一、黄瓜花叶病毒反义2b基因构建及其转基因初步研究（论文文献综述）
张雅雯[1]（2021）在《基于黄瓜花叶病毒构建双联和三联弱毒疫苗的研究》文中提出病毒病是危害植物的主要病害之一,能够造成巨大的经济损失。随着基因工程和生物技术的发展,病毒交叉保护方面的研究更加深入,为植物病毒病的防治提供了有效途径。黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员,是目前已知的寄主种类最多、分布范围最广的植物病毒之一,其三分体基因组特性,为容纳更多的异源病毒片段提供可能,因此利用CMV开发多联弱毒疫苗具有极大的潜力。本研究以实验室构建的CMV RNA2弱毒突变体为基础,插入不同类型的异源病毒片段,筛选出遗传稳定、对靶标病毒具有交叉保护作用的双联和三联弱毒疫苗;以及探索性改造RNA3,为优化疫苗开发载体奠定基础。在CMVFny RNA2的2b蛋白提前终止型突变体p CCFR2-2b PTII基础上,分别插入不同病毒片段的保守序列,构建了3种类型（CMV/TMV、CMV/TCV、CMV/TSWV）的18个双联弱毒突变体以及3种类型（CMV/TMV/PVX、CMV/TMV/PVY、CMV/TMV/TVBMV）的3个三联弱毒突变体。将不同的双联、三联弱毒突变体与CMVFny野生型RNA1和RNA3混合,分别接种本生烟,均不引起病毒病症状,14天后检测系统叶片,突变位点均稳定存在,说明弱毒突变体具备遗传稳定性。在双联弱毒突变体交叉保护实验中,预先接种突变体p CCFR2-2b PTII-TM2079II、p CCFR2-2b PTII-TM2158、p CCFR2-2b PTII-TM4059、p CCFR2-2b PTII-TM5088、p CCFR2-2b PTII-TM5738对TMV均有较好的防治效果;预先接种p CCFR2-2b PTII-TC105、p CCFR2-2b PTII-TC1261、p CCFR2-2b PTII-TC3135对TCV均有明显的防治效果。在三联弱毒突变体交叉保护实验中,预先接种突变体p CCFR2-2b PTII-T100X100I对CMV/TMV/PVX的交叉保护效果明显;预先接种突变体p CCFR2-2b PTII-T100T100I对CMV/TMV/TVBMV交叉保护效果较弱;预先接种突变体p CCFR2-2b PTII-T100Y100I对CMV/TMV/PVY没有交叉保护效果。在CMVFny RNA3的基础上,构建了2种CP蛋白突变体、1种基因间隔区（IGR）部分缺失型突变体以及1种蚜传位点突变体。CP蛋白突变体和IGR部分缺失型突变体接种后出现突变回复成野生型的现象,不符合弱毒疫苗的遗传稳定的基本要求。蚜传位点突变体p CCFR3-YCYF与野生型RNA1和RNA2混合接种植物后,能够正常侵染发病并且蚜传位点的突变稳定存在,具备与RNA2弱毒疫苗混合使用的潜力。本研究基于CMV创制了二联、三联弱毒疫苗,以及蚜传位点突变体,为植物病毒病尤其是烟草病毒病的防治提供了材料和数据支持。
刘珊珊[2]（2021）在《黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究》文中研究表明植物病毒病是第二大类植物病害,对世界范围内绝大部分作物均造成不同程度的危害。植物病毒病的防治是研究热点及难点,应用弱毒疫苗的交叉保护策略是预防植物病毒病比较有效的方法。但疫苗存在寄主范围窄、靶标病毒谱窄、疫苗遗传稳定性差等限制因素。其中疫苗稳定性差与突变修复有关,突变修复可以通过RNA重组等机制实现,但对修复机制的触发因素的研究不深入。黄瓜花叶病毒（CMV）是目前已知的寄主最多、分布最广、最具经济危害的植物病毒之一,以CMV作为基础病毒载体的弱毒疫苗,具有潜在的广寄主特性;CMV基因组含有3条正义单链RNA（RNA1、RNA2和RNA3）,共编码5个蛋白（1a、2a、2b、MP、CP）,多节段基因组为致弱突变的位点选择、外源片段插入提供了多种选择,具备研制多联弱毒疫苗的良好潜力。本研究旨在构建基于CMV的弱毒疫苗的基础载体,并结合疫苗载体研制中的突变修复现象,解析突变修复的触发因素和发生时机,为弱毒疫苗的研制与应用提供数据支持。主要结果如下:以CMV RNA2中的基因沉默抑制因子2b蛋白为突变对象,构建得到2种类型的2b翻译提前终止突变体R2-2bPTI和R2-2bPTⅡ。接种实验发现R2-2bPTⅠ仍为强毒,而R2-2bPTⅡ为弱毒突变体。以R2-2bPTⅡ为基础载体构建外源片段插入型突变体R2-2bPTⅡ-P200,R2-2bPTⅡ与R2-2bPTⅡ-P200提前接种5天对后续接种的CMV强毒有交叉保护效果;将2种弱毒突变体侵染的植株连续接种10代,突变能稳定存在,说明弱毒突变体具备遗传稳定性;因此R2-2bPTⅡ既可作为弱毒疫苗预防CMV,也可作为基础载体插入异源病毒片段构建多联弱毒疫苗。不同长度的外源片段插入实验表明,R2-2bPTⅡ插入100 nt外源片段即可引发基因沉默,插入200 nt以上的外源片段则易发生突变回复。因此,以R2-2bPTⅡ作为基础载体,具备开发三价弱毒疫苗的潜力。为进一步提升基础载体容纳外源片段的能力,构建弱毒突变体R2-2bPTⅢ;R2-2bPTⅢ及其片段插入型突变体R2-2bPTⅢ-P200的预先接种均可对后续接种的CMV强毒具有交叉保护效果;不同长度的外源片段插入实验表明,R2-2bPTⅢ至少可以容纳350 nt外源片段并具备遗传稳定性;因此以R2-2bPTⅢ作为基础载体,具备开发四价弱毒疫苗的潜力。为进一步挖掘CMV基因组中致弱位点以及外源片段的插入位点,针对病毒编码的蛋白和部分顺式作用元件进行突变分析。以CMV RNA3的MP编码框的3’端100 nt、CP编码框的5’端100 nt以及完整的基因间隔区（IGR）作为突变区域,构建缺失型突变体R3-m1、R3-m2、R3-m3、R3-m4和外源长片段替换型突变体R3-m1-P300、R3-m2-P400、R3-m3-P400、R3-m4-P400,8种突变体均不能系统侵染植株,不符合弱毒疫苗系统侵染的基本要求。CMV RNA1与CMV RNA3的3’UTR突变体R1-3Um、R3-3Um接种植物后突变稳定存在,且保持较强的致病力;以R1-3Um和R3-3Um为基础载体的外源片段插入型突变体R1-3Um-P200和R3-3Um-P200,侵染植株后突变位点均被修复为野生型,不符合弱毒疫苗的遗传稳定性的基本要求。针对CMV不同基因组节段的TLS元件关键位点进行突变,构建18 nt替换型突变体Tm1(R1-Tm1、R2-Tm1、R3-Tm1)与18nt插入型突变体Tm2(R1-Tm2、R2-Tm2、R3-Tm2),均有较强的致病力且部分突变体有突变修复现象;而以Tm1和Tm2为基础构建的外源片段插入型突变体Tm3(R1-Tm3、R2-Tm3、R3-Tm3)和Tm4(R1-Tm4、R2-Tm4、R3-Tm4),接种植株后突变位点均回复为野生型,不符合弱毒疫苗遗传稳定性的基本要求。为揭示突变修复的触发因素,以TLS突变体为对象进行深入研究。常规浓度(农杆菌OD600=1.2)接种时,RNA1、RNA2和RNA3的TLS突变体存在不同的修复率,RNA1中的TLS突变不能被修复,而RNA2与RNA3中的TLS突变R2-Tm1、R2-Tm2、R3-Tm1、R3-Tm2的修复率分别为50.0%、37.5%、80.0%、62.5%;RNA3中TLS突变修复率高于RNA2的同样类型TLS突变,RNA2或RNA3中Tm1比Tm2具有更高的突变修复率。将RNA1、RNA2和RNA3同类型的TLS突变体混合(R1-Tm1+R2-Tm1+R3-Tm1或R1-Tm2+R2-Tm2+R3-Tm2)接种植株,致病力减弱且所有TLS突变未出现突变修复现象,说明TLS的突变修复需要依赖于模板选择型RNA重组。RNA1、RNA2和RNA3的TLS突变对CMV致病力的影响不同,Northern blot分析发现TLS突变对相应的RNA合成的影响也存在明显差异。R1-Tm1和R1-Tm2不影响RNA1的相对合成量,R2-Tm1中造成RNA2的合成量极低,R2-Tm2造成RNA2的合成量相对减少,R3-Tm1和R3-Tm2造成RNA3及其亚基因组RNA4的尺寸明显变大。说明TLS突变引起RNA2相对合成量减少的数量缺陷和RNA3尺寸变大的质量缺陷是引发突变修复的因素之一。进一步研究表明,RNA1的TLS突变在特定条件下也可以被修复。RNA1 TLS突变体与RNA2弱毒突变体R2-2bPTⅡ混合侵染植株时,RNA1中TLS突变修复率为100%,而RNA3 TLS突变与R2-2bPTⅡ混合侵染植株时,TLS突变修复率也提高到100%。说明,基因沉默抑制因子2b的突变导致基因组整体积累速率变慢,基因组整体数量缺陷是触发突变修复的关键信号。RNA1TLS突变体的梯度稀释接种实验表明,在病毒稀释限点附近也能引发TLS突变修复,说明特定的初始基因组低浓度可以引发TLS突变修复。综上所述,突变修复的引发因素可归纳为突变导致的基因组部分节段的数量、质量缺陷和基因组整体数量缺陷。将RNA2TLS突变体与细胞间运动缺陷型突变体M5混合接种,发现TLS突变修复不发生,说明TLS突变的修复需要细胞间运动。本论文研究,一方面为广寄主多联弱毒疫苗开发构建了多个基础载体;另一方面解析了突变修复的多层次触发因素和突变修复对细胞间运动的需要,为病毒进化研究和弱毒疫苗的研制与应用提供重要启示。
姜文筱[3]（2021）在《基于黄瓜花叶病毒的多联弱毒疫苗创制及接种方案优化》文中指出植物受到病毒系侵染后,会引发自身的免疫反应,可以免受同种病毒的其它株系侵染的现象称为交叉保护作用。利用弱病毒（弱毒疫苗）防治靶标强毒是目前防治植物病毒病的一种有效措施,但目前缺乏能够有效防治烟草病毒病的多联疫苗,也缺少一个能够在田间接种弱毒疫苗时具有高接种效率的接种体系。黄瓜花叶病毒（CMV）宿主广泛,为害严重,是弱毒疫苗基础病毒载体的一个理想选择。本研究是基于黄瓜花叶病毒创制不同类型的二价和三价弱毒疫苗,并进行接种方案和疫苗载体的优化。利用实验室已有的弱毒疫苗,进行喷雾接种方式、疫苗保质期、疫苗与肥料结合使用的三方面分析,对疫苗接种方案进行优化。农杆菌直接喷雾接种普通烟,接种成功率为12.5%,直接喷雾接种剪叶后普通烟,一次喷雾接种成功率为80%、两次喷雾接种成功率为100%,剪叶后1小时直接喷雾1次,接种成功率为100%,说明剪叶处理有利于疫苗接种。农杆菌加入金刚砂后喷雾接种未剪叶普通烟,接种成功率为93.3%,表明金刚砂的加入明显提升接种效率。普通烟叶片正面和背面分别进行喷雾接种成功率的差别不大。因此,合适的接种方式为农杆菌混合金刚砂,喷雾接种处于剪叶状态的普通烟叶片正面一次,加强接种一次。农杆菌菌体静置实验表明,常温静置3天以内,均可以成功接种本氏烟。疫苗与肥料混合实验表明,叶面肥的使用降低疫苗的防效,而生物有机肥、高钙钾镁肥的使用,则对疫苗的防效有加成作用。疫苗的田间接种建议方案如下:含有弱毒疫苗的农杆菌菌液混合金刚砂,在烟草剪叶处理后进行1到2次喷雾接种。所用农杆菌为新鲜制备3天内的菌液。接种疫苗后,可施用生物有机肥或高钙钾镁肥加强弱毒疫苗交叉保护的效果。在CMV的2b蛋白提前终止突变体pCCFR2-2b PTII的基础上,分别插入马铃薯X病毒（PVX）的不同区域100 bp、150 bp保守片段,获得4个PVX 100型插入突变体和4个PVX 150型插入突变体,这些突变体与野生型CMVFnyRNA1和CMVFnyRNA3混合接种本氏烟,结果显示:所有的PVX 100 bp、150bp保守片段插入型突变体的插入序列均稳定存在,且表现出弱致病症状,对CMV和PVX具备良好的交叉保护效果。同类型的两种、三种、四种疫苗的混合处理的交叉保护效果呈逐步上升趋势。以pCCFR2-2b PTII为基础载体分别插入马铃薯X病毒（PVX）/马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）/烟草脉带花叶病毒（TVBMV）、马铃薯Y病毒（PVY）/烟草脉带花叶病毒（TVBMV）三种组合,两种病毒各插入100 bp保守序列,获得3个三价弱毒突变体(pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989PY617-716、pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989TVB7600-7699和pCCFR2-2b PTII-PY617-716TVB7600-7699),这3个三价弱毒突变体分别与野生型CMVFnyRNA1和CMVFnyRNA3混合接种并测试对靶标病毒的防效,结果显示:三价弱毒突变体pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989PY617-716兼抗CMV和PVX,对PVY具有一定程度的预防效果;pCCFR2-2b PTII-PX5890-5989TVB7600-7699兼抗CMV和PVX,对TVBMV防效不好;pCCFR2-2b PTII-PY617-716TVB7600-7699可预防CMV,对PVY和TVBMV防效不好。RNA病毒的RdRp的低保真性会造成某些突变的回复,对于弱毒疫苗的创制不利。针对这个问题,进行CMVFnyRdRp改造,以期获得高保真性RdRp并分析对突变的修复作用。将CMVFnyRNA2在RdRP（2a）编码框的第636位赖氨酸分别突变成丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸和色氨酸,获得4个突变体(pCCFR2-2a-A636、pCCFR2-2a-D636、pCCFR2-2a-R636、pCCFR2-2a-W636),将RdRp突变体分别与野生型CMVFnyRNA1、突变型CMVFnyRNA3混合接种,结果显示:所有RdRp突变体不能改变突变体pCCFR3-ΔCP180F突变回复率（100%）;RdRp突变体pCCFR2-2a-A636、pCCFR2-2a-D636不能改变突变体pCCFR3-TLSm1突变回复率（100%）;RdRp突变体pCCFR2-2a-R636、pCCFR2-2a-W636可降低突变体RNA3-TLSm1的回复率（从87.5%到75%、50%）。说明,通过改造RdRp可以一定程度上降低某些突变体的突变修复率,即体现一定程度的RdRp保真性的提高。本研究为基于CMV的多联弱毒疫苗创制及应用提供了研究材料和数据支持,为田间弱毒疫苗的接种提供方法依据,为植物病毒病的防治提供新的研究思路和技术支持。
