一、酶催化生产生化级表面活性剂(英文)（论文文献综述）
裴壮壮[1]（2021）在《N-月桂酰基谷氨酸钠的水相合成过程研究》文中进行了进一步梳理N-月桂酰基谷氨酸钠（SLG）是一种生物质来源的表面活性剂,其原料月桂酸和谷氨酸钠来源广泛、价格低廉,产品具有优良的表面活性、低毒性、低刺激性和很好的生物降解性,因而近年来被越来越多地应用在日化产品中。早期少量合成SLG时,主要采用月桂酰氯与谷氨酸钠在有机溶剂/水混合溶剂中的肖顿–鲍曼缩合反应,混合溶剂体系反应速率快、传质传热效率高且水解反应副产物月桂酸钠（SLA）少;但使用有机溶剂带来有机挥发物（VOC）水平高、安全性差和溶剂回收成本高等缺陷。近年来随着环境保护要求提高和绿色化学的发展,大量生产SLG时多采用水相法肖顿–鲍曼缩合工艺,可使生产过程绿色化并降低生产成本;但水相法肖顿–鲍曼缩合工艺中月桂酰氯与水相的非均相性使反应速率变慢、传质传热效率降低,导致产品中SLA含量增高,这些已成为发展水相法工艺亟待解决的瓶颈问题。本文将研究在水相法肖顿–鲍曼缩合工艺中,通过强化过程的传质传热以克服原料非均相性带来的上述问题。首先建立了SLG产品中各种活性物质的一次性定量分析方法,以便快速分析产品成分,不仅能控制反应过程、确定产品技术指标,而且能分析其中除SLG以外的其它可能副产物,为水相法工艺调优提供评价方法。其次在釜式反应器中优化工艺参数,考察水相中肖顿–鲍曼缩合反应的内在规律以及影响因素,为水相法合成SLG的过程研究提供技术参数。进而搭建一套泵式反应–釜式老化的串联装置进行过程强化研究,试图适应水相工艺的快反应–慢平衡特点;通过高速剪切、调整原料微观和宏观混合方式等改善传质措施,以及调整物料比、物料在线冷却方式等改善传热措施,共同克服水相法工艺中传质传热效率低、反应速率慢等导致产品中SLA含量增高的弊端。最后测定了该工艺及优化工艺条件下获得的SLG产品的应用性能,与目前市售产品进行对比。本文研究范围内得到的主要结果及结论如下:（1）首次报导了水相法肖顿–鲍曼缩合工艺合成的SLG产品中含表面活性物质N-月桂酰谷氨酰谷氨酸钠（SLGG）,并通过UPLC-MS、FT-IR和1H-NMR鉴定其结构。该发现对水相中合成脂肪酰基氨基酸型表面活性剂的工艺研究、产品品质控制以及产品应用性能研究等均有重要的理论意义和实践价值。（2）建立了反相高效液相色谱偶联示差折光检测器的方法,能够快速同时定量分析SLG、SLGG和SLA。结果表明,采用WondaCract ODS-2 C18色谱柱,甲醇、水和甲酸混合流动相能使SLG、SLGG和SLA达到基线分离,且线性相关系数均高达0.9999,平均加标回收率分别为99.82%、99.56%和98.91%,相对标准偏差分别为0.84%、1.65%和1.22%。该法可实现SLG产品中各种活性物的快速同时准确定量分析,可用于水相法工艺的产品指标评价和反应过程监控。（3）在釜式反应器中基于传质传热效应和原料特性,优化了搅拌速率、物料浓度、加料速率、投料比、反应温度及pH等工艺参数,研究水相中肖顿–鲍曼缩合工艺的内在规律。结果表明,高物料浓度、谷氨酸二钠溶液对应的体系pH和适宜的搅拌速率和加料速率利于SLG的生成,得到优化工艺条件为搅拌速率400～600 r·min-1、谷氨酸钠初始浓度50 wt.%、碱液浓度30 wt.%、酰氯加料速率1.5 g·min-1、谷氨酸钠与酰氯投料比1.2、反应温度15℃和pH 12.0,此时SLG、SLGG和SLA的产率分别为68.01%、10.92%和21.07%。（4）在泵式反应–釜式老化的串联装置中,利用泵式反应器的高剪切力偶联宏观搅拌改善传质,通过调整物料比、物料在线冷却方式改善传热。通过强化传质和传热的研究,最终得到产品SLG、SLGG和SLA的产率分别为74.14%、7.54%和18.32%,SLG产率较釜式反应器和市售产品分别提高了6.13%和12.10%,SLGG的产率分别降低了3.38%和3.61%,SLA的产率分别降低了2.75%和8.48%。表明强化水相法工艺的传质和传热有利于促进SLG的生成,并抑制副反应的发生,具有提高水相法肖顿–鲍曼缩合工艺合成SLG产品品质的潜能,同时也可提升水相法的工艺效率,获得的40%固含量的产品性状稳定,更便于应用。（5）测定了SLG的性质,并对比了SLG、优化产品和市售产品的应用性能。结果表明,SLG二羧基结构致其性质和应用性能具有pH依赖性。在pH 6.0时,优化产品的泡沫力、乳化力、润湿力和去污力均优于市售产品。
胡博淳[2]（2021）在《番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究》文中指出环氧化物水解酶（Epoxide hydrolases,EHs）能够催化环氧化物进行动力学拆分或归一性水解反应,制备光学纯的环氧化物或其相应邻二醇。手性环氧化物和邻二醇作为高附加值的中间体,可以用来合成多种具有复杂生物活性的化合物,在医药领域发挥重要作用,带来了可观的经济效益。相应地,这些高价值中间体的应用加速了EHs催化领域的研究进程。然而,目前EHs的研究存在一些如底物广谱性差、立体选择性不理想等问题。为了改善这些问题,在催化制备手性环氧化物及邻二醇时提供更多的理想选择,本课题首先在生物信息学分析的基础上,从番茄中克隆并异源表达了两种EHs;其次分别测定了它们的基本酶学性质和底物谱特征;最后根据其各自在底物谱测定时所发现的问题,进行了深入的研究,研究结果如下:（1）在生物信息学分析的基础上,从番茄中克隆了两种EHs基因——sleh1和sleh2。它们编码了全长为321个氨基酸的蛋白质,分别为Sl EH1和Sl EH2,两者都属于α/β水解酶家族,是两种新型植物来源的EHs。对两种酶进行异源表达,构建了重组大肠杆菌——E.coli/sleh1和/sleh2,确定了其最适诱导温度、时长及IPTG的添加量,分别为25℃、8 h和0.05 m M。对两种酶进行纯化分析,发现Sl EH1的最适反应p H在7.0～7.5之间,在p H 6.5～8.5的范围或温度40℃以下时催化表现稳定。（2）从Sl EH1和Sl EH2对不同底物的催化活性、对映选择性和区域选择性等方面,分析了两种酶在合成手性环氧化物及其邻二醇方面的应用潜力。Sl EH1对rac-对氯环氧苯乙烷（2a）的对映选择性（E值>200）是迄今为止所发现的EHs中最高的,并且对rac-1,2-环氧辛烷（11a）表现出了归一性水解的潜力,其催化生成的产物（R）-1,2-辛二醇（11b）的eep值为51.3%。Sl EH2则对rac-环氧苯乙烷（1a）表现出了归一性水解的特性——其催化20 m M的rac-1a水解,最终得到（R）-1,2-苯乙二醇（1b）的eep值为87.1%,产率高达94.4%。（3）对Sl EH1进行分子改造,提高其催化rac-11a的αS值,从而提高其产物的eep值。在Sl EH1与（S）-11a对接模拟基础上,选择了Sl EH1的底物结合口袋中10个拟突变位点。构建并筛选一系列的突变酶,最终选出了最优的——Sl EH1W106T/F189L,其αS值从55.3%大幅度提高至96.7%,催化归一性合成（R）-11b的eep值从51.3%提高至95.4%。使用E.coli/sleh1W106T/F189L在24 h内可催化400 m M（51.3 g/L）rac-11a有效水解,生成（R）-11b的eep为94.7%、产率为95.6%。对Sl EH1W106T/F189L进行底物谱分析,其合成（R）-1,2-葵二醇（12b）的eep从9.5%提高到了83.0%;合成（R）-1,2-二醇-7-辛烯（14b）的eep高达97.4%。（4）为了提高E.coli/sleh2全细胞归一性水解rac-1a的最大底物加载量,对其反应媒介进行了优化。通过构建并筛选一系列的反应媒介,最终发现,E.coli/sleh2在30%（vs/vb）吐温-20/磷酸缓冲液反应媒介中,可将rac-1a有效水解的加载量从200 m M提高至400 m M。在该反应体系中对（R）-1b进行克级规模制备,最终可得到（R）-1b（eep=96.2%）的产率为97.2%。并且30%（vs/vb）吐温-20/磷酸缓冲液媒介具有良好的广谱性,可以分别使E.coli/pveh1Z6催化350 m M的rac-间氯环氧苯乙烷的转化率从44.9%提高到>99%;E.coli/rpehL360C催化500 m M的rac-间硝基环氧苯乙烷的转化率从67.7%提高到>99%。
张超[3]（2021）在《构建生产三碳化合物的大肠杆菌细胞工厂》文中进行了进一步梳理在结构最简单的三碳类化合物中,二羟基丙酮（DHA）和甘油酸（GA）是两种重要的化合物。它们作为有机化合物合成中间体和多功能化合物,被用于各种行业中,国内外市场需求正逐年增长。二羟基丙酮具有多种工业用途,例如在化妆品行业中用作鞣剂,在饲料中作为添加剂。随着绿色环保理念被提出,通过微生物发酵生产将为工业化生产DHA提供可持续发展的选择。本研究中,我们对大肠杆菌（E.coli）进行代谢工程改造,使其可以以葡萄糖为碳源生产二羟基丙酮。本研究中构建工程菌株主要步骤包括:1)表达Corynebacterium glutamicum来源的脱磷酸酶（CghdpA）基因,将积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）转化为DHA;2)缺失大肠杆菌自身的磷酸三糖异构酶（TpiA）基因来积累DHAP,作为生产DHA的前体;3)敲除甲基乙醛合成酶（MgsA）基因,减少有毒物质甲基乙二醛的合成,使得DHAP专用于生产DHA,以提高DHA产量,改造后获得DHA生产底盘菌TZ-222。使用5%Glucose M9培养基,对底盘菌进行摇瓶发酵验证,经发酵72 h共获得8.00±0.11 g/L二羟基丙酮,转化率为78%±0.002（mol/mol）。对底盘菌进一步优化改造,连续敲除醛缩酶（FsaA/B）、全局调控蛋白（ArcA）、甘油非特异性转运蛋白（Glp F）基因位点。最终获得生产工程菌株TZ-231,并对工程菌株进行发酵验证。通过摇瓶发酵48 h获得最大产量,达到17.46±0.07 g/L。使用5 L发酵罐进行放大发酵实验,培养至28 h共消耗葡萄糖59.07 g/L,获得二羟基丙酮最高产量29.3 g/L,转化率为91.27%。综上所述,我们展示了一种工程菌株生产DHA的有效平台。此外,将醛醇氧化酶（AldO）基因整合在已经构建的乙醇酸底盘菌（TZ-108）基因组中,并使用强启动子（T7启动子）,获得生产光学纯的D-甘油酸菌株TZ-110。进一步敲除D-葡萄糖-D-甘油酸磷酸化酶（Ycj M）基因,获得生产工程菌株TZ-112。使用5 L发酵罐进行放大发酵实验,以甘油为底物共发酵72 h,消耗169.589 g甘油,生产D-甘油酸73.52 g,转化率为37.75%。
