达对神经管缺陷的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写的论文 |
（7）Hsa-let-7g对甲基丙二酸血症中MMACHC影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 中英文缩略语一览表 前言 第一部分 |
| HSA-LET-7G在甲基丙二酸血症患者血浆的表达特征 1 |
| 实验材料 2 |
| 研究对象 3 |
| 试验方法 4 |
| 实验结果 5 |
| 讨论 6 |
| 结论 第二部分 |
| HSA-LET-7G与靶基因关系的验证 1 |
| 实验材料 2 |
| 试验方法 3 |
| 实验结果 4 |
| 讨论 5 |
| 结论 第三部分 |
| HSA-LET-7G对MMACHC表达趋势的影响 1 |
| 实验材料 2 |
| 试验方法 3 |
| 实验结果 4 |
| 讨论 5 |
| 结论 参考文献 综述一 |
| 甲基丙二酸血症的诊治研究进展 参考文献 综述二 |
| LET7家族研究进展 参考文献 个人简介 致谢 |
（8）硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖分化的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胚胎神经干细胞的培养及硫化氢合成酶的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖分化的作用及机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 硫化氢与帕金森病的研究新思路 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 攻读学位期间发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（9）基于DNA甲基化途径同型半胱氨酸对大鼠神经干细胞增殖作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、同型半胱氨酸对体外NSCs增殖的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 神经干细胞培养及神经球直径测量 |
| 1.2.2 Hcy对NSCs的Brdu+Sox2双标阳性率的影响 |
| 1.2.3 Hcy对LDH活性的影响 |
| 1.2.4 Hcy对细胞总甲基化水平的影响 |
| 1.2.5 Hcy对总DNMTs活性影响 |
| 1.2.6 Hcy对DNMTs蛋白表达的影响 |
| 1.2.7 Hcy对细胞内SAM、SAH水平的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 神经干细胞的培养及鉴定 |
| 1.3.2 Hcy对神经毒性的影响 |
| 1.3.3 Hcy对神经干细胞增殖的影响 |
| 1.3.4 Hcy对DNMTs活性和表达的影响 |
| 1.4 小结 |
| 二、Hcy对MCAO大鼠神经干细胞增殖的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠中动脉栓塞模型 |
| 2.2.1.1 大鼠中动脉栓塞模型情况 |
| 2.2.1.2 造模成功体征 |
| 2.2.2 Hey对大鼠认知功能的影响 |
| 2.2.2.1 Hey对大鼠定向航行的影响 |
| 2.2.2.2 Hey对大鼠空间探索的影响 |
| 2.2.3 Hey对各组大鼠大脑Sox2蛋白表达的影响 |
| 2.2.4 Hcy对各组大鼠总甲基化的影响 |
| 2.2.5 Hcy对各组大鼠DNMTs的影响 |
| 2.2.5.1 Hey对各组大鼠DNMTs活性的影响 |
| 2.2.5.2 Hcy对DNMTs蛋白表达的影响 |
| 2.2.6 Hcy对大鼠血浆中SAM、SAH水平的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 大鼠中动脉栓塞模型的选择 |
| 2.3.2 Hey对脑缺血大鼠认知功能的影响 |
| 2.3.3 Hcy对脑缺血大鼠大脑内Sox2蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 Hcy对脑缺血大鼠大脑DNA甲基化的影响 |
| 2.3.5 Hey对脑缺血大鼠大脑SAM、SAH的影响 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 NSCs增殖影响因素及调控机制的研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）同型半胱氨酸对神经干细胞增殖的蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、同型半胱氨酸对神经干细胞增殖期蛋白表达谱的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 神经干细胞形态学观察、鉴定 |
| 1.2.2 神经球形成数目及神经球直径结果 |
| 1.2.3 神经干细胞活力结果 |
| 1.2.4 MTT测定神经干细胞增殖不同时间OD值 |
| 1.2.5 神经干细胞增殖期蛋白表达谱的差异 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 Hcy对神经干细胞增殖的影响 |
| 1.3.2 神经干细胞增殖期蛋白质组学技术体系的建立 |
| 1.3.3 Hcy对神经干细胞增殖期蛋白表达谱的影响 |
| 1.4 小结 |
| 二、同型半胱氨酸对神经干细胞增殖抑制的相关机制探讨 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 神经干细胞蛋白表达谱相关差异蛋白鉴定 |
| 2.2.2 Hcy对神经干细胞ATP含量的影响 |
| 2.2.3 Hcy对神经干细胞超氧化物歧化酶活力的影响 |
| 2.2.4 Hcy对神经干细胞丙二醛的影响 |
| 2.2.5 Hcy对神经干细胞ROS水平的影响 |
| 2.2.6 Hcy对神经干细胞线粒体呼吸链酶复合物活性的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞色素b-c_1复合体-亚基2、乌头酸水合酶与线粒体 |
| 2.3.2 同型半胱氨酸对神经干细胞线粒体功能的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、逆转录病毒介导的RNA干扰技术体系的建立 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 靶细胞MTHFR、CBS mRNA水平 |
| 3.2.2 靶细胞MTHFR、CBS蛋白表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 亚甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚-β合成酶与Hcy代谢 |
| 3.3.2 逆转录病毒介导体系的特点 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 神经干细胞分化调控机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、同型半胱氨酸对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响（论文参考文献）
- [1]孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究[D]. 王心妍. 天津医科大学, 2020(06)
- [2]S-腺苷同型半胱氨酸代谢检测方法及与脑卒中发病相关性研究[D]. 翟一静. 河北医科大学, 2020(01)
- [3]HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究[D]. 李艳霞. 新疆医科大学, 2020(07)
- [4]神经管畸形动物模型中凋亡调控因子（miR-322、PCSK9）的表达规律及作用机制的研究[D]. 刘玉思. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]母鼠日粮添加甜菜碱对大鼠肝脏IGF2表达的继代影响及机制[D]. 杨树. 南京农业大学, 2018(02)
- [6]基于iTRAQ蛋白质组RNA剪接相关蛋白HNRNPs低表达对神经管缺陷的影响[D]. 李丹. 潍坊医学院, 2018(04)
- [7]Hsa-let-7g对甲基丙二酸血症中MMACHC影响的研究[D]. 王天舒. 郑州大学, 2016(01)
- [8]硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖分化的作用及其机制的研究[D]. 杜陈陈. 苏州大学, 2014(05)
- [9]基于DNA甲基化途径同型半胱氨酸对大鼠神经干细胞增殖作用机制的研究[D]. 林宁宁. 天津医科大学, 2014(01)
- [10]同型半胱氨酸对神经干细胞增殖的蛋白组学研究[D]. 闫海. 天津医科大学, 2012(12)