庞欢[4]（2021）在《卫星RNA对黄瓜花叶病毒弱毒疫苗交叉保护作用的效应》文中认为植物病毒病危害严重,会导致农作物产量降低,品质变劣,防治是难点。相比而言,交叉保护是防治植物病毒病比较有效的策略。预先接种弱毒疫苗,可以激发寄主植株产生免疫能力,达到植株发病减轻或不发病的目的。黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一,是正义单链三分体RNA病毒。有些CMV分离物株系中含有卫星RNA,它是一类非编码RNA,部分卫星RNA可以不同程度的影响辅助病毒的致病力。本论文研究卫星RNA对CMV弱毒疫苗的调节作用,为卫星RNA在交叉保护中的应用探索新的可行性途径。利用本实验室已克隆的两种CMV卫星RNA,sat CMV-TA-ca和sat CMV-TA-tb,分别研究两种卫星RNA对CMV强毒分离物(CMVFny)、CMV天然弱毒分离物(CMVTA-pe)、CMV人工弱毒突变体(CMVFny2-2b PT)、CMV异源病毒片段插入型突变体(CMVFny2-2b PT-TM5088)的致病力影响,以及卫星RNA与辅助病毒等比例或不同比例混合接种的交叉保护作用。首先构建适用于农杆菌浸润接种的分别含有2种卫星RNA全序列的双元质粒p CB-sat CMV-TA-ca和p CB-sat CMV-TA-tb,分别与含有CMVFny RNA1、RNA2和RNA3的质粒混合接种本氏烟,结果表明卫星RNA可实现在植物体内复制,降低CMVFny的致病力,从而建立了卫星RNA和辅助病毒的定量接种研究体系。不同类型CMV与卫星RNA等比例（等浓度）混合接种实验,得到如下结果:（1）强毒分离物CMVFny与卫星RNA混合接种,对后续接种的CMVFny表现一定程度的交叉保护作用,其中sat CMV-TA-tb比sat CMV-TA-ca的交叉保护效果更明显。（2）CMVTA-pe作为天然的弱毒分离物,侵染本氏烟仅造成轻度矮化。CMVTA-pe可交叉保护CMVFny,而且卫星RNA与CMVTA-pe混合接种后的交叉保护效果更明显。说明,卫星RNA对CMV天然弱毒分离物的交叉保护作用有提升作用。（3）CMVFny2-2b PT是CMVFnyRNA2的人工弱毒突变体,可以交叉保护防治CMVFny,且5 d攻强毒保护效果最佳。卫星RNA与CMVFny2-2b PT混合接种,加强了突变体的致病力,且CMVFny2-2b PT的交叉保护作用因卫星RNA的存在反而有所减弱。（4）CMVFny2-2b PT-TM5088是CMVFnyRNA2的异源病毒片段插入型弱毒突变体,体现对CMVFny较好的交叉保护效果,卫星RNA的存在没有明显改变其对CMVFny的交叉保护防治效果,但对其交叉保护CMV和TMV混合侵染有改善效果。弱毒突变体与卫星RNA不同比例（不同浓度）混合接种实验表明:（1）CMVFny2-2b PT与sat CMV-TA-ca 2:1和1:1混合接种时,交叉保护的效果更好。（2）CMVFny2-2b PT与sat CMV-TA-tb 1:1和1:2混合接种时,交叉保护效果明显。表明卫星RNA对CMV人工弱毒突变体交叉保护具有调控作用,正向调控作用和反向调控作用的发生取决于卫星RNA与弱毒疫苗的接种比例。本研究分析了卫星RNA对不同类型CMV弱毒疫苗的调节作用,为卫星RNA在交叉保护中的应用探索了新的可行性途径。
叶佳丽[5]（2021）在《小麦K-TCMS育性转换相关基因的鉴定及lncRNA MSTRG.224114调控其育性转换的功能解析》文中认为粮食安全,关乎国泰民安,始终是人类不可忽视的根本问题。小麦作为全球人类的主粮之一,至今仍难以突破杂种优势利用的重重难关,严重阻碍着杂交小麦大面积走向生产实践。因此,筛选影响小麦雄性育性的关键基因,借以创制构建优良的小麦雄性不育种质材料,对保障人类粮食安全具有重要的意义。本课题组选育的K型温敏细胞质雄性不育（Thermo-sensitive male sterile line with Aegilops kotschyi cytoplasm,K-TCMS）小麦材料KTM3315A,具有稳定的遗传特性,育性受温度调控,生产上可实现“一系两用”,被广泛的作为小麦雄性不育机理探究的理想材料。为了揭示影响小麦雄性育性的关键基因,本研究进行了三个育性相关基因家族的系统分析、KTM3315A花药的长链非编码RNA（lncRNA）测序、大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）介导的基因功能验证等试验,筛选到多个育性相关候选基因。进一步,结合互作mi RNA的预测和验证等试验,共同构建出一个多分子联合调控KTM3315A育性的机制模型。本研究所获得的主要结果如下:1.从小麦热激转录因子（Heat stress transcription factor,HSF）、多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase,PG）、蔗糖转化酶（Invertase,INV）基因家族中分别鉴定到61、113、130个成员。以进化关系和理化性质为依据,HSF家族被分为ABC三大类,PG家族被分为A-F六大类,INV基因家族被分为酸性INV（Acid invertase,AINV）和中碱性INV（Neutral/alkaline invertase,A/NINV）两大类。重复事件的分析证明,全基因组复制对于小麦HSF、PG、INV三个基因家族的扩张贡献最大。基因结构和保守氨基酸基序分析显示,每个基因家族内部不同大类间的成员具有多样性,但是各自亚类内成员相对保守。Ta Hsf被预测与HSP70、HSP90和HTPG三种主要的蛋白互作。Ta PG被预测主要参与水解作用和催化作用,且其启动子上具有响应多种激素和MYB转录因子的顺式作用元件。从表达模式上分析,这三个小麦基因家族都具有组织特异性,有7个Ta Hsf显示出穗特异性,21个和22个Ta PG分别在单核早期和三核期的穗中高表达,8个Ta AINV在生殖生长期穗部特异表达。最终,通过在KTM3315A的花药中验证,结合水稻和拟南芥同源基因的功能参考,本研究预测三个Ta Hsf A2基因可能受高温响应以调节HSP70的表达来影响小麦花药发育;Ta PG09、Ta PG54、Ta PG87、Ta PG93等四个基因可能参与小麦花粉粒的分离、花药的开裂、花粉管的生长和萌发等过程;Ta CWINV40、Ta CWINV46、Ta CWINV53可能通过影响绒毡层功能调控小麦雄性育性。2.对KTM3315A不育条件（AS）和可育条件（AF）下的单核期、二核期和三核期花药进行lncRNA测序,获得每个样品平均12.12 GB的质控后数据。通过与小麦参考基因组比对,共获得36,934个m RNAs和15,659个lncRNAs,其中包括基因间lncRNAs14,984个、正义lncRNA 135个、反义lncRNA 393个和内含子lncRNA 174个。与m RNA一样,不同发育时期和外界环境都会造成lncRNA的差异表达。三个时期AF和AS的差异表达lncRNA依次为848、887和662个,差异表达m RNA的个数依次为3,293、3,220和3,415。为了进一步获得lncRNA的功能,预测到1,705个lncRNA对应的2,068个cis靶基因,和7,253个lncRNA对应的18,090个trans靶基因。根据差异表达lncRNA靶基因的KEGG富集情况可以判断,单核期的差异表达lncRNA主要参与黄酮类、苯丙烷类、糖类等物质的生物合成途径,二核期的差异表达lncRNA主要涉及各种萜类、固醇和氨基酸的生物合成,而三核期的差异表达lncRNA主要与脂类和角质、蜡质等合成相关。此外,本研究获得了以育性相关候选基因Ta CWINV40、Ta CWINV46和Ta CWINV53为靶标的lncRNA MSTRG.224114。荧光定量PCR（q RT-PCR）结果证明,MSTRG.224114在根、茎、叶、籽粒和花药中的表达模式与其靶基因趋势一致。3.通过基因克隆,获得长度为1,755 bp的Ta CWINV53 CDS序列,和长度为256 bp的lncRNA MSTRG.224114已知序列。Ta CWINV53的CDS包含8个外显子,MSTRG.224114包含两个外显子,它们其中的一个外显子在小麦5D染色体上反向互补重叠。通过显色原位杂交技术发现,MSTRG.224114在KTM3315A可育花药前期的药壁、药隔和小孢子细胞核中都有表达,至三核期几乎消失不见。Ta CWINV53蛋白的亚细胞定位在细胞壁,且在花药特异表达。VIGS验证试验表明,Ta CWINV53和MSTRG.224114在KTM3315A的下调表达引发了花药和花粉粒的一系列雄性败育表型,并且导致了花药酸性蔗糖转化酶活性的下降。依据Ta CWINV53启动子和MSTRG.224114本体共有ERF转录因子（Traes CS5B01G565300）的结合位点,综合它们的结构和位置信息,推测MSTRG.224114可能在高温响应下通过招募ERF蛋白增强Ta CWINV53的表达水平来调节KTM3315A的育性。4.依据软件比对结果及已有研究基础,预测tae-mi R408与Ta CWINV53存在互作关系并参与KTM3315A育性调控。从KTM3315A花药中克隆获得长度为253 nt和256 nt的两种tae-mi R408前体序列,并分别命名其为tae-MIR408A和tae-MIR408C。VIGS功能验证表明,tae-mi R408的过表达株重复了Ta CWINV53和MSTRG.224114沉默株的败育表型,但是其过表达对Ta CWINV53和MSTRG.224114的表达水平影响极弱。相反,在Ta CWINV53和MSTRG.224114的沉默株中,tae-mi R408的表达量显着上调。烟草的GUS染色试验证明tae-mi R408的表达受Ta CWINV53抑制调控,而不同处理中KTM3315A的花药蔗糖含量进一步显示出与tae-mi R408表达水平的密切关系。为了揭示tae-mi R408影响KTM3315A育性的下游原因,通过q RT-PCR验证了被tae-mi R408抑制的蓝铜蛋白基因（Traes CS7A02G176800）在KTM3315A花药中的差异表达。综上,本研究梳理出一个多基因参与KTM3315A育性调控的机制模型:高温可育条件下（>20℃）,lncRNA MSTRG.224114以招募ERF转录因子的方式增强Ta CWINV53表达,进而通过降低蔗糖含量来抑制tae-mi R408的表达并间接促进Traes CS7A02G176800表达,最终保障花粉发育的物质供应,使KTM3315A表现出雄性可育表型。
刘晓倩[6]（2021）在《烟草曲茎病毒伴随卫星编码βC1蛋白增强病毒症状功能初步研究》文中指出烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus,Tb CSV）是双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的病毒,由烟粉虱（Bemisia tabaci）传播,在番茄、烟草等作物上造成病害。在田间,部分分离物伴随烟草曲茎伴随卫星（tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB）。βC1蛋白是双生病毒伴随卫星编码的一个多功能蛋白,其功能包括RNA沉默抑制子、症状决定因子等多种功能。TbCSB与辅助病毒复合侵染,增强辅助病毒症状和病毒积累量,已在多种重要作物上造成严重的经济损失,但对于TbCSBβC1在病毒侵染过程中的具体作用机制及细节尚不明确。本研究利用分子克隆、转基因、酵母双杂交及定量PCR等实验技术,通过对TbCSB编码的βC1蛋白在寄主体内的功能进行分析,研究结果为进一步解析该病毒在侵染植株中的致病机理奠定了基础。为明确TbCSB编码的βC1对植株症状和病毒积累量的影响。首先对TbCSBβC1与其它双生病毒β卫星编码的βC1进行了同源性分析,结果发现其与中国番茄黄化曲叶病毒卫星（tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB-Y38,AJ420315）核苷酸相似性最高,为75.07%。随后将Tb CSV及TbCSB共同接种本氏烟,在接种第50天的时候可以观察到明显的曲茎症状,其病毒积累量与单独接种Tb CSV相比,上调30倍。基于马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）载体的系统表达技术,发现TbCSB编码的βC1可以诱导植株出现叶片卷曲和曲茎症状,接种植株中病毒积累量增加。在接种PVX-ΔβC1的植株上,可以观察到叶片上卷的现象,随后对其病毒积累量检测发现,与接种PVX-βC1相比,其中的病毒积累量下调表达了约82倍。转βC1基因植株上,可以观察到叶片皱缩和上卷的症状。在转βC1基因本氏烟植株接种Tb CSV后,与野生型植株接种Tb CSV相比,病毒积累量上调10倍以上。说明TbCSBβC1作为症状决定因子,能够使植株症状加重并且使其中的病毒积累量升高。