张亚格[4]（2021）在《耐辐射异常球菌低温酯酶EstDR4的功能鉴定和分子改造》文中研究说明酯酶是一类能够催化各种酯键断裂和形成的酶,其结构通常由N端的盖子结构域和C端的α/β水解酶催化域组成。大多数酯酶具有一定的立体选择性、区域选择性以及广泛的底物谱,能够应用于多种工业领域,而冷适应性的酯酶因其低温活性而具有稳定产物以及节能环保的特点,因而在生物制药、生物修复以及低温洗涤等领域的应用受到广泛关注。极端微生物在自然进化中适应了高温、低温、高压等极端环境,是极端酶基因资源的优质来源。目前国内生产的酶制剂品种较为单一,不能满足工业需求,因而仍需要对具有特殊性能的优质酶资源进行开发。冷适应酶的低温活性依赖于结构的柔性,热稳定性普遍较差,不利于工业应用,因而对低温酶热稳定性的改良变得尤为重要。目前对酶稳定性的改造策略主要包括引入二硫键、氢键、盐桥、增加疏水作用力等方式,而在特定温度下酶的稳定性和柔性之间的平衡也是优化酶催化功能的关键。为了寻找适用于工业生产的酯酶,本课题拟从耐辐射异常球菌中克隆酯酶基因,通过分子生物学的方法改良特性,并探究其对杀虫剂等环境污染物的降解作用,从而为工业及环境用酯酶提供更多的选择。主要研究成果包括:1.从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans R1（D.radiodurans R1）的基因组中克隆了6条酯酶基因并构建大肠杆菌表达载体,经诱导表达后测定酯酶酶活并选择了活性最高的EstDR4进行进一步的研究。序列分析表明,EstDR4是细菌激素敏感型脂肪酶（HSL）家族的新成员,具有典型的盖子结构、催化三联体（Ser156-Asp253-His283）以及HSL家族特有的GGGX型氧阴离子洞。酶学性质分析表明,EstDR4能有效水解短链和中链对硝基苯酯底物（C2～C12）,并且具有一定的区域选择性和对映体选择性,对叔醇和苯酯也有一定的水解作用。EstDR4的最适温度和最适p H分别为30℃和8,EstDR4在0℃时表现出较高的催化活性,并且在10℃～40℃时表现出较高的稳定性,1小时后其剩余酶活仍保持在80%以上。此外,在Tween-80和Triton X-100的存在下,EstDR4的活性显着提高;2.对EstDR4的盖子结构域进行研究。对EstDR4盖子结构域进行去除和置换,分别获得突变体Δ35和Est2N,发现Δ35的酯酶活性大幅度降低,但是对长链底物的偏好增加,而Est2N的催化效率降低了63.82%,但是在40℃和50℃的半衰期增至野生型的2.09倍和1.69倍,热稳定性较野生型有所提高,对盖子结构域和催化域的相互作用残基进行分析,发现突变体Est2N的盖子结构能够产生更多的化学键和作用力使结构更为紧密,但造成了活性中心在溶剂中的过度暴露,因而造成催化效率和底物亲和力的下降。分子动力学模拟结果显示突变体Est2N与野生型相比RMSD值下降,盖子区域的RMSF值也显着降低,说明盖子结构的刚性增强导致了酶的热稳定性的提升;3.参照HSL家族嗜热酯酶的保守位点,对EstDR4活性中心附近的相关位点进行突变,获得稳定性提升的突变体S132A、T163A和Y285F,其中S132A在40℃和50℃的半衰期分别提升了44.29%和89.89%,T163A在40℃和50℃的半衰期分别提升了89.59%和119.11%,Y285F在40℃和50℃的半衰期分别提升了59.41%和65.79%,RMSD和Rg值的降低也证实了三个突变体的三维结构与野生型相比更稳定,分析发现稳定性增强的原因可能是突变体疏水核心的疏水作用力的增强,对132和163位点的饱和突变进一步证实了疏水作用力的提升会导致热稳定性上升,而丙氨酸对螺旋结构的稳定作用也发挥了较大的影响作用;4.通过对底物通道位阻进行分析和突变获得位阻减小的突变体M212V和M212G,底物特异性分析表明二者的底物范围均有扩大,但由于底物通道疏水作用力的减弱导致M212G催化效率的降低;通过对底物通道附近的α6及与其连接的一段loop区相关位点进行突变,获得稳定性提升的突变体F214W及S238D,对214和238位点进行饱和突变,获得催化效率和稳定性均有提高的突变体F214E和S238N,对突变位点的相互作用力分析发现稳定性的提升与额外形成的氢键和离子键有关,此外,214、238位点连接212位点共同维持底物通道和活性口袋的稳定,F214E能够与H191形成离子键而发生偏移,促使212位点的位阻变小,而S238N与R170形成多个额外的氢键造成loop的摆动和底物通道的变化可能是催化效率升高的原因;5.通过质谱定量的方法测定了EstDR4及突变体M212V、S132A、T163A、Y285F、F214E、S238N对四种杀虫剂（西维因、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯）和玉米赤霉烯酮的降解作用,研究发现EstDR4对所测的杀虫剂和毒素均有降解作用,对西维因、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和玉米赤霉烯酮的降解率依次降低。与野生型相比,突变体S238N对四种杀虫剂以及M212V对除了西维因以外的三种杀虫剂的降解率都有了6%～8%的提升,而稳定性升高的突变体S132A、T163A、Y285F、F214E对杀虫剂的降解未受到影响,这些进化为EstDR4在工业上的应用提供了促进作用。综上,本研究对耐辐射异常球菌来源的HSL家族酯酶EstDR4进行酶学性质分析,发现EstDR4是一种冷适应性、表面活性剂耐受性较好的碱性酯酶,具有一定的区域选择性和对映体选择性,并且对杀虫剂及玉米赤霉烯酮有一定的降解作用,在果蔬洗涤剂及生物修复方面具有良好的应用前景。此外,根据HSL家族酯酶特征,从疏水核心、loop的摆动以及通道位阻关系等多方面对EstDR4进行优化改造,确定了与酶热稳定性及底物偏好相关的关键位点,并获得了稳定性更高、催化效率更强、底物偏好更广泛的突变体,为同类蛋白的改造提供策略参考,并为进一步实现酶的工业应用做出贡献。
肖文静[5]（2021）在《生物改性及表面活性剂结合策略对玉米秸秆生物质转化效率的影响》文中研究表明随着能源危机问题的日益严峻,开发生物质能源成为缓解能源危机的必要举措。由于纤维素被半纤维素及木质素的交联包裹的特殊复杂结构,木质纤维素对纤维素酶的酶解抗性和纤维素酶利用率低成为限制纤维素生物质能源高效利用的两大主要瓶颈。因此,本课题从降低纤维素酶酶解抗性和提高纤维素酶利用率这两个方面开展系统性的研究。首先基于纤维素酶与木聚糖酶共表达酿酒酵母,研究了木聚糖酶和纤维素酶在木质纤维素生物转化过程中的协同作用;随后对生物改性玉米秸秆（Lac-CS）的生物转化效率进行评价,通过分析生物改性对玉米秸秆表面微观结构的影响,揭示了影响玉米秸秆纤维素酶解效率的结构关键因子;评价表面活性剂添加对生物转化的效果并探究其对纤维素酶的非特异性吸附的影响;最后,对生物改性与表面活性剂添加复合策略下的玉米秸秆生物转化效果进行评价。从实验室水平对生物质乙醇转化提供一种新的思路。全文主要研究内容与结果如下:1)纤维素酶和木聚糖酶协同促进木质纤维素向生物乙醇的转化。纤维素酶-木聚糖酶共表达酿酒酵母（INVSc-CBH-TS/CA）生物转化乙醇产量高于单独表达纤维素酶酿酒酵母,且纤维素酶与木聚糖酶协同作用能进一步提高生物转化乙醇产量。在120 h,INVSc-CBH-CA和INVSc-CBH-TS的乙醇产量分别为INVScCBH的1.7和2.1倍,分别是INVSc-CBH和INVSc-CA或INVSc-TS的乙醇产量之和的3.4倍和3.8倍,表明共表达菌株中纤维素酶和木聚糖酶的协同作用能够促进木质纤维素的生物转化效率。2)基于漆酶的生物改性促进玉米秸秆的酶解糖化和乙醇转化。玉米秸秆生物改性产物GC-MS检测中发现木质素结构单元相关化合物对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）和对香豆酸（p-coumaric acid）或间羟基肉桂酸（3-hydroxycinnamic acid）。FTIR结果显示生物改性导致底物中与木质素相关的官能团的变化,如甲基、亚甲基、酯基、甲氧基、芳香族骨架等,确认了漆酶对玉米秸秆中木质素组分的解聚作用。Lac-CS对比原始玉米秸秆具有更好的纤维素酶酶解效果和更高的生物转化乙醇产量。INVSc-CBH-TS以Lac-CS为底物进行同步糖化发酵（SSF）的乙醇产量在第四天为对照组的3.1倍。INVSc-CBH-CA以Lac-CS为底物进行SSF第六天乙醇产量为对照组的1.7倍。通过对微观结构的研究发现,Lac-CS的孔隙度、结晶度以及显微结构是影响酶解效果的关键性因素。Lac-CS酶解后上清中蛋白含量比对照组提高了0.208 mg/m L,但酶解糖产量为对照组的3.49倍,表明Lac-CS酶解过程中纤维素酶的非特异性吸附作用减少。3)表面活性剂能促进玉米秸秆的酶解糖化和乙醇转化。化学表面活性剂（Tween-80）和生物表面活性剂（鼠李糖脂、茶皂素）的添加有效提高玉米秸秆生物转化乙醇产量和纤维素酶酶解效果,其中生物表面活性剂鼠李糖脂的效果最佳。在INVSc-CBH-TS的木质纤维素SSF过程中,添加0.1%鼠李糖脂的乙醇产量（0.5 g/L）分别为添加0.5%Tween-80、0.01%茶皂素、无添加对照组乙醇产量的1.61,1.08和2.3倍。纤维素酶解过程中,上清中蛋白含量从高到低为0.01%茶皂素（0.89 mg/m L）、0.1%鼠李糖脂（0.84 mg/m L）、0.5%Tween-80的（0.78 mg/m L）,而酶解过程中添加0.01%茶皂素、0.1%鼠李糖脂、0.5%Tween-80后葡萄糖含量分别为0.23 mg/m L、0.39 mg/m L、0.12 mg/m L,该结果表明鼠李糖脂能通过减少纤维素酶的非特异性吸附提高纤维素酶利用率,达到最佳的酶解效果。4)生物改性与表面活性剂的复合作用能够进一步提高玉米秸秆生物转化的乙醇产量。漆酶改性与生物表面活性剂鼠李糖脂的复合策略对生物质利用率的提高效果最佳。使用生物改性与鼠李糖脂的复合策略INVSc-CBH-TS在SSF第5天乙醇含量（0.69 g/L）较对照组（0.5 g/L）提高38%,第6天的乙醇含量（0.73g/L）比对照组（0.56 g/L）提高30%。对比Tween80复合策略（0.58 g/L）和茶皂素复合策略（0.65 g/L）在第6天的乙醇产量也有明显提高。综上所述,本论文通过纤维素酶-木聚糖酶共表达重组菌株及漆酶生物改性解除木质纤维素物理屏障,并通过表面活性剂降低纤维素酶的非特异性吸附。系统的研究了通过解除半纤维素和木质素的物理屏障作用,降低非特异性吸附作用,提高生物质转化效率。初步解析了影响生物质转化的结构关键因子（结晶度、孔隙率、表面显微结构）,明晰了表面活性剂对纤维素酶非特异性吸附作用的影响及作用原理,并为生物质能源的高效利用奠定了理论基础。
陈文艺[6]（2021）在《金属有机骨架负载脂肪酶及其在油脂改性中的应用研究》文中研究说明脂肪酶具有高度专一性、高催化效率和对环境友好等特点,这使得其成为工业上重要的生物催化剂。脂肪酶的固定化技术克服了游离脂肪酶易失活、稳定性差、难以回收利用等缺点,扩大了脂肪酶的实际应用范围。金属有机骨架（MOFs）具有独特的性质,如比表面积大、孔隙率高、孔径易调节、金属节点和配体易修饰、合成条件温和等,其作为固定化脂肪酶的新型载体成为近年来的研究热点。本文采用共沉淀法将脂肪酶固定在MOFs上,研究了其酶学特性;并将其应用于甘油解反应以及酯化反应中,研究了固定化脂肪酶在这两种反应体系中的催化效果及重复利用性。1.通过共沉淀法制备了GMP/Tb、AOL@GMP/Tb以及CALB@GMP/Tb,并采用XRD、SEM、TEM、XPS、ATR-FTIR、TGA、CLSM和CD对其进行表征。对GMP/Tb、AOL@GMP/Tb以及CALB@GMP/Tb的XRD、SEM以及TEM的表征发现,三者均是无定形的非晶体结构,是由不规则球体构成的纳米颗粒,粒径尺寸约为40 nm,且GMP/Tb固定化AOL和CALB之后,纳米颗粒的结构和形貌未发生改变;XPS、FTIR、TGA及CLSM表征发现,脂肪酶成功地负载在GMP/Tb上;CD分析发现,脂肪酶固定化以后其α-螺旋含量降低、β-折叠含量升高,表明刚性有所增强。2.优化了GMP/Tb负载脂肪酶的酶蛋白浓度条件。结果表明,最佳酶蛋白浓度分别为1.93（AOL）、3.66（TLL）、1.98（RML）、2.36（CALA）、7.92（CALB）、2.92（LU）和2.31（BCL）mg/m L;在此条件下,其蛋白固载量以及酶活回收率分别为19.17 mg/g和98.40%、43.09mg/g和97.32%、15.00 mg/g和92.59%、16.41 mg/g和71.08%、62.15 mg/g和70.13%、34.79mg/g和87.62%以及10.39 mg/g和53.23%。Lipase@GMP/Tb的酶学稳定性研究表明,其具有相对较高的热稳定性、有机溶剂耐受性和储存稳定性;其中,Lipase@GMP/Tb在叔戊醇中放置3h后仍能保持88%以上的初始酶活,在4℃下储藏13天后,相对活性仍高达86%以上。此外,大多数Lipase@MOFs都表现出较高的酶活。3.在上述固定化酶成功制备的基础上,以Lipase@GMP/Tb作为催化剂,大豆油和甘油作为底物催化甘油解反应制备DAG。固定大豆油/甘油摩尔比以2:1,加酶量为4%,优化反应温度和时间。结果如下:1)对于AOL@GMP/Tb、TLL@GMP/Tb、RML@GMP/Tb,反应温度60℃,反应时间12h,DAG含量分别达到56.45%、56.04%和57.07%;重复使用5个批次,均仍能保留88%以上的酶活性。2)对于CALA@GMP/Tb,初始水分含量20%,反应温度60℃,反应时间12h,DAG含量达到63.35%;重复使用5个批次,仍可保留78.16%的酶活性。3)对于LU@GMP/Tb,初始水分含量20%,反应温度40℃,反应时间12h,DAG含量达到59.25%;重复使用3个批次,仅剩65.11%的酶活性。4)对于BCL@GMP/Tb,初始水分含量10%,反应温度60℃,反应时间24h,DAG含量达到62.76%;重复使用4个批次,仅剩63.07%的酶活性。此外,对AOL@GMP/Tb和CALA@GMP/Tb催化甘油解反应的热动力学进行了研究,得到表观活化能Ea分别为27.06和42.11 k J/mol,反应速率常数和反应温度在所设定温度范围内之间的阿累尼乌斯方程可分别表示为:Lnv0=4.5512-3.2549/T和Lnv0=9.6369-5.0645/T。另外,在所究的Lipase@MOFs中,大多数Lipase@MOFs都具有较高的甘油解活性,反应所得DAG含量均达到50%以上,TAG转化率在65%以上。但是,CALB@MOFs（除CALB@GMP/Fe外）的甘油解活性却非常差,TAG转化率均低于5%。4.进一步以油酸与甘油为反应底物,研究了CALB@GMP/Tb（其他Lipase@GMP/Tb不具有酯化活性）在无溶剂体系下催化酯化反应的特性。当油酸/甘油摩尔比为2:1时,经优化该反应最适宜的温度、加酶量和反应时间分别为70℃、4.56%和12 h,DAG含量为67.08%,油酸转化率为97.64%;当底物摩尔比为3:1时,经优化该反应最适宜的温度、加酶量和反应时间分别为70℃、4.26%和24 h,TAG含量为87.89%,油酸转化率为99.10%。此外,在催化油酸与甘油（摩尔比为3:1）的酯化反应中,大多数CALB@MOFs都表现出较高的酯化活性,酯化率均达到95%以上,TAG含量为75%至90%。重复利用性表明,在最佳反应条件下（底物摩尔比为3:1）,CALB@GMP/Tb在重复使用7次后仍保留其初始酯化活性的92.74%。5.研究了CALB@GMP/Tb催化不同链长脂肪酸与甘油酯化反应的催化性能。结果表明,当脂肪酸与甘油的摩尔比为3:1时,辛酸、癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸的酯化率高达100%,亚油酸和油酸的酯化率分别为99.83%和99.10%,而棕榈酸的酯化率则为95.42%,说明CALB@GMP/Tb催化酯化的效果与脂肪酸的空间位阻有关。进一步评估了CALB@GMP/Tb催化高酸价油脂酯化脱酸的能力,结果表明,CALB@GMP/Tb对高酸价油脂脱酸的效果要优于Novozym 435,脱酸后油酸的含量都降低到1.6%以下,TAG含量高达87-89%,DAG含量约为10%。
颜光波[7]（2021）在《ATP以及S-腺苷甲硫氨酸的多酶催化合成研究》文中进行了进一步梳理S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）是甲硫氨酸的活性形式,广泛存在于植物、动物及微生物等体内,在生物体所有细胞的代谢过程中都起到重要的作用。SAM能预防肝脏损伤、心脏疾病、缺氧症等疾病的发生;SAM可用于治疗恶性营养不良、关节炎、帕金森病及抑郁症等疾病;此外,SAM还能用于美容产品。随着SAM新功能的不断发现,其需求量日益增加。SAM可由三磷酸腺苷（ATP）和L-甲硫氨酸（L-Met）通过甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）催化合成,但昂贵的ATP导致使用酶法制备SAM的成本很高。本研究着力于以廉价的腺苷和多聚磷酸盐为底物,通过酶法合成ATP,降低ATP的制备成本,从而突破SAM酶法大规模制备成本高的瓶颈。我们合成多种ATP合成酶及甲硫氨酸腺苷转移酶基因,并通过大肠杆菌表达系统进行表达、纯化,然后进行酶活验证,从中筛选高活性的腺苷酸激酶（ADK）、腺苷激酶（AK）、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶（PAP）以及甲硫氨酸腺苷转移酶,并将这些酶联合使用进行多酶催化反应,成功实现了酶法低成本合成ATP,SAM。我们利用筛选到的高活性的腺苷酸激酶（ADK）、腺苷激酶（AK）、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶（PAP）对ATP合成反应的温度、p H、离子浓度、酶的比例等条件进行优化,从而以35 g/L的六偏磷酸钠和12.5 g/L的腺苷催化反应6 h后能生成30 g/L的ATP。此外,鉴于支架蛋白质可能通过底物通道效应或协同效应来促进多酶催化反应,在本研究中,我们用本实验室开发的支架蛋白质将这些酶在体外组装成复合物进行催化反应,可使ATP产量比同等条件下的多酶体系提升10%。通过酶学性质研究我们发现MAT4的最适p H为p H 8.0,最适反应温度为20℃,最适Mg2+浓度为0.3 M;MAT5的最适p H为p H 8.0,最适反应温度为40℃,最适Mg2+浓度为0.7 M。此外,我们发现ATP合成反应完成后,直接向产物里加入甲硫氨酸腺苷转移酶及适量的Mg2+更有利于获得SAM。在25μg左右酶量下,MAT4可将0.5 g/L左右L-Met在反应5 h后生成0.9 g/L的SAM;MAT5在反应3 h后可生成1.2 g/L的SAM。综上,本研究利用低成本的底物通过多酶催化反应可高效的转化成具有高附加值的ATP和SAM,为开发和建立体外酶法生产ATP和SAM工艺奠定了基础;同时也为此类诸如SAM、GSH等需要ATP参与合成的物质提供制备方案。
曾易[8]（2021）在《用于生物分析的光功能涂层的构建》文中研究指明生物分析被广泛用于血液、尿液、唾液、泪液及组织提取物中的药物、代谢物、以及各种生物标志物的定量检测,是监测人类健康和研究生命科学的有力手段。表面增强拉曼散射（SERS）因其能提供被测物质丰富的“指纹”信息且检测速度快、灵敏度高,成为一种重要生物分析手段。SERS的实现依赖于SERS基底的构建。然而,受限于目前SERS基底的制备方法以及对所用基底材料的选择,所制备出的SERS基底使用场景受限,特别是在原位、在线生物分析过程中。在本文中,我们首先利用具备良好生物相容性的二氧化钛（TiO2）开发出了一种SERS基底的光控制备方法。在此基础上,提出将SERS基底的光控制备方法延伸至具备广泛粘附性和丰富官能团的生物相容性材料聚多巴胺（PDA）,使SERS基底的制备不再受基底材料限制,实现了一种可通用的且具备二次修饰可行性的SERS基底光控制备方法。最后,将该SERS基底的光控制备方法同胶体晶体微针贴片相结合,以器件的形式演示了其在多模态原位生物分析中的应用。具体研究内容包括:（一）利用TiO2的光催化性质,提出了一种高通量SERS基底的光控制备方法。在本文中,通过区域化UV辐照浸于AgNO3溶液中的经疏水处理的TiO2涂层,制备了具有Ag沉积阵列和表面去湿性（dewetting）差异的基底。深入研究了各个实验参数对所制备基底在SERS检测及高通量加样中的影响,并通过引入光子晶体结构显着提升了SERS基底的灵敏度。反复优化后,制备出了具有良好SERS效应,可自发形成高通量液滴阵列的SERS基底,并将该高通量SERS基底应用于多元检测。该SERS基底的光控制备方法无需使用大型设备,适用于多种基底材料,可做高通量分析,且在使用完毕后可对基底做回收利用。（二）发现并利用PDA的光致金属化性质,对SERS基底的光控制备进行改良,实现了适用于各种材料表面的、具有二次修饰可行性的SERS基底的光控制备。在生物分析中,往往需要在特殊界面材料（例如水凝胶、三维结构）上构建SERS基底,并进行二次修饰用以捕捉、富集待测生物分子。为实现上述目标,我们将SERS基底的光控制备手段用于PDA涂层修饰的表面。PDA广泛的粘附性以及温和的液相反应条件可实现在各种复杂界面上制备均一的PDA涂层。我们发现并系统研究了PDA涂层光致金属化现象,实现了在各种PDA修饰表面上SERS基底的光控制备。PDA本身丰富的官能团又使得该SERS基底同时具备其它二次修饰可行性（例如巯基、氨基的修饰）,可用于对生物分子的捕捉和富集。另外,在实验中我们还发现PDA对其表面金属的光擦除行为,并针对PDA表面可逆金属化现象提出了全新的反应机理,演示了PDA表面贵金属粒子的回收利用。（三）将基于PDA的SERS基底光控制备方法用于胶体晶体微针贴片,构建了既可用于SERS检测又可用于葡萄糖比色检测的多重响应生物分析器件。我们制备并优化了葡萄糖响应的胶体晶体,使其在不同的葡萄糖生理浓度下呈现不同的肉眼可识别颜色。同时,利用PDA涂层介导的光致金属化处理以及胶体晶体微纳结构,使胶体晶体还具备显着的SERS效应。以涂层的方式,将该多重响应胶体晶体集成到微针贴片,赋予胶体晶体在体实验的可行性。以I型糖尿病小鼠为模型,该胶体晶体微针贴片集样品提取、分析传感、检测结果呈现为一体,实现了生物分子的微创、无痛、无酶在线监测。