为了明确Tb SCBβC1与Tb CSV及寄主因子的互作,利用酵母双杂交（Y2H）技术和双分子荧光互补技术（Bi FC）对可能与βC1存在互作的蛋白进行了探究。通过实验室前期研究发现TbCSB编码的βC1可能与Tb CSV编码的蛋白存在互作,随后通过Y2H技术和Bi FC验证了βC1与C2存在互作。并且对TbCSB编码的βC1及Tb CSV编码的C2在细胞中的亚细胞定位进行分析发现,当将βC1和C2单独接种本氏烟时,βC1定位于细胞核和细胞膜上,C2定位于细胞核内。为进一步解析TbCSB编码的βC1在病毒侵染过程中的作用功能,利用番茄文库,以p GBKT7为诱饵,通过酵母筛库筛选到了4个可能与βC1存在互作的蛋白。分别为solanum lycopersicum probable serine/threonine-protein kinase（STPK）,solanum lycopersicum stromal 70 k Da heat shock-related protein（HSRP）,solanum lycopersicum probable transcription factor At5g2804（TFAT）,solanum lycopersicum chaperone protein dna J A7A,chloroplastic-like（A7A）。进一步利用Y2H技术验证了βC1与STPK存在互作。通过RT-q PCR方法探究了βC1对上述4个基因表达的影响结果表明,当接种PVX-βC1后,4个基因均下调表达,其中,STPK下调表达程度最大,与接种PVX-GUS相比,下调表达5倍左右。当接种Tb CSV和Tb CSV+TbCSB后,4个基因均上调表达,但是当Tb CSV+TbCSB共同接种时,4个基因的上调表达程度与单独接种Tb CSV相比较低。其中,HSRP在接种Tb CSV后,上调表达接近5倍左右,而HSRP在接种Tb CSV+TbCSB后上调表达3倍以上。结果表明TbCSBβC1可通过与辅助病毒Tb CSV编码蛋白及寄主因子互作从而增强病毒症状和积累量。为明确TbCSB编码的βC1对RNA沉默途径相关基因（AGOs,DCLs,RDRs）表达量的影响,我们利用RT-q PCR检测AGOs,DCLs,RDRs相关基因的表达情况。当Tb CSV单独侵染和Tb CSV与TbCSB共侵染（Tb CSV+TbCSB）本氏烟后,AGOs,DCLs,RDRs基因表达量均增加。当Tb CSV与TbCSB（Tb CSV+TbCSB）共侵染时,AGOs,DCLs,RDRs基因的增加量更加明显。其中,与对照相比,DCL4上调表达8倍以上,AGO7上调表达12倍以上,RDR6上调表达12倍。通过PVX-βC1接种本氏烟后,与对照相比,DCL2上调2倍以上,AGO7上调表达接近4倍,RDR6上调表达12倍。在转基因植株中过表达βC1后,与野生型本氏烟相比,AGO6上调表达26倍,RDR6上调表达13倍。实验结果表明βC1可以加重病毒产生的症状和积累量,并且使RNA沉默途径相关基因的表达量增加。本研究通过对TbCSB编码的βC1的具体功能研究发现,βC1作为症状决定因子和RNA沉默抑制子,当与辅助病毒Tb CSV共同侵染时,可以加重植株产生的症状并且使病毒积累量上升。而通过对βC1的生物学功能分析发现,βC1与Tb CSV编码的C2以及寄主因子STPK存在互作,而这种互作与βC1具体功能之间的联系还有待进一步研究。
崔维军[7]（2021）在《水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究》文中认为水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）侵染引起的一种重要的病毒病害。RSV侵染寄主后造成严重症状,甚至死亡,对水稻的生产造成严重的影响。研究RSV与植物寄主之间的互作模式,挖掘植物寄主潜在的抗病基因,能够为病害防治措施的制定以及培育抗病种质资源提供理论支持,对病害的防治以及水稻生产具有重大意义。Ferredoxin 1（FD1）编码植物光合作用电子传递链中电子受体蛋白。近年来,越来越多的研究证实FD1参与到植物免疫防卫反应中。病原物的侵染往往造成FD1表达下调,但关于该过程的调控机制尚不明确。我们针对RSV调控植物FD1表达的机制开展深入研究。研究发现,水稻和本氏烟FD1基因在RSV侵染后表达下调。进一步分析表明,本氏烟FD1（NbFD1）基因的沉默导致RSV病毒量的积累,而过量表达NbFD1的本氏烟和过表达水稻FD1（Os FD1）基因的水稻对RSV表现出一定的抗性。小RNA测序分析发现,一条病毒来源的小RNA—vsi R45349能够靶向并切割NbFD1的转录本。通过RSV基因组序列及MIR319前体瞬时表达vsi R45349,均引起NbFD1转录本丰度下调约30%。降解组测序结果进一步证实,vsi R45349参与到对NbFD1转录后水平的表达调控过程。然而小RNA介导的FD1表达下调幅度达不到病毒侵染达到的FD1下调幅度,我们推测还有其他调控途径在起作用。进一步分析NbFD1启动子序列发现,启动子序列中含有2个ABA（Abscisic acid）响应元件ABRE（ABA Responsive Element）,同时RSV侵染引起本氏烟中ABA的积累。外施ABA显着降低NbFD1的转录本丰度,并抑制NbFD1启动子驱动的报告基因的转录。分析已知的参与ABA调控的转录因子,发现ABI5（ABA Insensitive 5）可能参与FD1的表达调控。深入研究表明,NbABI5沉默导致本氏烟中NbFD1表达上调,瞬时表达NbABI5则抑制NbFD1表达;在NbABI5沉默的本氏烟中,ABA对NbFD1表达的抑制作用减弱,表明NbABI5参与到NbFD1表达调控过程。酵母单杂交实验发现,NbABI5能够与NbFD1启动子序列直接结合,与ABRE元件的突变NbFD1启动子之间的结合能力减弱甚至丧失。通过双荧光素酶分析发现,NbABI5可以抑制NbFD1启动子驱动的萤火虫荧光素酶的转录,但对2个ABRE突变的启动子驱动的转录过程无影响。这些结果表明,NbABI5是ABA调控NbFD1表达过程所必需的。在水稻中,Os FD1启动子序列中含有4个ABA响应元件ABRE,RSV侵染同样引起水稻组织中ABA的含量提高了约2倍。水稻幼苗经ABA处理后,Os FD1转录本丰度下调。与本氏烟中相同,RSV侵染和ABA处理显着诱导Os ABI5s的表达,瞬时超表达Os ABI5显着抑制Os FD1启动子驱动的萤火虫荧光素酶的转录。以上结果暗示,在水稻中RSV同样通过ABA调控Os FD1的表达。综上,我们认为RSV可能从转录及转录后两个层面调控寄主FD1转录本丰度,进而抑制FD1介导的植物对RSV的抗性。
张天烨[8]（2020）在《Wheat yellow mosaic virus NIb蛋白与寄主因子TaLIP互作及其对病毒侵染的影响》文中提出小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）是大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）的一员,由禾谷多黏菌进行传播。小麦黄花叶病毒的核内涵体蛋白（nuclear inclusion b,NIb）是一个含有保守Gly-Asp-Asp（GDD）模体的蛋白,被认为是病毒依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNApolymerase,Rd Rp）。本研究以WYMV的NIb为探究目标,捕获与之相互作用的寄主靶标蛋白。随后通过一系列分子实验探究NIb在WYMV侵染植株过程中发挥的作用。主要研究结果如下:首先,通过酵母系统得到12个可能与NIb互作的寄主蛋白。考虑到光诱导蛋白（Triticum aestivum light induced protein,LIP）被重复筛选的次数较多,故挑选其进行后续实验。随后,经由酵母双杂交、双份子荧光互补（Bi FC）和体内免疫共沉淀（COIP）技术分别验证了NIb和Ta LIP在植物体内/外的互作干系。并且亚细胞定位实验进一步分析发现NIb与Ta LIP互作会改变它们各自的定位。然后,利用BSMV介导的VIGS技术在小麦植株中对Ta LIP进行瞬时沉默分析。通过荧光实时定量PCR（q RT-PCR）筛选沉默显着的小麦植株后进行WYMV的接毒实验。结果表明,沉默了Ta LIP的小麦植株（BSMV:Ta LIP）对WYMV表现出更加敏感。最后,利用LC-MS进行植物激素含量的对比分析,结果发现BSMV:Ta LIP植株中ABA的含量显着减少。另外,外源喷施ABA实验发现,ABA能够诱导小麦植株中Ta LIP的m RNA显着上调表达。q RT-PCR结果也表明,在BSMV:Ta LIP的小麦植株中,ABA信号通路基因wheat abscisic acid insensitive 5（Ta ABI5）,abscisic acid insensitive 8（Ta ABI8）,pyrabatin resistance 1-Llike（Ta PYL1）和pyrabatin resistance3-Llike（Ta PYL3）的m RNA水平也受到了抑制。综上结果表明,WYMV的NIb通过与Ta LIP相互作用,改变其在植物细胞中的定位,干扰Ta LIP的正常功能,抑制ABA信号通路,从而促进WYMV的侵染。
焦裕冰[9]（2020）在《PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究》文中提出辣椒是我国重要的园艺作物,种植面积达150万160万公顷,约占全国蔬菜种植总面积的10%。辣椒病毒病是危害辣椒生产的重要病害,目前世界上已发现近40种病毒可以侵染辣椒。辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员,可侵染不同品种的辣椒,主要引起叶片皱缩、花叶和果实扁平、变小、畸形等症状,对辣椒的生产造成了严重损失。本文对PMMoV与寄主之间的互作关系进行了深入研究,探索了vsiRNA、miRNA和相关寄主因子在PMMoV与辣椒互作中的功能,并揭示了PMMoV侵染诱导的细胞自噬是寄主抗病毒的重要机制之一,主要研究结果如下:本文针对侵染辣椒的两种病毒PMMoV和辣椒脉斑驳病毒（chilli venial mottle virus,ChiVMV）建立了一种快速RT-RPA检测技术。该技术仅需一对特异性引物,在38℃条件下反应30 min即可完成扩增;具有良好的特异性,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应;检测灵敏度是普通RT-PCR技术的10倍;可用于田间样品快速检测。本文通过高通量测序研究了PMMoV侵染辣椒后vsiRNA的表达特征,探索了小RNA在病毒与寄主互作中的重要功能。PMMoV侵染后辣椒中vsiRNA的长度主要是21-nt和22-nt,5’末端碱基以U为主,vsiRNA来源于PMMoV基因组的正负链,但其在正负链上分布却表现出明显的不均匀分布,来源于PMMoV正链的vsiRNA及热点（hotspot）比来源于负链的多,并且在RdRp编码区和CP编码区位置热点数较其他区域多。对vsiRNA的靶标预测表明42个特异的vsiRNA靶向辣椒中的66个注释基因,并且在特定条件下,正义链中的大多数vsiRNA有多个靶点,而反义的大多数vsiRNA只有一个靶点。对这些靶标进行Gene Ontology（GO）分析,结果表明许多注释的靶标参与了应激反应、细胞调节和新陈代谢相关的生理途径。另外,PMMoV侵染能显着诱导辣椒中CaAGO1a/1b/2,CaDCL2和CaRDR1的表达。进一步分析测序结果表明,PMMoV侵染影响了辣椒中内源小RNA的表达。本研究共鉴定到88个辣椒中已知miRNA,其中包括20个辣椒中特异的miRNA,并预测得到198个新miRNA。利用生物信息学软件预测了miRNA的靶标,并进行功能分析,GO分析显示大部分靶标在辣椒生长发育和防御信号过程中发挥重要作用,这些结果为研究病毒侵染对辣椒miRNA调控网络的影响奠定了基础。为了进一步了解辣椒与PMMoV的互作情况,本研究借助高通量测序技术从转录水平上对未感染PMMoV和感染PMMoV的辣椒植株进行了基因表达分析。共获得24,227个基因,得到了197个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中172个基因较对照组显着上调,25个基因显着下调,这些DEGs参与了病毒侵染后辣椒中信号通路的差异调节以及防御相关因子的表达。对这些DEGs进行GO和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）通路富集进一步分析,分别得到53条显着富集的GO terms和6条显着富集的KEGG途径。另外,通过鉴定明确了PMMoV侵染影响多个辣椒细胞自噬相关基因（autophagy-related genes,ATGs）的表达,暗示细胞自噬可能在PMMoV侵染过程中发挥重要功能。自噬与植物病毒之间的直接相互作用成为最近研究的热点。在本研究中,以模式植物本氏烟为材料,利用透射电子显微镜观察、自噬marker GFP-ATG8a荧光和免疫印迹观察以及实时荧光定量PCR分别检测PMMoV侵染后烟草叶片细胞内自噬结构的形成和细胞自噬相关基因NbVPS15、NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7、NbATG8a、NbATG9的表达特征,明确了PMMoV侵染能够诱导寄主的细胞自噬反应。利用VIGS技术分别沉默NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7和NbATG8a等几个自噬关键基因,可增加PMMoV的积累并加快症状的产生,与此同时,使用细胞自噬抑制剂3-MA和E64d处理也会增加病毒的积累。酵母双杂交结果显示,PMMoV编码的P126能够与NbATG8f互作,其中解旋酶区域Hel是互作的关键结构域,暗示P126可能通过与NbATG8f结合而成为自噬降解的靶点。这些结果进一步表明自噬在PMMoV侵染过程中发挥抗病毒作用。