张冰玉[9]（2020）在《低温脂肪酶基因的克隆、表达及脂肪酶基因高通量筛选方法的初步建立》文中指出脂肪酶是一种特殊的甘油三酯水解酶,其作用条件温和、副产物少、可作用于油-水界面催化甘油酯水解成脂肪酸和甘油,还能催化水解、酯交换、酯化、醇解、酸解和氨解多种反应。低温脂肪酶是指在0oC仍具有一定催化活性、最适温度不超过30oC的脂肪酶,大多数在高温条件下酶活力较差。低温脂肪酶还具有一定有机溶剂耐受性、偏好C3C10长链的脂肪酸酯以及具有更宽泛的pH适用范围,因此低温脂肪酶在水产饲料、食品、生物医药、皮革、环境治理、生物柴油、洗涤等行业有较大的应用前景。据报道,假单胞菌属（Pseudomonas）和气单胞菌属（Aeromonas）是低温脂肪酶的主要来源。为了拓宽低温脂肪酶的基因资源,本论文从微生物中克隆、表达三个脂肪酶基因,获得的重组蛋白分别命名为PgLip、PfLip和BcLip,分别来源于谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）、台湾假单胞菌（Pseudomonas formosensis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus clausii）。酶学性质测定表明,PgLip、PfLip和BcLip最适温度均在20oC以下,在0oC仍具有较高的酶活力,因此它们都属于低温脂肪酶。脂肪酶对金属离子普遍具有一定的抗性。此外,虽然在去垢剂SDS中酶活力丧失较多,但在其它类型的表面活性剂如Tween-20、Tween-80和Triton X-100中酶活力却大幅度提高;另外,对于乙醇、异戊醇和异丙醇有机溶剂,相对于低浓度条件,在高浓度有机溶剂中脂肪酶甚至被激活,表现出独特的特征。因此,三个低温脂肪酶的克隆、表达和生化表征丰富了我们对脂肪酶生物多样性的科学认识。我们尝试结合生物传感器的灵敏和流式分选的快速来建立脂肪酶的高通量筛选方法。在对上述3个脂肪酶进行详细生化表征的基础上,我们以动态传感器-调节系统为模型、结合生物传感器和流式分选的方法初步建立了一个用于脂肪酶筛选的高通量筛选体系。首先构建一个对细胞内脂酰CoA响应的基因表达盒,该表达盒使用AR启动子使得其控制下游红色荧光蛋白基因的表达,并反映胞内脂酰CoA。脂酰CoA在胞内会被脂肪酸β-氧化酶系降解进入代谢途径,因此生物传感器的灵敏度下降;为了增加该传感器的灵敏度,需要将参与β-氧化的相关基因敲除或抑制其表达。因此我们使用CRISPR/Cas9技术敲除BL21（DE3）大肠杆菌中的fadE基因。大肠杆菌的fadE编码脂酰CoA脱氢酶,敲除fadE基因可以阻断脂肪酸的分解代谢,同时又不影响菌株的生长。因此该基因的敲除使得细胞内的脂肪酸能维持稳定的浓度。以敲除fadE的大肠杆菌为基础、以BcLip脂肪酶为模型构建针对脂肪酸（脂酰CoA的前体）响应的细胞系统。优化水、油、水乳化体系,使细菌能较好地形成乳化体系,最终通过流式细胞仪高通量筛选表达脂肪酶BcLip的大肠杆菌。在此基础上,构建了一个土壤宏基因组质粒文库,利用上述方法结合生物传感器和流式分选的高通量筛选方法,初步从土壤样品中筛选出含脂肪酶活性的菌株。本研究取得了如下结果:通过同源比对,克隆获得三个低温脂肪酶基因;将基因成功在大肠杆菌中进行表达并对其酶学性质进行生化表征,丰富脂肪酶基因资源、对脂肪酶生物多样性的科学认识。同时,结合生物传感器和流式分选,我们以所获得的脂肪酶BcLip为模型初步建立了一个用于脂肪酶基因的高通量流式筛选方法。应用该方法,成功地从土壤宏基因组质粒文库中筛选到表达脂肪酶的重组菌株。该方法经优化后可望用于脂肪酶的筛选,因此为脂肪酶筛选提供了新的思路;该方法基于功能进行筛选,因此对方法中的生物传感器元件进行改造后还可能用于其它饲料酶如木聚糖酶、甘露聚糖酶等的筛选,并有可能获得全新的酶基因资源。
马惠琳[10]（2020）在《微波辅助反胶束体系甲烷氧化菌素拟酶催化反应研究》文中研究指明天然过氧化物酶具有分离过程复杂,不易保存和不稳定易失活等缺点,作为具有高过氧化物酶催化活性和良好稳定性的模拟酶可以替代天然过氧化物酶应用于食品、医药和疾病检测等领域。反胶束体系可避免酶与周围有机溶剂直接接触,保护酶的催化活性和稳定性。近年来已有研究表明适当的微波条件可以增强酶的催化活性。本文将具有过氧化物酶模拟酶活性的甲烷氧化菌素-铜配合物增溶于反胶束体系中,利用微波辅助该模拟酶催化的反应,旨在寻找增强拟酶活性的新方法。主要研究内容如下:利用甲基弯菌OB3b产生的甲烷氧化菌素（Mb）与铜配位结合合成具有过氧化物酶活性的模拟酶Mb-Cu,通过紫外-可见光谱分析监测Mb-Cu模拟酶的合成。使用阳离子型CTAB、阴离子型AOT以及非离子型Brij35三种表面活性剂制备反胶束体系。以罗丹明B为探针确定了CTAB的临界胶束浓度为3?10-44 mol/L,Brij35的临界胶束浓度为2?10-44 mol/L,AOT的临界胶束浓度为3?10-44 mol/L。三种反胶束的电导率均随着含水量增加而增大,未见转折点,体系稳定。对反胶束的粒径研究发现反胶束一旦形成并稳定后不受时间影响。制备阳离子型CTAB、阴离子型Brij35和非离子型AOT三种含有模拟酶Mb-Cu的反胶束进行催化反应,紫外光谱分析表明CTAB、Brij35和AOT三种反胶束都可加快模拟酶Mb-Cu的催化反应。对反胶束体系中各表面活性的最适浓度与含水量进行研究研究。在各表面活性最适浓度与含水率条件下对反应体系的pH、KCl浓度和H2O2浓度方面进行优化发现三种反胶束最优条件相同但Mb-Cu模拟酶的拟酶活性不同,即pH为8、KCl浓度为0.03 mol/L和H2O2浓度为9×10-44 mol/L时为最佳,此时阳离子型、阴离子型和非离子型反胶束中模拟酶的酶活分别为3.593×10-44 mol/L·s、1.356×10-44 mol/L·s、2.176×10-44 mol/L·s。由拟酶活性对比得出在阳离子型CTAB反胶束中Mb-Cu配合物模拟酶催化性能最好。最后进行微波辅助下阳离子型CTAB反胶束体系中模拟酶Mb-Cu的催化反应,紫外光谱分析表明微波进一步加快了催化反应。对反应体系的微波功率、微波时间、微波温度进行研究,并使用响应面进行分析,结合实际操作后调整微波温度56℃、微波功率500 W、反应时间为2 min,得出模拟酶的平均活性为5.267?10-33 mol/L·s,与没有微波辅助相比扩大约15倍。表明微波对反胶束体系中模拟酶催化反应有促进作用。本方法可用于与过氧化物酶催化反应相关的物质的快速检测。
二、酶催化生产生化级表面活性剂(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酶催化生产生化级表面活性剂(英文)（论文提纲范文）
（1）N-月桂酰基谷氨酸钠的水相合成过程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 N-酰基氨基酸型表面活性剂的概述 |
| 1.2 N-酰基氨基酸型表面活性剂的合成方法 |
| 1.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2 酶合成法 |
| 1.2.3 化学–酶合成法 |
| 1.2.4 发酵法 |
| 1.3 肖顿–鲍曼缩合反应的合成工艺 |
| 1.3.1 有机溶剂/水法 |
| 1.3.2 水相法 |
| 1.4 N-酰基氨基酸型表面活性剂的应用 |
| 1.5 立题依据和主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 N-月桂酰基谷氨酸钠产品活性物的快速定量分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 N-月桂酰基谷氨酸钠的合成 |
| 2.3.2 溶剂萃取差重法定量分析月桂酸钠方法 |
| 2.3.3 HPLC-RID法定量分析活性物方法 |
| 2.3.4 NaCl和谷氨酸钠的定量方法 |
| 2.3.5 结构鉴定方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产品中活性物的结构鉴定 |
| 2.4.2 HPLC-RID法定量分析各活性物方法建立 |
| 2.4.3 HPLC-RID法用于控制反应过程 |
| 2.4.4 月桂酸钠的定量方法比较 |
| 2.4.5 市售N-月桂酰基谷氨酸钠产品的分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 N-月桂酰基谷氨酸钠的水相合成工艺研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 原料品质鉴定 |
| 3.3.2 谷氨酸钠的物性参数测定 |
| 3.3.3 N-月桂酰基谷氨酸钠的水相合成工艺 |
| 3.3.4 产品的分析方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 原料品质鉴定结果 |
| 3.4.2 反应方程式和机理 |
| 3.4.3 搅拌速率的影响 |
| 3.4.4 物料浓度的影响 |
| 3.4.5 加料速率的影响 |
| 3.4.6 投料比的影响 |
| 3.4.7 反应温度的影响 |
| 3.4.8 pH的影响 |
| 3.4.9 老化条件的优化 |
| 3.4.10 重复试验结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 N-月桂酰基谷氨酸钠的水相工艺过程强化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 过程方案流程图 |
| 4.3.2 装置的开停车 |
| 4.3.3 产品的分析方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 装置的设计思路 |
| 4.4.2 初步实验结果 |
| 4.4.3 物料浓度的考察 |
| 4.4.4 pH的考察 |
| 4.4.5 物料比的考察 |
| 4.4.6 温度的考察 |
| 4.4.7 酰氯进料方式的改进 |
| 4.4.8 优化产品与市售产品比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 N-月桂酰基谷氨酸钠产品的应用性能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 N-月桂酰基谷氨酸钠的物化性质测定 |
| 5.3.2 N-月桂酰基谷氨酸钠产品的应用性能测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 N-月桂酰基谷氨酸钠的物化性质 |
| 5.4.2 N-月桂酰基谷氨酸钠产品的应用性能 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论及展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一:反应装置图 |
| 附录二:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环氧化物水解酶的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 EHs的分类 |
| 1.1.3 EHs的来源 |
| 1.1.4 EHs的异源表达 |
| 1.1.5 EHs的结构及催化机制 |
| 1.1.6 EHs的两种水解途径 |
| 1.1.7 EHs的产物的应用价值 |
| 1.2 环氧化物水解酶的分子改造 |
| 1.2.1 初级的理性设计 |
| 1.2.2 定向进化 |
| 1.2.3 半理性设计 |
| 1.2.4 计算机辅助蛋白设计 |
| 1.3 环氧化物水解酶的催化体系优化 |
| 1.3.1 添加有机溶剂 |
| 1.3.2 添加非离子表面活性剂 |
| 1.3.3 添加离子溶剂/深共溶溶剂 |
| 1.4 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 番茄环氧化物水解酶的克隆表达及酶学性质分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 生物信息学网站及软件 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验材料与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 番茄EH基因的克隆 |
| 2.3.2 番茄EH表达重组菌的构建 |
| 2.3.3 重组菌E.coli/sleh1的EH活性测定 |
| 2.3.4 SlEH1 的异源表达条件优化 |
| 2.3.5 SlEH1 的酶学性质分析 |
| 2.3.6 同源建模分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 番茄EH基因的克隆 |
| 2.4.2 番茄EH的结构分析 |
| 2.4.3 重组菌E.coli/sleh1 和/sleh2 的构建 |
| 2.4.4 重组菌诱导条件的优化 |
| 2.4.5 SlEH1和SlEH2的纯化分析 |
| 2.4.6 SlEH1和SlEH2的酶学性质分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 番茄环氧化物水解酶的底物谱研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 环氧化物底物的合成 |
| 3.3.2 SlEH1和SlEH2的诱导表达 |
| 3.3.3 E.coli/sleh1和/sleh2的催化活性测定 |
| 3.3.4 SlEH1和SlEH2的反应进程曲线测定 |
| 3.3.5 SlEH1和SlEH2的对映选择性(E值)测定 |
| 3.3.6 SlEH1和 SlEH2的区域选择性(α_S和 β_R)测定 |
| 3.3.7 SlEH1对(R)-2a和(S)-2a动力学参数的测定 |
| 3.3.8 克级规模制备(R)-2a和(R)-4a |
| 3.3.9 SlEH1 对映选择性的分子动力学机理解析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 SlEH1 的底物谱分析 |
| 3.4.2 SlEH2 的底物谱分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于半理性设计调控SlEH1对rac-11a区域选择性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 (R)-11a和(S)-11a的合成 |
| 4.3.2 sleh1突变基因文库及E.coli重组菌的构建 |
| 4.3.3 SlEH1 及其突变酶的表达 |
| 4.3.4 催化活性测定 |
| 4.3.5 筛选归一性提高的突变酶 |
| 4.3.6 区域选择性测定 |
| 4.3.7 克级规模归一性水解rac-11a实验 |
| 4.3.8 SlEH1~(W106T/F189L)的底物谱特性测定 |
| 4.3.9 SlEH1~(W106T/F189L)的动力学参数测定 |
| 4.3.10 SlEH1和(S)-11a分子对接及动力学模拟 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 SlEH1 突变位点的选择 |
| 4.4.2 SlEH1的Smart突变文库的构建 |
| 4.4.3 SlEH1 的单位点突变文库筛选 |
| 4.4.4 SlEH1 的最优突变酶选定 |
| 4.4.5 克级规模归一性合成(R)-11b |
| 4.4.6 SlEH1~(W106T/F189L)的底物谱分析 |
| 4.4.7 分子动力学模拟分析SlEH1~(W106T/F189L)的 α_S值提高机制 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 提高SlEH2归一性制备(R)-1b底物加载量的反应媒介优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 E.coli/sleh2磷酸缓冲液中的最大底物加载量 |
| 5.3.2 有机/磷酸缓冲液反应媒介对E.coli/sleh2 催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.3 添加DESs对 E.coli/sleh2催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.4 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2催化归一性水解反应的影响 |
| 5.3.5 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2区域选择性的影响 |
| 5.3.6 添加非离子表面活性剂对E.coli/sleh2产物抑制现象的影响 |
| 5.3.7 E.coli/sleh2归一性制备(R)-1b |
| 5.3.8 最优反应媒介在EHs制备手性邻二醇中的应用 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 E.coli/sleh2在磷酸缓冲液中制备(R)-1b的最大底物加载量 |
| 5.4.2 反应媒介优化提高底物加载量 |
| 5.4.3 E.coli/sleh2在吐温-20/磷酸缓冲液的产物抑制现象分析 |
| 5.4.4 吐温-20/磷酸缓冲液反应媒介在EHs制备手性邻二醇中的广谱性研究 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读博士学位期间发表的成果 |
| 附录2:本文中所用环氧底物信息 |
| 附录3:SlEH1 的单位点突变文库的筛选 |
| 附录4:(R)-11b的GC及核磁分析图谱 |
| 附录5:(R)-1b的GC及核磁分析图谱 |
（3）构建生产三碳化合物的大肠杆菌细胞工厂（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究目的及意义 |
| 1.2 二羟基丙酮 |
| 1.2.1 二羟基丙酮简介 |
| 1.2.2 二羟基丙酮的应用 |
| 1.2.3 二羟基丙酮合成研究 |
| 1.3 甘油酸 |
| 1.3.1 甘油酸简介 |
| 1.3.2 甘油酸的应用 |
| 1.3.3 甘油酸的合成 |
| 1.4 代谢工程 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 常用的溶液 |
| 2.1.6 研究使用到的发酵培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的DNA的扩增 |
| 2.2.2 质粒构建 |
| 2.2.3 底盘菌株的构建 |
| 2.2.4 菌种活化以及保藏方法 |
| 2.2.5 菌株发酵验证 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 菌株构建 |
| 3.1.1 二羟基丙酮生产菌株构建 |
| 3.1.2 D-甘油酸生产菌株构建 |
| 3.2 二羟基丙酮系列菌株发酵 |
| 3.2.1 培养基优化 |
| 3.2.2 TZ系列菌株发酵 |
| 3.3 D-甘油酸菌株发酵 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 二羟基丙酮生产菌株 |
| 4.2 D-甘油酸生产菌株 |
| 第五章 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 附录 |
（4）耐辐射异常球菌低温酯酶EstDR4的功能鉴定和分子改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1.酯酶综述 |
| 1.1 酯酶概述 |
| 1.1.1 酯酶的结构 |
| 1.1.2 酯酶的催化机理 |
| 1.1.3 酯酶的分类 |
| 1.1.4 酯酶的来源 |
| 1.2 细菌酯酶 |
| 1.2.1 细菌酯酶的生理生化特性 |
| 1.2.2 细菌酯酶的家族和分类 |
| 1.3 酯酶的改造 |
| 1.3.1 底物特异性和选择性 |
| 1.3.2 热稳定性 |
| 1.4 酯酶的应用 |
| 1.4.1 酯酶的特征和应用方向 |
| 1.4.2 酯酶的应用领域 |
| 1.4.3 酯酶在杀虫剂生物降解上的应用 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2.耐辐射异常球菌酯酶鉴定及表征 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要化学试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 DNA扩增和质粒构建 |
| 2.2.3 蛋白诱导表达与纯化 |
| 2.2.4 酶活性分析 |
| 2.2.5 底物特异性分析 |
| 2.2.6 最适温度和温度稳定性分析 |
| 2.2.7 最适p H和p H稳定性分析 |
| 2.2.8 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活性的影响 |
| 2.2.9 动力学参数分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 耐辐射异常球菌中酯酶基因的鉴定 |
| 2.3.2 EstDR4的序列分析与表达 |
| 2.3.3 EstDR4的底物特异性 |
| 2.3.4 EstDR4的最适温度和热稳定性 |
| 2.3.5 EstDR4的最适pH值和pH稳定性 |
| 2.3.6 不同金属离子对EstDR4的影响 |
| 2.3.7 有机溶剂和表面活性剂对EstDR4的影响 |
| 2.3.8 EstDR4的动力学参数 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3.EstDR4 盖子结构对底物偏好和温度稳定性的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌种与质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 主要化学试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 突变位点的选择 |