朱宗财[10]（2020）在《烟草NtRBP45在烟草花叶病毒侵染寄主过程中的功能研究》文中提出烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）为正义单链RNA病毒,其结构简单,寄主广泛,且稳定性强。TMV以机械传播为主,是威胁烟草等多种茄科作物的重要病原之一。RBP（RNA-binding proteins）是真核生物中广泛存在的一类蛋白,在植物应对生物胁迫与非生物胁迫中发挥重要作用,特别是参与植物调控RNA病毒侵染途径。本论文以普通烟草内源基因NtRBP45为研究对象,初步探索了其在寄主应答TMV侵染过程中可能的作用机制,获得主要结果如下:（1）TMV侵染珊西烟引发NtRBP45上调表达利用RT-qPCR分析TMV侵染珊西烟中NtRBP45的转录表达,结果显示NtRBP45转录水平在接种TMV后显着上升,在3 d时达峰值,表明TMV侵染普通烟草后引发NtRBP45的上调表达。因而,推测NtRBP45表达量升高可能有助于烟草抵御TMV侵染。（2）NtRBP45主要定位于细胞核构建植物表达载体pNtRBP45-GFP、pNtRBP45N△-GFP、pNtRBP45C△-GFP、pNtRBP45N△C△-GFP、pNtRBP45N-GFP,分别导入农杆菌EHA105,对NtRBP45及其缺失突变体进行亚细胞定位分析。结果显示NtRBP45-GFP在细胞膜、细胞质中均有分布,但绝大部分位于细胞核;NtRBP45N△C△-GFP、NtRBP45N△-GFP、NtRBP45C△-GFP与NtRBP45-GFP亚细胞定位类似,但NtRBP45N-GFP在细胞核中分布相对减弱。因此,推测NtRBP45的中间区域（67-372 aa）可能包含指导蛋白进入细胞核的重要序列。（3）瞬时表达NtRBP45引发本氏烟叶片坏死,激发H2O2积累构建植物表达载体pCamNtRBP45、pCamNtRBP45N△、pCamNtRBP45C△、pCamNtRBP45N△C△、pCamNtRBP45N,分别导入农杆菌EHA105,注射6周龄本氏烟的成熟叶片。结果显示:注射6 d后,NtRBP45和NtRBP45C△引发叶片出现坏死,且前者表型比后者更明显,而其他均无任何变化。DAB染色分析显示NtRBP45瞬时表达激发了H2O2的积累,而在四个突变体中,仅C-端缺失突变体NtRBP45C△能够激发微量H2O2积累,由此暗示NtRBP45 N-端为关键功能区。（4）瞬时过表达NtRBP45促进RNA沉默将含有pCamNtRBP45或pCAMBIA-35s-GFP的农杆菌液共注射16c本氏烟,同时用含有p35S-T2b或pCAMBIA1350.1的农杆菌液与pCAMBIA-35s-GFP共注射作为对照。处理三天后,收集样品,提取RNA,Northern blot分析显示NtRBP45促进了gfp siRNA积累。由此分析,NtRBP45具有促进RNA沉默的功能。进一步研究表明缺失突变体NtRBP45N△、NtRBP45C△、NtRBP45N△C△、NtRBP45N均丧失促进RNA沉默的功能,仅有全长NtRBP45表现此功能。（5）制备表达NtRBP45的转基因植物利用叶盘法将NtRBP45导入本氏烟,获得37个转基因株系。随机取6个转基因株系的T1代植株,接种丁香假单胞Pst DC3000?HopQ 1,6天后菌落计数显示4个株系的菌落数显着低于野生型,暗示过量表达NtRBP45能够提高本氏烟对Pst DC3000?HopQ 1的抗性。利用蘸花法转化拟南芥,获得20个转基因株系。对T1代转基因植株表型进行观察,结果显示转基因植株自第8-9个莲座叶出现叶片坏死,生长后期植株弱小早衰。综上所述,本论文分析了NtRBP45表达的时空特征,发现NtRBP45具有诱发H2O2积累和增强RNA沉默的功能,并研制了表达NtRBP45的转基因植物材料,为进一步开展NtRBP45的功能研究奠定了基础。
二、黄瓜花叶病毒反义2b基因构建及其转基因初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、黄瓜花叶病毒反义2b基因构建及其转基因初步研究（论文提纲范文）
（1）基于黄瓜花叶病毒构建双联和三联弱毒疫苗的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 我国常见的烟草病毒病种类 |
| 1.1.1 黄瓜花叶病毒 |
| 1.1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.1.3 株系划分 |
| 1.1.1.4 危害症状 |
| 1.1.2 烟草花叶病毒 |
| 1.1.2.1 生物学特性 |
| 1.1.2.2 基因组结构 |
| 1.1.2.3 株系划分 |
| 1.1.2.4 危害症状 |
| 1.1.3 马铃薯Y病毒 |
| 1.1.3.1 生物学特性 |
| 1.1.3.2 基因组结构 |
| 1.1.3.3 株系划分 |
| 1.1.3.4 危害症状 |
| 1.1.4 马铃薯X病毒 |
| 1.1.4.1 生物学特性 |
| 1.1.4.2 基因组结构 |
| 1.1.4.3 株系划分 |
| 1.1.4.4 危害症状 |
| 1.1.5 烟草脉带花叶病毒 |
| 1.1.5.1 生物学特性 |
| 1.1.5.2 基因组结构 |
| 1.1.5.3 危害症状 |
| 1.2 烟草病毒病的防治措施 |
| 1.2.1 传统防治措施 |
| 1.2.2 利用抗病毒基因工程防治 |
| 1.2.2.1 RNAi技术 |
| 1.2.2.2 卫星RNA介导的病毒抗性 |
| 1.2.2.3 植物细胞工程技术 |
| 1.2.3 利用弱毒疫苗的交叉保护防治 |
| 1.3 交叉保护 |
| 1.3.1 交叉保护机制 |
| 1.3.2 弱毒株系的分离方式 |
| 1.3.2.1 自然分离 |
| 1.3.2.2 高温处理 |
| 1.3.2.3 亚硝酸处理 |
| 1.3.2.4 紫外线照射处理 |
| 1.3.2.5 利用卫星RNA组建弱毒株系 |
| 1.3.2.6 利用现代分子生物学技术构建 |
| 1.3.3 交叉保护的应用 |
| 1.3.4 影响交叉保护效果的因素 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株及毒源 |
| 2.1.2 供试植物、蚜虫 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物及测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取——TransZol试剂提取法 |
| 2.2.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 菌落PCR |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.7 DNA片段的纯化 |
| 2.2.8 同源重组 |
| 2.2.9 连接反应 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备(DH5α) |
| 2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的转化(DH5α) |
| 2.2.12 质粒提取(碱裂解法) |
| 2.2.13 农杆菌感受态细胞的制备(GV3101) |
| 2.2.14 农杆菌感受态细胞的转化(GV3101) |
| 2.2.15 病毒接种 |
| 2.2.15.1 农杆菌注射接种法 |
| 2.2.15.2 机械摩擦接种法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基于CMV_(Fny)RNA2的双联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.1.1 兼抗CMV/TMV的双联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.1.1.1 TMV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.1.1.2 TMV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的稳定性分析 |
| 3.1.1.3 TMV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的交叉保护作用评价 |
| 3.1.2 兼抗CMV/TCV的双联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.1.2.1 TCV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.1.2.2 TCV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的稳定性分析 |
| 3.1.2.3 TCV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的交叉保护作用评价 |
| 3.1.3 兼抗CMV/TSWV的双联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.1.3.1 TSWV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.1.3.2 TSWV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的稳定性分析 |
| 3.1.3.3 TSWV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体交叉保护作用评价 |
| 3.1.4 兼抗CMV/TMV的100 bp双联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.1.4.1 TMV100 bp片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.1.4.2 TMV100 bp片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的稳定性分析 |
| 3.1.4.3 TMV100bp片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的交叉保护作用评价 |
| 3.2 基于CMV_(Fny)RNA2 的三联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.2.1 兼抗CMV/TMV/PVX的三联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.2.1.1 TMV/PVX片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.2.1.2 TMV/PVX片段插入型CMN RNA2弱毒突变体的稳定性及交叉保护效果分析 |
| 3.2.2 兼抗CMV/TMV/PVY的三联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.2.2.1 TMV/PVY片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.2.2.2 TMV/PVY片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的稳定性及交叉保护效果分析 |
| 3.2.3 兼抗CMV/TMV/TVBMV的三联弱毒疫苗的构建与评价 |
| 3.2.3.1 TMV/TVBMV片段插入型CMV RNA2弱毒突变体的构建 |
| 3.2.3.2 TMV/TVBMV片段插入型CMN RNA2弱毒突变体稳定性及交叉保护效果分析 |
| 3.3 基于CMV_(Fny)RNA3的CP蛋白和蚜传位点突变体构建及作用评价 |
| 3.3.1 基于CMV_(Fny)RNA3 CP的缺失型突变体构建与评价 |
| 3.3.1.1 CP蛋白全部缺失型突变体的构建 |
| 3.3.1.2 CP蛋白全部缺失型突变体稳定性评价 |
| 3.3.1.3 CP蛋白部分序列缺失型突变体的构建 |
| 3.3.1.4 CP蛋白部分序列缺失型突变体稳定性评价 |
| 3.3.2 基于CMV_(Fny)RNA3 CP的提前终止型突变体构建与评价 |
| 3.3.2.1 CP蛋白提前终止型突变体的构建 |
| 3.3.2.2 CP蛋白提前终止型突变体稳定性评价 |
| 3.3.3 基于CMV_(Fny)RNA3基因间隔区的突变体构建与评价 |
| 3.3.3.1 IGR部分缺失型突变体的构建 |
| 3.3.3.2 IGR部分缺失型突变体稳定性评价 |
| 3.3.4 基于CMV_(Fny)RNA3的蚜传关键位点突变与稳定性分析 |
| 3.3.4.1 蚜传关键位点突变体的构建 |
| 3.3.4.2 蚜传关键位点突变体稳定性评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 弱毒疫苗在本生烟上的接种时间和交叉保护效果比较 |