| 3.2.2 突变体表达载体的构建 |
| 3.2.3 突变体蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.4 突变体底物特异性分析 |
| 3.2.5 突变体热稳定性分析 |
| 3.2.6 分子对接 |
| 3.2.7 分子动力学模拟 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 催化三联体的确定及突变位点选择 |
| 3.3.2 各突变体的底物偏好 |
| 3.3.3 各突变体的热稳定性 |
| 3.3.4 酶与底物结合构象 |
| 3.3.5 分子动力学模拟 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4.基于疏水核心对EstDR4 热稳定性的改良 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌种与质粒 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 主要化学试剂和试剂盒 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 突变位点的选择 |
| 4.2.2 突变体表达载体的构建 |
| 4.2.3 突变体蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.4 突变体热稳定性研究 |
| 4.2.5 分子动力学模拟 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 突变位点的选择 |
| 4.3.2 突变体酶活 |
| 4.3.3 饱和突变体酶活 |
| 4.3.4 突变体热稳定性 |
| 4.3.5 突变体分子动力学模拟 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5.底物通道及其连接区域对EstDR4催化特性的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌种与质粒 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 主要化学试剂和试剂盒 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 突变位点的选择 |
| 5.2.2 突变体基因表达载体的构建 |
| 5.2.3 突变体蛋白的表达与纯化 |
| 5.2.4 热稳定性分析 |
| 5.2.5 底物特异性分析 |
| 5.2.6 分子对接 |
| 5.2.7 分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 突变位点的选择 |
| 5.3.2 底物通道相关突变的底物特异性和动力学参数 |
| 5.3.3 分子对接及通道位阻分析 |
| 5.3.4 α6及其连接的loop区域相关突变的酶活 |
| 5.3.5 α6及其连接的loop区域相关突变的热稳定性分析 |
| 5.3.6 突变位点相互作用分析 |
| 5.3.7 分子动力学模拟 |
| 5.3.8 突变体底物偏好和动力学参数 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6.EstDR4对杀虫剂和玉米赤霉烯酮的降解 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验用酶 |
| 6.1.2 主要化学试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 酶解体系及样品制备 |
| 6.2.2 LC-MS定量法检测农药及毒素的含量 |
| 6.2.3 标准曲线绘制及降解率计算 |
| 6.2.4 降解产物鉴定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 EstDR4对杀虫剂和玉米赤霉烯酮的降解 |
| 6.3.2 EstDR4对杀虫剂和玉米赤霉烯酮降解产物的鉴定 |
| 6.3.3 EstDR4及其突变体对杀虫剂的降解 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7.全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 EstDR4的编码基因序列和氨基酸序列 |
| 攻读博士期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）生物改性及表面活性剂结合策略对玉米秸秆生物质转化效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木质纤维素 |
| 1.1.1 纤维素 |
| 1.1.2 半纤维素 |
| 1.1.3 木质素 |
| 1.2 生物质乙醇发酵 |
| 1.2.1 分步糖化发酵 |
| 1.2.2 同步糖化发酵 |
| 1.2.3 半同步糖化发酵 |
| 1.3 基于木质纤维素的生物炼制技术 |
| 1.3.1 生物炼制技术 |
| 1.3.2 酶制剂在木质纤维素生物炼制各阶段中的应用 |
| 1.4 生物炼制技术的主要技术瓶颈及现阶段解决手段 |
| 1.4.1 物理屏障作用 |
| 1.4.2 非特异性吸附作用 |
| 1.4.3 解除天然木质纤维素物理屏障作用的途径 |
| 1.4.4 表面活性剂与纤维素的非特异性吸附 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 纤维素酶-木聚糖酶共表达酿酒酵母生物转化过程中的协同作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纤维素酶-木聚糖酶共表达酿酒酵母纤维素酶、木聚糖酶活性检测 |
| 2.3.2 共表达酿酒酵母以部分脱木质素玉米秸秆(PDCS)为唯一碳源的生长情况 |
| 2.3.3 共表达酿酒酵母在PDCS同步糖化发酵过程中的乙醇产生情况 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 生物改性与玉米秸秆生物转化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 重组质粒p PICZαA-Lac的构建 |
| 3.3.2 漆酶表达毕赤酵母的转化筛选与漆酶酶活测定 |
| 3.3.3 漆酶生物改性玉米秸秆降解产物分析 |
| 3.3.4 生物改性玉米秸秆的化学官能团的变化 |
| 3.3.5 生物改性对玉米秸秆同步糖化发酵糖产量及乙醇产量的影响 |
| 3.3.6 生物改性玉米秸秆与PDCS同步糖化发酵乙醇产量对比 |
| 3.3.7 生物改性对玉米秸秆的纤维素酶解增效 |
| 3.3.8 生物改性对玉米秸秆微观结构变化的影响 |
| 3.3.9 生物改性对CBH非特异性吸附作用的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 表面活性剂添加与玉米秸秆同步糖化发酵 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 .结果与讨论 |
| 4.3.1 不同浓度表面活性剂对酿酒酵母INVSc生长的影响 |
| 4.3.2 表面活性剂对玉米秸秆同步糖化发酵糖产量及乙醇产量的影响 |
| 4.3.4 不同表面活性剂添加对玉米秸秆酶解作用及外切纤维素酶CBH非特异性吸附作用的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 生物改性-表面活性剂结合策略与木质纤维素同步糖化发酵 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 生物改性与表面活性剂对共表达酿酒酵母同步糖化发酵糖产量及乙醇产量的影响 |
| 5.3.2 生物改性与表面活性剂结合SSF 过程与部分脱木质素玉米秸秆SSF 过程乙醇产量对比 |
| 5.3.3 生物改性与表面活性剂相结合对玉米秸秆纤维素酶解效率及CBH非特异性吸附作用的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 课题创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 1:攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）金属有机骨架负载脂肪酶及其在油脂改性中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶 |
| 1.1.1 脂肪酶简介 |
| 1.1.2 脂肪酶的应用 |
| 1.2 脂肪酶固定化的新型载体 |
| 1.2.1 无机材料 |
| 1.2.2 有机材料 |
| 1.2.3 复合材料 |
| 1.3 MOFS固定脂肪酶的研究进展 |
| 1.3.1 MOFs的概述 |
| 1.3.2 MOFs固定脂肪酶的方法 |
| 1.3.3 MOFs固定化脂肪酶的应用 |
| 1.4 本文课题的研究意义、研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 MOFS负载脂肪酶及其表征 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 脂肪酶 |
| 2.1.2 主要材料与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GMP/Tb CPs的制备 |
| 2.2.2 固定化酶的制备 |
| 2.2.3 固定化酶表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 X-射线衍射(XRD) |
| 2.3.2 扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)分析 |
| 2.3.3 X-射线光电子能谱(XPS) |
| 2.3.4 衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR) |
| 2.3.5 热重分析(TGA) |
| 2.3.6 激光共聚焦显微镜扫描(CLSM) |
| 2.3.7 圆二色性光谱(CD) |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 MOFS负载脂肪酶的酶学性质研究 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 脂肪酶 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 固定化酶的制备 |
| 3.2.2 蛋白含量测定 |
| 3.2.3 水解活力测定 |
| 3.2.4 固定化效果评价参数 |
| 3.2.5 固定化酶的酶学性质表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 GMP/Tb负载脂肪酶的酶蛋白浓度优化 |
| 3.3.2 固定化酶的酶学性质研究 |
| 3.3.3 不同MOFs对脂肪酶固定化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MOFS负载脂肪酶催化甘油解反应制备甘油二酯的研究 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 脂肪酶 |
| 4.1.2 主要材料与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 固定化酶的制备 |
| 4.2.2 固定化酶催化甘油解反应制备甘油二酯的工艺优化 |
| 4.2.3 固定化酶催化甘油解反应的重复利用性研究 |
| 4.2.4 固定化酶催化甘油解反应的热力学模型研究 |
| 4.2.5 初始水分含量对固定化酶催化甘油解反应的影响研究 |
| 4.2.6 反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测甘油酯组成 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 反应温度和时间对Lipase@GMP/Tb催化甘油解反应的影响 |
| 4.3.2 Lipase@GMP/Tb催化甘油解反应的重复利用性 |
| 4.3.3 Lipase@GMP/Tb催化甘油解反应热力学分析 |
| 4.3.4 不同MOFs对脂肪酶甘油解活性的影响 |
| 4.3.5 初始水分含量对固定化酶催化甘油解反应的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 MOFS负载脂肪酶催化酯化反应的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 脂肪酶 |
| 5.1.2 主要材料与试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 固定化酶的制备 |
| 5.2.2 固定化酶催化油酸和甘油酯化反应的工艺优化 |
| 5.2.3 固定化酶催化酯化反应的重复利用性研究 |
| 5.2.4 固定化酶催化不同链长的脂肪酸和甘油酯化反应研究 |
| 5.2.5 固定化酶催化高酸价大豆油脱酸 |
| 5.2.6 反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测甘油酯组成 |
| 5.2.7 酸价的测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 固定化酶催化油酸与甘油酯化反应的工艺优化 |
| 5.3.2 固定化酶催化油酸与甘油酯化反应的重复利用性 |
| 5.3.3 不同MOFs对 CALB酯化活性的影响 |
| 5.3.4 CALB@GMP/Tb催化不同链长脂肪酸与甘油酯化反应 |
| 5.3.5 CALB@GMP/Tb催化高酸价油脂酯化脱酸 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和申请的专利 |
（7）ATP以及S-腺苷甲硫氨酸的多酶催化合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)简介 |
| 1.2 SAM的结构与性质 |
| 1.3 SAM的生物学功能和临床应用 |
| 1.3.1 SAM的生物学功能 |
| 1.3.2 SAM的临床应用 |
| 1.4 SAM的合成途径 |
| 1.4.1 化学合成法 |
| 1.4.2 发酵法 |
| 1.4.3 酶促转化法 |
| 1.4.4 全细胞催化法 |
| 1.5 三磷酸腺苷(ATP)简介 |
| 1.6 ATP的生产方法 |
| 1.6.1 化学合成法生成ATP |
| 1.6.2 氧化磷酸化生成ATP |
| 1.6.3 光合磷酸化生成ATP |
| 1.6.4 利用基因工程菌合成ATP |
| 1.6.5 细胞酶系、酶法生产ATP |
| 1.7 ATP的应用概况 |
| 1.8 ATP合成酶、甲硫氨酸腺苷转移酶及其多酶反应简介 |
| 1.8.1 腺苷激酶、甲硫氨酸腺苷转移酶 |
| 1.8.2 腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶、多聚磷酸腺苷酸磷酸转移酶 |
| 1.8.3 多酶反应 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 实验所用目的基因 |
| 2.1.3 实验所用质粒和菌株 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 缓冲液 |
| 2.1.7 培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR扩增 |
| 2.2.2 载体酶切 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法 |
| 2.2.5 质粒提取 |
| 2.2.6 系列表达质粒的构建 |
| 2.2.7 T5 核酸外切酶介导的克隆方法 |
| 2.2.8 重组子挑选与鉴定 |
| 2.2.9 重组质粒的异源表达 |
| 2.2.10 蛋白质纯化 |
| 2.2.11 SDS-PAGE检测蛋白质 |
| 2.2.12 Bradfold法测定蛋白质浓度 |
| 2.2.13 酶活测定 |
| 2.2.14 酶组分与支架蛋白质组装 |
| 2.2.15 酶促反应生成SAM、ATP等物质 |
| 2.2.16 HPLC检测反应产物的生成 |
| 2.2.17 标准曲线的绘制及样品准备 |
| 2.2.18 本课题可选用的多酶体系方案 |
| 2.2.19 酶促反应条件优化 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 系列表达质粒的构建 |
| 3.2 系列目的蛋白质的表达与纯化 |
| 3.2.1 系列目的蛋白质的表达 |
| 3.2.2 系列目的蛋白质的纯化 |
| 3.3 酶活测定 |
| 3.4 酶组分与支架蛋白质的组装 |
| 3.5 ATP、ADP、AMP标准曲线绘制 |
| 3.6 SAM的标准曲线绘制 |
| 3.7 多酶催化生成ATP、ADP、AMP |
| 3.7.1 ATP、ADP、AMP、标准品检测 |
| 3.7.2 反应生成的ATP、ADP、AMP检测 |
| 3.8 多酶催化生成SAM |
| 3.8.1 SAM的标准品检测 |
| 3.8.2 反应生成的SAM的检测 |
| 3.9 多酶催化反应条件优化 |
| 3.9.1 ATP合成体系的反应条件优化 |
| 3.9.2 SAM合成体系的反应条件优化 |
| 3.10 最适L-Met浓度 |
| 3.11 SAM合成体系的转化率探究 |
| 3.12 ATP合成复合物的催化反应 |
| 3.13 SAM合成复合物的催化反应 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）用于生物分析的光功能涂层的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物分析 |
| 1.1.1 生物分析的手段 |
| 1.1.1.1 表面增强拉曼散射 |
| 1.1.1.2 比色法 |
| 1.1.1.3 其他检测手段 |
| 1.1.2 生物分析中的材料制备 |
| 1.1.2.1 SERS检测中的材料制备 |
| 1.1.2.2 比色检测中的材料制备 |
| 1.1.3 生物分析的发展趋势 |
| 1.2 光功能材料 |
| 1.2.1 光活性材料及其在生物分析中的应用 |
| 1.2.1.1 TiO_2 |
| 1.2.1.2 聚多巴胺 |
| 1.2.2 光调制材料及其在生物分析中的应用 |
| 1.3 本论文的主要研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于二氧化钛的SERS涂层的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 TiO_2反蛋白石膜的制备 |
| 2.2.4 FAS-TiO_2涂层的制备 |
| 2.2.5 在FAS-TiO_2涂层上制备Ag颗粒沉积阵列 |
| 2.2.6 用于SERS检测的样品制备 |
| 2.2.7 SERS检测 |
| 2.2.8 样品测试完的后处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ag纳米颗粒在FAS-TiO_2表面的沉积行为 |
| 2.3.2 光照时间对Ag沉积行为的影响 |
| 2.3.3 液滴阵列的形成 |
| 2.3.4 HTS-SERS检测 |
| 2.3.5 基底材料的通用性 |
| 2.3.6 多元分析 |
| 2.3.7 基底的后处理 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于聚多巴胺的光功能涂层的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 PDA涂层的制备 |
| 3.2.4 PDA表面的光致金属化 |
| 3.2.5 PDA表面金属的光擦除 |
| 3.2.6 PDA表面的巯基及氨基修饰 |
| 3.2.7 SERS检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Ag纳米颗粒在PDA表面的沉积行为 |
| 3.3.2 影响PDA表面Ag沉积的各因素 |
| 3.3.2.1 光照时间 |
| 3.3.2.2 光照强度 |
| 3.3.2.3 反应机理的提出 |
| 3.3.2.4 溶剂 |
| 3.3.2.5 Ag~+浓度 |
| 3.3.2.6 光照波长 |
| 3.3.3 PDA表面的其他二次修饰 |
| 3.3.3.1 PDA表面的Au沉积 |
| 3.3.3.2 PDA表面的巯基和氨基修饰 |
| 3.3.4 PDA表面金属的光擦除 |
| 3.3.5 PDA表面金属化的应用 |
| 3.3.5.1 金属涂层的图案化 |
| 3.3.5.2 SERS检测 |
| 3.3.5.3 贵金属回收 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于胶体晶体的多重响应性涂层的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 葡萄糖响应的胶体晶体的制备 |
| 4.2.4 葡萄糖响应的胶体晶体微针的制备 |
| 4.2.5 具备SERS效应的胶体晶体及微针的制备 |
| 4.2.6 葡萄糖检测的体外实验 |
| 4.2.7 葡萄糖检测的在体实验 |