| 4.2 三联弱毒疫苗交叉保护效果不明显 |
| 4.3 RNA3 突变体存在完全恢复现象 |
| 4.4 影响CMV_(Fny)蚜传效率的原因 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 引物列表 |
| 附录2 质粒列表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物病毒病与综合防治 |
| 1.1.1 植物病毒病简介 |
| 1.1.2 植物病毒病防治 |
| 1.1.2.1 农业防治 |
| 1.1.2.2 培育抗病品种 |
| 1.1.2.3 药剂防治 |
| 1.1.2.4 卫星RNA介导的病毒抗性 |
| 1.1.2.5 弱毒疫苗防治 |
| 1.2 交叉保护 |
| 1.2.1 交叉保护现象与应用 |
| 1.2.2 交叉保护的机制 |
| 1.2.3 疫苗研制的要求与潜在问题 |
| 1.3 RNA病毒重组及发生机制 |
| 1.3.1 重组与进化 |
| 1.3.2 重组的类型 |
| 1.3.3 重组的机制 |
| 1.3.3.1 复制型重组(拷贝选择机制) |
| 1.3.3.2 非复制型重组 |
| 1.3.3.3 重配 |
| 1.3.4 重组率 |
| 1.3.5 RNA重组的生物学意义 |
| 1.4 黄瓜花叶病毒(CMV) |
| 1.4.1 黄瓜花叶病毒的分类与危害 |
| 1.4.2 黄瓜花叶病毒的生物学特性 |
| 1.4.3 黄瓜花叶病毒致病性分析 |
| 1.4.3.1 1a蛋白 |
| 1.4.3.2 2a蛋白 |
| 1.4.3.3 2b蛋白 |
| 1.4.3.4 3a蛋白 |
| 1.4.3.5 CP |
| 1.4.3.6 TLS结构 |
| 1.4.3.7 卫星RNA |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体、植株 |
| 2.1.2 载体及试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 引物与测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.1.1 TransZol法 |
| 2.2.1.2 非TransZol法 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.2.3 突变体构建方法 |
| 2.2.3.1 PCR或反向PCR |
| 2.2.3.2 重叠PCR |
| 2.2.4 DNA纯化 |
| 2.2.4.1 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.4.2 核酸的胶回收 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 同源重组 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞(DH5α)的制备与转化 |
| 2.2.9 阳性克隆筛选 |
| 2.2.9.1 菌落PCR |
| 2.2.9.2 酶切鉴定 |
| 2.2.9.3 质粒测序与序列分析 |
| 2.2.10 质粒提取(碱裂解法) |
| 2.2.11 农杆菌感受态细胞(GV3101)的制备与转化 |
| 2.2.12 本氏烟种植 |
| 2.2.13 本氏烟接种 |
| 2.2.13.1 机械摩擦法 |
| 2.2.13.2 农杆菌注射法 |
| 2.2.14 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.15 Western Blot分析 |
| 2.2.16 Northern Blot分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CMV2b蛋白突变型载体的致病性分析 |
| 3.1.1 两种2b蛋白翻译提前终止型载体 |
| 3.1.1.1 2b蛋白翻译提前终止型突变体构建与致病性分析 |
| 3.1.1.2 R2-2bPTⅡ型突变体交叉保护效果测定 |
| 3.1.1.3 R2-2bPTⅡ型突变体遗传稳定性的继代分析 |
| 3.1.1.4 R2-2bPTⅡ突变载体容纳外源片段长度能力测定 |
| 3.1.2 2b蛋白编码序列的缺失型载体 |
| 3.1.2.1 2b蛋白缺失型突变体构建与致病性分析 |
| 3.1.2.2 R2-2bPTⅢ型突变体交叉保护效果测定 |
| 3.1.2.3 R2-2bPTⅢ型突变载体容纳外源片段长度能力测定 |
| 3.2 CMV其他编码蛋白和部分顺式作用元件突变型载体 |
| 3.2.1 RNA3 序列缺失型突变载体构建与致病性分析 |
| 3.2.2 基因组3’端非翻译区突变型载体 |
| 3.2.2.1 基因组3’UTR18 nt插入型突变载体构建与致病性分析 |
| 3.2.2.2 3’UTR外源片段插入型突变体构建与致病性分析 |
| 3.2.3 TLS突变型载体与致病性分析 |
| 3.2.3.1 TLS18 nt突变型载体构建与致病性分析 |
| 3.2.3.2 TLS200 nt突变型载体构建与致病性分析 |
| 3.3 TLS突变位点修复的机理探究 |
| 3.3.1 TLS突变的修复现象与修复机制 |
| 3.3.2 触发突变修复的因素探究 |
| 3.3.2.1 病毒基因组节段RNA的数量和质量缺陷触发突变修复 |
| 3.3.2.2 病毒基因组的低浓度触发突变修复 |
| 3.3.3 突变修复的发生时机探究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外源片段插入型突变不稳定的因素探讨 |
| 4.2 突变修复的机制 |
| 4.3 影响突变重组修复率的因素探讨 |
| 4.4 突变、适应度与修复的平衡关系 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 黄瓜花叶病毒(CMV)花生分离物侵染性克隆构建 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）基于黄瓜花叶病毒的多联弱毒疫苗创制及接种方案优化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 烟草病毒病 |
| 1.1.1 黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV) |
| 1.1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.1.2 CMV基因组 |
| 1.1.2 马铃薯 X 病毒(potato virus X,PVX) |
| 1.1.2.1 生物学特性 |
| 1.1.2.2 PVX基因组 |
| 1.1.3 马铃薯 Y 病毒(potato virus Y,PVY) |
| 1.1.3.1 生物学特性 |
| 1.1.3.2 PVY基因组 |
| 1.1.4 烟草脉带花叶病毒(tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV) |
| 1.1.4.1 生物学特性 |
| 1.1.4.2 TVBMV基因组 |
| 1.2 烟草病毒病的综合防治 |
| 1.2.1 农业防治 |
| 1.2.1.1 栽培措施防病 |
| 1.2.1.2 选育抗病品种 |
| 1.2.3 生物防治 |
| 1.2.3.1 RNAi技术 |
| 1.2.3.2 卫星RNA介导病毒抗性 |
| 1.2.3.3 植物细胞工程技术 |
| 1.2.3.4 .弱毒疫苗 |
| 1.2.4 化学防治 |
| 1.3 病毒的接种方法 |
| 1.3.1 摩擦接种 |
| 1.3.2 浸润接种 |
| 1.3.3 浸根接种 |
| 1.3.4 针刺接种 |
| 1.3.5 喷雾接种 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株及毒源 |
| 2.1.2 供试植物 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 实验仪器及设备 |
| 2.1.5 引物和测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.1.1 Trans Zol up法 |
| 2.2.1.2 水饱和酚法 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 DNA片段的胶回收 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.5.1 Sma I酶切 |
| 2.2.5.2 Bam HⅠ酶切 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 重组法构建质粒 |
| 2.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌DH5α的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR |
| 2.2.11 质粒提取 |
| 2.2.12 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备 |
| 2.2.13 农杆菌GV3101 的转化 |
| 2.2.14 病毒接种方法 |
| 2.2.14.1 农杆菌注射法 |
| 2.2.14.2 机械摩擦法 |
| 2.2.14.3 喷雾接种 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 弱毒疫苗接种方案的优化 |
| 3.1.1 喷雾接种 |
| 3.1.1.1 农杆菌菌液直接喷雾接种 |
| 3.1.1.2 农杆菌菌液混合金刚砂喷雾接种 |
| 3.1.2 农杆菌保质期的评估 |
| 3.1.2.1 延长农杆菌菌体重悬静置的处理 |
| 3.1.2.2 延长农杆菌集菌后的保存时间 |
| 3.1.3 弱毒疫苗与肥料结合使用的评估 |
| 3.2 兼抗CMV/PVX的双联疫苗制备 |
| 3.2.1 PVX插入型突变体的构建 |
| 3.2.2 PVX插入型突变体的生物学效应 |
| 3.2.2.1 单个PVX插入型突变体的生物学效应 |
| 3.2.2.2 两个PVX插入型突变体混合接种的生物学效应 |
| 3.2.2.3 多个PVX插入型突变体混合接种的生物学效应 |
| 3.2.2.4 普通烟接种单个PVX插入型突变体的生物学效应 |
| 3.2.3 PVX插入型突变体对CMV/PVX的交叉保护评估 |
| 3.2.3.1 单个PVX插入型突变体接种的交叉保护评估 |
| 3.2.3.2 两个PVX插入型突变体混合接种的交叉保护评估 |
| 3.2.3.3 多个PVX插入型突变体混合接种的交叉保护评估 |
| 3.2.3.4 普通烟接种单个PVX插入型突变体的交叉保护评估 |
| 3.3 三联弱毒疫苗制备 |
| 3.3.1 兼抗CMV/PVX/PVY的三联弱毒疫苗制备 |
| 3.3.1.1 PVX/PVY插入型CMV RNA2 弱毒突变体的构建 |
| 3.3.1.2 PVX/PVY插入型CMV RNA2 弱毒突变体的生物学效应 |
| 3.3.2 兼抗CMV/PVX/TVBMV的三联弱毒疫苗制备 |
| 3.3.2.1 PVX/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的构建 |
| 3.3.2.2 PVX/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的生物学效应 |
| 3.3.2.3 PVX/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的交叉保护评估 |
| 3.3.3 兼抗CMV/PVY/TVBMV的三联弱毒疫苗制备 |
| 3.3.3.1 PVY/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的构建 |
| 3.3.3.2 PVY/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的生物学效应 |
| 3.3.3.3 PVY/TVBMV插入型CMV RNA2 弱毒突变体的交叉保护效果评估 |
| 3.4 针对CMV_(Fny)RdRp的基础载体改造 |
| 3.4.1 基于CMV_(Fny)RNA2的RdRp突变体构建 |
| 3.4.2 RdRp突变体与CMV_(Fny)RNA2 混合接种 |
| 3.4.3 RdRp突变体与RNA3 TLS突变体混合接种 |
| 3.4.4 RdRp突变体与RNA3 CP缺失突变体混合接种 |
| 4 讨论 |
| 4.1 弱毒疫苗喷雾接种方案 |
| 4.2 多剂疫苗混合预防效果优于单剂 |
| 4.3 三价弱毒疫苗交叉保护效果比较 |
| 4.4 RdRp突变体对提高保真性的效果分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 引物列表 |
| 附表2 质粒列表 |
| 致谢 |
（4）卫星RNA对黄瓜花叶病毒弱毒疫苗交叉保护作用的效应（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 黄瓜花叶病毒病及防治 |
| 1.1.1 黄瓜花叶病毒病的危害 |
| 1.1.2 黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV) |
| 1.1.2.1 CMV病毒粒子 |
| 1.1.2.2 CMV传播途径 |
| 1.1.2.3 CMV株系 |
| 1.1.2.4 CMV基因组 |
| 1.1.3 黄瓜花叶病毒病的防治 |
| 1.1.3.1 加强检疫措施 |
| 1.1.3.2 农业防治 |
| 1.1.3.2.1 选育抗病品种 |
| 1.1.3.2.2 种子处理 |
| 1.1.3.2.3 农业防治蚜虫 |
| 1.1.3.2.4 加强栽培防病措施 |
| 1.1.3.3 药剂防治 |
| 1.1.3.4 生物防治 |
| 1.1.3.4.1 生物防治蚜虫 |
| 1.1.3.4.2 RNAi技术防治 |
| 1.1.3.4.3 植物细胞工程技术 |
| 1.1.3.4.4 弱毒疫苗的交叉保护防治 |
| 1.2 交叉保护 |
| 1.2.1 交叉保护的作用机理 |
| 1.2.1.1 占位机制 |
| 1.2.1.2 RNA诱导的交叉保护作用 |
| 1.2.1.3 CP蛋白诱导的交叉保护 |
| 1.2.1.4 RNA交互作用 |
| 1.2.1.5 系统移动的抑制作用 |
| 1.2.2 交叉保护存在的问题及措施 |
| 1.3 卫星RNA |
| 1.3.1 CMV卫星RNA的分类及调控机制 |
| 1.3.2 CMV卫星RNA的应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 受试植物、质粒及菌株 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配方 |
| 2.1.4 主要实验仪器、设备 |
| 2.1.5 引物和测序 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 本氏烟种植 |
| 2.2.2 植物总RNA提取 |
| 2.2.2.1 水饱和酚法 |
| 2.2.2.2 Trans Zol up法 |
| 2.2.3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 DNA片段胶回收 |
| 2.2.6 酶切反应 |
| 2.2.6.1 Sma I酶切 |
| 2.2.6.2 Bam H I酶切 |
| 2.2.7 重组连接反应 |
| 2.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌DH5α的转化 |
| 2.2.9.1 自制大肠杆菌DH5α的转化 |
| 2.2.9.2 商品化大肠杆菌DH5α的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR |
| 2.2.11 质粒提取 |
| 2.2.11.1 碱裂解法 |
| 2.2.11.2 试剂盒法 |
| 2.2.12 农杆菌GV3101 的转化 |
| 2.2.13 农杆菌接种 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卫星RNA与辅助病毒CMV定量接种体系的构建 |
| 3.1.1 含有2种卫星RNA的双元质粒构建 |
| 3.1.2 卫星RNA与辅助病毒CMV的定量接种体系 |
| 3.2 卫星RNA与不同类型CMV等比例混合接种的效果分析 |
| 3.2.1 CMV强毒分离物与卫星RNA混合接种的防治效果分析 |
| 3.2.2 CMV天然弱毒分离物与卫星RNA混合接种的交叉保护效果评价 |
| 3.2.3 CMV人工弱毒突变体与卫星RNA混合接种的交叉保护效果评价 |
| 3.2.4 CMV异源病毒片段插入型人工弱毒突变体与卫星RNA混合接种的交叉保护效果评价 |
| 3.3 卫星RNA与弱毒疫苗的不同比例混合接种的交叉保护效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卫星RNA在交叉保护中的应用 |
| 4.2 卫星RNA与弱毒疫苗的混合使用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 引物列表 |
| 附表2 质粒列表 |
| 致谢 |
（5）小麦K-TCMS育性转换相关基因的鉴定及lncRNA MSTRG.224114调控其育性转换的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物温敏雄性不育及其研究进展 |
| 1.1.1 植物雄性不育类型 |
| 1.1.2 植物温敏雄性不育的原因 |
| 1.1.3 植物温敏雄性不育相关基因的研究进展 |
| 1.2 与雄蕊发育相关的基因家族研究进展 |
| 1.2.1 HSF基因家族与植物雄性不育 |
| 1.2.2 PG基因家族与植物雄性不育 |
| 1.2.3 INV基因家族与植物雄性不育 |
| 1.3 植物非编码基因与育性调控 |
| 1.3.1 lncRNA的特征和分类 |
| 1.3.2 lncRNA的作用模式 |
| 1.3.3 植物miRNA的生物合成 |
| 1.3.4 miRNA的作用机制 |
| 1.3.5 植物lncRNA和 miRNA参与雄性育性调控的研究进展 |
| 1.4 植物miRNA408 与雄性育性调控 |
| 1.4.1 植物miR408 的研究基础 |
| 1.4.2 植物miR408 在育性调控方面的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.5.1 目的意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 基因家族系统分析鉴定KTM3315A育性转换相关候选基因 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 全基因组鉴定小麦HSF、PG、INV家族成员 |
| 2.2.2 小麦HSF、PG、INV三家族的系统发育分析 |
| 2.2.3 基因家族的重复事件分析 |
| 2.2.4 基因结构和氨基酸保守结构域鉴定 |
| 2.2.5 启动子顺式作用元件识别、基因GO功能注释、蛋白互作网络分析 |
| 2.2.6 小麦HSF、PG、INV三家族成员的RNA-seq分析 |
| 2.2.7 穗特异性基因的荧光定量PCR验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小麦HSF基因家族的系统分析 |
| 2.3.2 小麦PG基因家族的系统分析 |
| 2.3.3 小麦INV基因家族的系统分析 |
| 2.3.4 小麦HSF、PG和 INV基因家族中育性相关基因的鉴定 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 2.4.1 小麦HSF、PG、INV基因家族的扩张与全基因组复制密切相关 |
| 2.4.2 串联重复揭示PG和INV基因的非剂量敏感特征 |
| 2.4.3 TaHsf A2 可能通过调节HSP70 的表达影响小麦花药发育 |
| 2.4.4 四个TaPG可能参与小麦花药发育的三个关键过程 |
| 2.4.5 TaCWINV受温度调控通过影响绒毡层功能 |
| 第三章 lncRNA-seq揭示KTM3315A育性转换相关候选lncRNA |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 RNA的提取、检测和文库构建及测序 |
| 3.2.2 原始数据的质控和过滤 |
| 3.2.3 测序数据的比对和组装 |
| 3.2.4 转录本的定量和差异表达分析 |
| 3.2.5 鉴定lncRNA |
| 3.2.6 预测lncRNA靶基因 |
| 3.2.7 差异表达lncRNA靶基因的功能注释和富集分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 KTM3315A中 lncRNA的全局鉴定 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA的鉴定 |
| 3.3.3 差异表达lncRNA的功能预测 |
| 3.3.4 雄性育性相关候选基因的互作lncRNA鉴定 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.4.1 lncRNA的分类是功能研究的基础 |
| 3.4.2 KEGG通路的富集有助于推测lncRNA的功能 |
| 3.4.3 lncRNA MSTRG.224114 具有多个trans靶基因 |
| 第四章 lncRNA MSTRG.224114和TaCWINV53对KTM3315A育性调控的功能验证 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 目的基因克隆和分析 |
| 4.2.2 大麦条纹花叶病毒侵染小麦 |
| 4.2.3 目的蛋白的GFP亚细胞定位 |
| 4.2.4 基因的启动子分析和GUS组织定位 |
| 4.2.5 lncRNA的结构分析 |
| 4.2.6 lncRNA的显色原位杂交 |
| 4.2.7 目的基因的功能验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 MSTRG.224114和TaCWINV53 的克隆 |
| 4.3.2 MSTRG.224114 的结构分析 |
| 4.3.3 MSTRG.224114在KTM3315A花药中的表达位置分析 |
| 4.3.4 TaCWINV53 的亚细胞定位 |
| 4.3.5 TaCWINV53 的组织定位和启动子分析 |
| 4.3.6 TaCWINV53和MSTRG.224114 的功能验证 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 4.4.1 MSTRG.224114 可能是Ta CWINV53 的转录增强子 |
| 4.4.2 TaCWINV53 可能响应光照、温度和干旱胁迫 |
| 4.4.3 BSMV:TaCWINV53和BSMV:MSTRG.224114 通过干扰绒毡层功能影响花药育性 |
| 第五章 TaCWINV53 通过抑制tae-miR408 调控KTM3315A雄性育性的功能解析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 预测互作miRNA |
| 5.2.2 候选miRNA的表达量分析 |
| 5.2.3 候选miRNA的过表达功能验证 |
| 5.2.4 miRNA与 mRNA的互作鉴定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 TaCWINV53 的互作miRNA预测 |
| 5.3.2 tae-miR408 的前体序列克隆 |
| 5.3.3 tae-miR408 的过表达功能验证 |
| 5.3.4 TaCWINV53与tae-miR408 的互作验证 |
| 5.3.5 tae-miR408 的靶基因鉴定和分析 |
| 5.3.6 MSTRG.224114 联合多分子调控KTM3315A雄性育性的机制模型构建 |
| 5.4 讨论与结论 |
| 5.4.1 tae-miR408 的过表达依赖于Dicer酶的识别剪切 |
| 5.4.2 TaCWINV53和tae-miR408 存在双向调控 |
| 5.4.3 蓝铜蛋白的下调导致BSMV:MSTRG.224114 花粉内壁异常 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 略缩词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）烟草曲茎病毒伴随卫星编码βC1蛋白增强病毒症状功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 烟草曲茎病毒简介 |
| 2 双生病毒卫星研究进展 |
| 3 RNA沉默及RNA沉默抑制子 |
| 3.1 RNA沉默研究简介 |
| 3.2 DCL、AGO、RDR基因 |
| 3.3 RNA沉默抑制子 |
| 3.4 植物病毒沉默抑制子的作用机理 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 TbCSBβC1表达对TbCSV症状和积累量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源、供试寄主与试剂 |
| 1.2 病毒基因组序列分析 |
| 1.3 菌株活化与PCR菌检 |
| 1.4 农杆菌浸润接种 |
| 1.5 PVX-βC1载体构建 |
| 1.6 PVX-ΔβC1载体构建 |
| 1.7 转βC1基因植株构建 |
| 1.8 本氏烟总DNA提取(CTAB法) |
| 1.9 本氏烟总RNA提取(TRizol法) |
| 1.10 反转录合成第一条链 |
| 1.11 RT-qPCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TbCSBβC1与其它病毒βC1的同源性分析 |
| 2.2 TbCSBβC1与其它病毒βC1的氨基酸和核苷酸的差异序列分析 |
| 2.3 病毒症状观察和病毒积累量检测 |
| 2.4 PVX介导βC1在本氏烟中过表达检测 |
| 2.5 在本氏烟上接种PVX-ΔβC1症状观察和病毒积累量检测 |
| 2.6 在转基因植株中过表达βC1影响植株症状形成和病毒积累 |
| 3 讨论 |
| 第三章 TbCSBβC1与TbCSV及寄主因子互作分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 载体构建 |
| 1.3 亚细胞定位的荧光观察 |
| 1.4 Y2H验证βC1与C2互作 |
| 1.5 BiFC验证互作 |
| 1.6 酵母双杂交文库筛选 |
| 1.7 构建候选蛋白Y2H载体 |
| 1.8 Y2H验证筛选候选蛋白与靶蛋白互作 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Y2H验证βC1与C2的互作 |
| 2.2 BiFC验证βC1与C2的互作 |
| 2.3 βC1的亚细胞定位及与C2的共定位分析 |
| 2.4 筛选与TbCSBβC1互作蛋白 |
| 2.5 相关基因表达量检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 TbCSBβC1作为VSR对RNAi相关基因表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 本氏烟总RNA提取(TRizol法) |
| 1.3 转录合成第一条链 |
| 1.4 RT-qPCR |
| 1.5 定量数据的处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒侵染后RNAi途径相关基因表达量检测 |
| 2.2 PVX介导βC1表达后RNAi途径相关基因积累量检测 |
| 2.3 转βC1基因植株RNAi途径相关基因积累量检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 本论文所用缩写词及中英文对照 |
| B 本论文常用试剂及配制 |
| C 本论文所用常规实验仪器 |
| 致谢 |
（7）水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的研究概况 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生与危害 |
| 1.1.2 水稻条纹病毒的基因组结构 |
| 1.1.3 水稻条纹病毒编码的蛋白及功能 |
| 1.1.4 水稻条纹病毒与寄主植物的互作 |
| 1.1.4.1 转录水平的调控 |
| 1.1.4.2 蛋白水平互作 |
| 1.1.5 抗RSV水稻育种策略 |
| 1.2 植物Ferredoxins蛋白研究进展 |
| 1.2.1 植物Ferredoxins蛋白的发现与命名 |
| 1.2.2 植物FDs的分类与结构 |
| 1.2.3 植物FDs的生物学功能 |
| 1.2.3.1 植物FDs与光合作用 |
| 1.2.3.2 植物FDs依赖的叶绿体代谢过程 |
| 1.2.3.3 植物FDs与植物病毒 |
| 1.2.4 植物FDs的表达调控 |
| 1.2.4.1 光照影响植物FDs的表达 |
| 1.2.4.2 胁迫条件下植物FDs的表达 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 RNA测序 |
| 1.3.2 小RNA |
| 1.3.2.1 小RNA的研究方法 |
| 1.3.2.2 病毒来源的si RNA研究 |
| 1.3.3 降解组测序 |
| 1.4 脱落酸与植物病毒 |
| 1.4.1 ABA的生物合成、信号转导以及响应基因 |
| 1.4.1.1 脱落酸的生物合成与代谢 |
| 1.4.1.2 脱落酸的信号转导 |
| 1.4.1.3 ABA响应基因及其bZIP转录因子 |
| 1.4.2 脱落酸与植物抗病毒反应 |
| 1.4.2.1 病毒侵染与ABA积累 |
| 1.4.2.2 ABA参与的抗病毒反应 |
| 2 FD1 参与植物抵抗RSV侵染过程 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料及毒源 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 本氏烟及水稻接种RSV |
| 2.2.2 叶片总RNA提取 |
| 2.2.3 RNA逆转录 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 RNA杂交 |
| 2.2.6 植物组织蛋白提取 |
| 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.2.8 Western blotting实验流程 |
| 2.2.9 载体构建 |
| 2.2.10 TRV介导的基因沉默 |
| 2.2.11 农杆菌浸润 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RSV侵染下调水稻FD1(Os FD1)表达 |
| 2.3.2 RSV侵染下调本氏烟FD1(NbFD1)表达 |
| 2.3.3 NbFD1 沉默有利于RSV在接种叶片中的积累 |
| 2.3.4 转NbFD1 基因超表达本氏烟抑制RSV侵染 |
| 2.3.5 转OsFD1 基因水稻对RSV抗性增强 |
| 2.4 讨论 |
| 3 vsi R45349 转录后水平调控寄主FD1 的表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 试验所用试剂及软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小RNA建库与测序 |
| 3.2.2 小RNA测序数据分析 |
| 3.2.3 降解组建库与测序 |
| 3.2.4 降解组测序数据处理与分析 |
| 3.2.5 降解组数据筛选 |
| 3.2.6 小RNA Northernblot |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RSV来源的vsi RNAs分析 |
| 3.3.2 一个来自RSV vRNA1的5’端热点区域的小RNA与 NbFD1 存在互补 |
| 3.3.3 含vsi R45349的RSV序列表达下调本氏烟NbFD1 转录本丰度 |
| 3.3.4 miR319-vis R45349 导致NbFD1 转录本下调 |
| 3.3.5 降解组证实RSV侵染后NbFD1 转录本的切割位点 |
| 3.4 讨论 |
| 4 RSV诱导的ABA抑制FD1 转录 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 试验所用试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 本氏烟及水稻FD1 启动子结构分析 |
| 4.2.2 激素处理 |
| 4.2.3 ABA含量测定 |
| 4.2.4 转录因子预测 |
| 4.2.5 NbFD1 启动子及突变体构建 |
| 4.2.6 酵母单杂株系构建 |
| 4.2.7 酵母单杂交 |
| 4.2.8 双荧光素酶实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NbFD1 启动子序列分析 |
| 4.3.2 类胡萝卜素生物合成途径在RSV侵染本氏烟中差异表达 |
| 4.3.3 RSV侵染诱导寄主体内ABA的积累 |
| 4.3.4 外施ABA降低NbFD1 转录本丰度 |
| 4.3.5 ABA抑制NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.6 调控NbFD1 的转录因子预测及分析 |
| 4.3.7 ABI5 负调控NbFD1 转录水平的表达 |
| 4.3.8 ABI5 参与到ABA对 NbFD1 转录水平调控过程 |
| 4.3.9 NbFD1 启动子及ABRE突变体酵母单杂交菌构建 |
| 4.3.10 NbABI5 结合到NbFD1 启动子序列中的ABRE元件 |
| 4.3.11 NbABI5 抑制NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.12 NbABI5 沉默提高NbFD1 启动子活性 |
| 4.3.13 NbABI5对NbFD1 启动子活性的调控依赖ABRE元件 |
| 4.3.14 水稻OsFD1 启动子序列分析 |
| 4.3.15 调控OsFD1 表达转录因子预测 |
| 4.3.16 RSV侵染诱导水稻中ABA的积累及OsABI5s转录水平高表达 |
| 4.3.17 ABA处理诱导OsABI5s并抑制OsFD1 转录水平表达 |
| 4.3.18 水稻生长发育中OsABI5s和 OsFD1 的表达谱分析 |
| 4.3.19 OsABI5s抑制OsFD1 启动子活性 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文总结和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ本文所使用引物列表 |
| 附录 Ⅱ术语缩写词及中英文对照 |
| 附录 Ⅲ实验中常用培养基以及缓冲液配方 |
（8）Wheat yellow mosaic virus NIb蛋白与寄主因子TaLIP互作及其对病毒侵染的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦黄花叶病研究进展 |
| 1.1.1 小麦黄花叶病 |
| 1.1.2 小麦黄花叶病危害以及防治 |
| 1.2 小麦黄花叶病毒(WYMV)研究进展 |
| 1.2.1 小麦黄花叶病毒(WYMV)简介 |
| 1.2.2 WYMV基因组 |
| 1.2.3 WYMV的传播方式 |
| 1.2.4 WYMV编码的蛋白功能简介 |
| 1.3 NIb蛋白的研究进展 |
| 1.4 Fibrillin家族研究概况 |
| 1.4.1 Fibrillin的历史 |
| 1.4.2 FBN基因的表达特异性 |
| 1.4.2.1 组织特异性表达 |
| 1.4.2.2 植物生长和发育调控表达 |
| 1.4.2.3 植物激素调控表达 |
| 1.4.2.4 生物胁迫调控表达 |
| 1.4.2.5 非生物胁迫调控表达 |
| 1.4.3 FBN蛋白的定位 |
| 1.4.3.1 有色体 |
| 1.4.3.2 叶绿体 |
| 1.4.3.3 油质体和黄化质体 |
| 1.4.3.4 绿藻叶绿体眼点 |
| 1.5 本文的研究意义 |
| 2 酵母双杂交筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 基因扩增与纯化 |
| 2.2.2.3 构建克隆载体 |
| 2.2.2.4 重组载体BK-NIb的构建 |
| 2.2.2.5 酵母双杂交共转法筛库 |
| 2.2.2.6 酵母质粒提取 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 克隆载体以及诱饵载体p GBK-NIb的构建 |
| 2.3.2 与WYMV NIb互作的寄主因子的获得 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 TaLIP基因的分类地位以及启动子分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.0 引物设计 |
| 3.2.2.1 利用TRIzol法提取小麦总RNA |
| 3.2.2.2 RT-PCR获得小麦c DNA |
| 3.2.2.3 基因片段扩增纯化 |
| 3.2.2.4 连接 |
| 3.2.2.5 转化大肠杆菌 |
| 3.2.3 同源性比对以及进化树分析 |
| 3.2.4 启动子区顺式响应元件预测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TaLIP克隆载体的构建 |
| 3.3.2 序列同源性比对 |
| 3.3.3 进化树分析以及启动子分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 WYMV NIb与 TaLIP互作验证以及亚细胞定位 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 引物设计 |
| 4.2.2.2 载体构建 |
| 4.2.2.3质粒转化农杆菌GV3101 |
| 4.2.2.4 农杆菌阳性克隆筛选 |
| 4.2.2.5 农杆菌浸润接种 |
| 4.2.2.6 共聚焦激光显微镜观察荧光 |
| 4.2.2.7 酵母双杂交验证互作 |
| 4.2.2.8 亚细胞定位以及双分子荧光互补 |
| 4.2.2.9 免疫共沉淀及western bolt检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TaLIP与 NIb酵母互作分析 |
| 4.3.2 TaLIP与 NIb植物体内互作分析 |
| 4.3.3 NIb与 TaLIP的亚细胞定位及双分子荧光互补分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 5 TaLIP与 WYMV侵染的关系 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 引物设计 |
| 5.2.2.2 荧光实时定量PCR检测 |
| 5.2.2.3 Barley stripe mosaic virus(BSMV)介导的基因沉默 |
| 5.2.2.4 外源喷施ABA处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 感染WYMV的小麦中TaLIP的 m RNA水平下调 |
| 5.3.2 沉默TaLIP有利于WYMV的侵染 |
| 5.3.3 TaLIP表达受ABA诱导且沉默TaLIP会抑制ABA信号通路 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 辣椒轻斑驳病毒的研究进展 |
| 1.1.1 辣椒轻斑驳病毒的发生及危害 |
| 1.1.2 辣椒轻斑驳病毒的基因组结构与致病型 |
| 1.1.3 辣椒轻斑驳病毒对生态环境及人体健康的影响 |
| 1.2 RNA沉默机制的核心组分 |
| 1.2.1 DCL蛋白 |
| 1.2.2 AGO蛋白 |
| 1.2.3 RDR蛋白 |
| 1.3 植物内源小RNA的生物合成与调控 |
| 1.3.1 microRNA的来源与生物合成 |
| 1.3.2 siRNA的来源与生物合成 |
| 1.3.3 tasiRNA与 phasiRNA的生物合成 |
| 1.3.4 RNA剪接与RNA降解 |
| 1.4 植物中的抗病毒RNA沉默机制 |
| 1.4.1 病毒诱导的siRNA的来源与生物合成 |
| 1.4.2 DCL蛋白在vsiRNA产生中的作用 |
| 1.4.3 AGO和 RDR蛋白在vsiRNA产生中的作用 |
| 1.4.4 病毒对RNA沉默的抑制和植物的反抑制 |
| 1.5 细胞自噬与植物病毒侵染的研究进展 |
| 1.5.1 植物中的细胞自噬 |
| 1.5.2 植物病毒与自噬的关系 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组酶聚合酶扩增技术快速检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试病毒 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 病毒接种 |
| 2.1.4 植物叶片总RNA提取 |
| 2.1.5 反转录反应 |
| 2.1.6 PCR反应 |
| 2.1.7 RPA反应 |
| 2.1.8 RPA产物试剂盒纯化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RT-RPA反应条件优化 |
| 2.2.2 RT-RPA反应特异性检测 |
| 2.2.3 RT-RPA反应灵敏度检测 |
| 2.2.4 RT-RPA反应田间样品检测 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 PMMoV侵染辣椒产生的vsiRNA的特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒和载体 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 病毒接种 |
| 3.1.5 植物总RNA提取 |
| 3.1.6 反转录反应(用于qPCR) |
| 3.1.7 实时荧光定量RT-PCR |
| 3.1.8 miRNA提取 |
| 3.1.9 PCR反应 |
| 3.1.10 PCR产物回收 |
| 3.1.11 连接和转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高通量测序的流程 |
| 3.2.2 vsiRNA的尺寸分布 |
| 3.2.3 vsiRNA5'末端碱基偏好性和正负链偏好性 |
| 3.2.4 vsiRNA在 PMMoV基因组上的分布 |
| 3.2.5 vsiRNA靶标的预测和分析 |
| 3.2.6 PMMoV侵染辣椒后主要RNA沉默途径组分的差异表达 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 PMMoV侵染辣椒后miRNA的表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 辣椒小RNA的高通量测序 |
| 4.2.2 辣椒中已知miRNA的表达 |
| 4.2.3 测序文库中新miRNA的预测 |
| 4.2.4 新miRNA靶标的预测及功能分析 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 PMMoV侵染辣椒后的转录组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒源和植物材料 |
| 5.1.2 主要仪器及试剂 |
| 5.1.3 转录组测序 |
| 5.1.4 转录组数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转录组测序总体分析 |
| 5.2.2 基因差异表达分析 |
| 5.2.3 差异表达基因GO分类富集分析 |
| 5.2.4 KEGG富集分析 |
| 5.2.5 qRT-PCR对转录组数据的验证 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 细胞自噬抑制PMMoV侵染的分子机制研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 质粒载体与菌种 |
| 6.1.3 主要仪器与试剂 |
| 6.1.4 PCR反应 |
| 6.1.5 酶切反应 |
| 6.1.6 PCR及酶切产物回收 |
| 6.1.7 目的片段与载体的连接 |
| 6.1.8 质粒DNA的提取 |
| 6.1.9 农杆菌感受态的转化 |
| 6.1.10 农杆菌浸润介导的瞬时表达 |
| 6.1.11 Western blot检测 |
| 6.1.12 激光共聚焦显微镜观察 |
| 6.1.13 酵母双杂交实验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 表达载体的构建 |
| 6.2.2 PMMoV侵染诱导辣椒中自噬基因的上调表达 |
| 6.2.3 PMMoV侵染诱导本生烟的自噬途径 |
| 6.2.4 抑制自噬可以增加PMMoV RNA的积累 |
| 6.2.5 沉默自噬基因的表达增强了PMMoV的侵染 |
| 6.2.6 PMMoV与自噬途径互作蛋白的筛选 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第七章 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）烟草NtRBP45在烟草花叶病毒侵染寄主过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 烟草花叶病毒概述 |
| 1.1.1 烟草花叶病毒的发现及危害 |
| 1.1.2 烟草花叶病毒的分子生物学研究 |
| 1.1.3 烟草与烟草花叶病毒的互作研究 |
| 1.1.4 症状 |
| 1.1.5 扩散与传播 |
| 1.1.6 检测技术 |
| 1.1.7 防治手段 |
| 1.2 RNA结合蛋白 |
| 1.2.1 RBPs的结构 |
| 1.2.2 RBPs的功能 |
| 1.2.3 RBP45 的研究进展 |
| 1.3 RNA沉默 |
| 1.3.1 RNA沉默途径 |
| 1.3.2 RNA沉默与植物病毒 |
| 1.4 本研究的立题依据、研究目的和意义 |
| 第2章 TMV侵染普通烟草对Nt RBP45 表达影响的分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物 |
| 2.1.2 供试毒源 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用实验仪器 |
| 2.1.5 分析软件 |
| 2.1.6 RT-qPCR引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒接种 |
| 2.2.2 RNA的提取 |
| 2.2.3 反转录合成c DNA |
| 2.2.4 RT-qPCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同时间段烟草总RNA提取 |
| 2.3.2 NtRBP45在TMV侵染烟草中的转录表达分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 NtRBP45 亚细胞定位及生物学功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试植物 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 培养基及其他溶液 |
| 3.1.5 常用实验仪器 |
| 3.1.6 数据库及分析软件 |
| 3.1.7 PCR引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 NtRBP45 基因的克隆及鉴定 |
| 3.2.2 植物表达载体的构建 |
| 3.2.3 农杆菌转化 |
| 3.2.4 农杆菌浸润法侵染本氏烟 |
| 3.2.5 观察亚细胞定位 |
| 3.2.6 DAB染色 |
| 3.2.7 植物总RNA的提取 |
| 3.2.8 小RNA的分离提取 |
| 3.2.9 mRNA Northern blot |
| 3.2.10 siRNA Northern blot |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NtRBP45 的克隆与生物信息学分析 |
| 3.3.2 NtRBP45 亚细胞定位的分析 |
| 3.3.3 NtRBP45 影响H2O2 积累的分析 |
| 3.3.4 NtRBP45 促进RNA沉默的分析与验证 |
| 3.3.5 NtRBP45 突变体瞬时侵染对RNA沉默的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 转NtRBP45 植物的制备与抗病性初步分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试植物 |
| 4.1.2 菌株和载体 |
| 4.1.3 主要试剂(盒) |
| 4.1.4 培养基及其他溶液 |
| 4.1.5 常用仪器 |
| 4.1.6 PCR引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转基因植物表达载体的构建 |
| 4.2.2 转化农杆菌 |
| 4.2.3 农杆菌蘸花法转化拟南芥 |
| 4.2.4 转基因拟南芥的筛选 |
| 4.2.5 转基因拟南芥的鉴定 |
| 4.2.6 叶盘法转化本氏烟 |
| 4.2.7 转基因本氏烟的鉴定 |
| 4.2.8 接种Pst DC3000?HopQ1 于转基因本氏烟 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因载体的构建 |
| 4.3.2 过表达NtRBP45 转基因本氏烟的制备与抗病性分析 |
| 4.3.3 过表达NtRBP45 转基因拟南芥的制备 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 全文主要结论及展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.1.1 TMV侵染烟草引发NtRBP45 上调表达 |
| 5.1.2 NtRBP45 亚细胞定位及生物学功能分析 |
| 5.1.3 转NtRBP45 植物的制备与抗病性初步分析 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、黄瓜花叶病毒反义2b基因构建及其转基因初步研究（论文参考文献）
- [1]基于黄瓜花叶病毒构建双联和三联弱毒疫苗的研究[D]. 张雅雯. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗载体构建及突变修复机理研究[D]. 刘珊珊. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]基于黄瓜花叶病毒的多联弱毒疫苗创制及接种方案优化[D]. 姜文筱. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]卫星RNA对黄瓜花叶病毒弱毒疫苗交叉保护作用的效应[D]. 庞欢. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]小麦K-TCMS育性转换相关基因的鉴定及lncRNA MSTRG.224114调控其育性转换的功能解析[D]. 叶佳丽. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]烟草曲茎病毒伴随卫星编码βC1蛋白增强病毒症状功能初步研究[D]. 刘晓倩. 西南大学, 2021(01)
- [7]水稻条纹病毒调控寄主Ferredoxin 1基因表达的机制研究[D]. 崔维军. 浙江大学, 2021(01)
- [8]Wheat yellow mosaic virus NIb蛋白与寄主因子TaLIP互作及其对病毒侵染的影响[D]. 张天烨. 浙江农林大学, 2020(02)
- [9]PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究[D]. 焦裕冰. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [10]烟草NtRBP45在烟草花叶病毒侵染寄主过程中的功能研究[D]. 朱宗财. 塔里木大学, 2020(10)