| 4.2.8 SERS检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 葡萄糖响应的胶体晶体 |
| 4.3.1.1 胶体晶体的制备 |
| 4.3.1.2 胶体晶体的葡萄糖响应性 |
| 4.3.2 葡萄糖响应的胶体晶体微针 |
| 4.3.2.1 胶体晶体微针的制备 |
| 4.3.2.2 胶体晶体微针的葡萄糖响应性 |
| 4.3.3 葡萄糖响应的胶体晶体微针贴片的动物实验 |
| 4.3.3.1 胶体晶体微针的力学性能 |
| 4.3.3.2 胶体晶体微针的活体葡萄糖响应性 |
| 4.3.3.2 胶体晶体微针的生物安全性 |
| 4.3.4 具备SERS效应的胶体晶体 |
| 4.3.4.1 具备SERS效应的胶体晶体(微针)的制备 |
| 4.3.4.2 SERS检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 发表论文及专利 |
| 获奖情况 |
| 致谢 |
（9）低温脂肪酶基因的克隆、表达及脂肪酶基因高通量筛选方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶概述 |
| 1.1.1 脂肪酶来源 |
| 1.1.2 脂肪酶分类与分子结构 |
| 1.1.3 脂肪酶性质 |
| 1.1.4 脂肪酶的应用 |
| 1.2 低温脂肪酶 |
| 1.2.1 低温脂肪酶的特征 |
| 1.2.2 低温脂肪酶的研究意义 |
| 1.2.3 低温脂肪酶的应用前景 |
| 1.3 宏基因组学 |
| 1.3.1 基因的获得 |
| 1.3.2 宏基因组文库的构建 |
| 1.3.3 宏基因组文库的筛选 |
| 1.4 生物传感器 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 低温脂肪酶基因的克隆、表达和生化表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、质粒、试剂、培养基和实验仪器 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 克劳氏芽孢杆菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 脂肪酶基因的获取 |
| 2.2.3 表达载体的构建 |
| 2.2.4 脂肪酶基因的重组表达 |
| 2.2.5 重组脂肪酶的纯化 |
| 2.2.6 蛋白浓度测定 |
| 2.2.7 脂肪酶的酶学性质 |
| 2.2.8 脂肪酶的生化表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 假单胞菌的分析 |
| 2.3.2 BcLip基因的克隆、表达和生化表征 |
| 2.3.3 PfLip的克隆、表达和生化表征 |
| 2.3.4 PgLip的克隆、表达和生化表征 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 高通量筛选脂肪酶基因方法的初步建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、载体、试剂、仪器及培养基 |
| 3.1.2 本章所有引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 fadE基因的敲除 |
| 3.2.2 针对脂肪酶高通量筛选系统的构建 |
| 3.2.3 针对脂肪酶高通量筛选系统的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 fadE基因的敲除 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 脂肪酶高通量筛选方法的初步应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株、载体、试剂、仪器及培养基 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 土壤宏基因组的构建 |
| 4.2.2 高通量筛选土壤宏基因组文库 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 土壤微生物宏基因组DNA的提取 |
| 4.3.2 土壤宏基因组DNA酶切效果比较 |
| 4.3.3 土壤宏基因组的酶切和回收 |
| 4.3.4 用于构建土壤文库p AR-Ds Red-Amp载体质粒 |
| 4.3.5 连接、转化以构建土壤宏基因组文库 |
| 4.3.6 高通量筛选土壤宏基因组文库 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）微波辅助反胶束体系甲烷氧化菌素拟酶催化反应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 过氧化物酶及模拟酶的研究现状 |
| 1.2 甲烷氧化菌素概述 |
| 1.2.1 甲烷氧化菌素简介 |
| 1.2.2 甲烷氧化菌素的研究现状 |
| 1.3 反胶束概述 |
| 1.3.1 反胶束的概念及优势 |
| 1.3.2 反胶束体系常用参数 |
| 1.3.3 反胶束体系中酶及模拟酶的增溶与催化研究 |
| 1.3.4 反胶束体系的研究现状 |
| 1.4 微波辅助酶催化反应的研究现状 |
| 1.5 本课题研究意义与内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 甲烷氧化菌素-铜拟酶配合物合成及反胶束体系构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.1 主要实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 甲烷氧化菌菌种 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 甲基弯菌OB3b的限铜条件培养 |
| 2.3.2 Mb的分离与纯化 |
| 2.3.3 Mb的浓度测定 |
| 2.3.4 Mb-Cu拟酶合成 |
| 2.3.5 Mb-Cu模拟酶活性测定 |
| 2.3.6 反胶束体系制备 |
| 2.3.7 临界胶束浓度(CMC)测定 |
| 2.3.8 反胶束体系中增溶水量的测定 |
| 2.3.9 反胶束电导率及粒径测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 Mb的浓度测定 |
| 2.4.2 甲烷氧化菌素模拟酶的合成 |
| 2.4.3 Mb-Cu拟酶活性测定 |
| 2.4.4 反胶束体系中临界胶束浓度测定 |
| 2.4.5 表面活性浓度和类型对反胶束中饱和增溶水量的影响 |
| 2.4.6 反胶束体系含水量对电导率的影响 |
| 2.4.7 含水量对反胶束粒径的影响 |
| 2.4.8 陈化时间对反胶束体系的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 反胶束中甲烷氧化菌素-铜配合物过氧化物酶拟酶活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.1 主要实验材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 模拟酶及反胶束体系制备 |
| 3.3.2 反胶束体系中甲烷氧化菌素模拟酶的拟酶活性测定 |
| 3.3.3 含水量对Mb-Cu模拟酶催化反应的影响 |
| 3.3.4 表面活性剂浓度对Mb-Cu模拟酶催化反应的影响 |
| 3.3.5 pH对 Mb-Cu模拟酶催化反应的影响 |
| 3.3.6 KCl浓度对Mb-Cu模拟酶催化反应的影响 |
| 3.3.7 H_2O_2 浓度对Mb-Cu模拟酶催化反应的影响 |
| 3.3.8 Mb-Cu模拟酶的稳定性研究 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 底物甲基氢醌的标准曲线 |
| 3.4.2 反胶束体系中Mb-Cu模拟酶催化反应的光谱变化 |
| 3.4.3 含水量对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.4 表面活性剂浓度对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.5 表面活性剂种类对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.6 pH对 Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.7 KCl浓度Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.8 H_2O_2 浓度对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 3.4.9 反胶束中Mb-Cu模拟酶的稳定性 |
| 3.4.10 反胶束中模拟酶的动力学研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 微波辅助反胶束体系中Mb-Cu的拟酶催化反应 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器设备 |
| 4.2.1 主要实验材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 模拟酶及反胶束体系制备 |
| 4.3.2 微波辅助反胶束中甲烷氧化菌素模拟酶的拟酶活性测定 |
| 4.3.3 温度对Mb-Cu拟酶活性影响 |
| 4.3.4 微波功率对Mb-Cu拟酶活性影响 |
| 4.3.5 反应时间对Mb-Cu拟酶活性影响 |
| 4.3.6 响应面优化实验 |
| 4.3.7 微波辐射与水浴加热方式对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 紫外光谱分析微波辅助模拟酶的催化 |
| 4.4.2 温度对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 4.4.3 微波功率对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 4.4.4 反应时间对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 4.4.5 响应面优化实验 |
| 4.4.6 微波辐射与水浴加热方式对Mb-Cu拟酶活性的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、酶催化生产生化级表面活性剂(英文)（论文参考文献）
- [1]N-月桂酰基谷氨酸钠的水相合成过程研究[D]. 裴壮壮. 江南大学, 2021(01)
- [2]番茄环氧化物水解酶的异源表达、分子改造及应用研究[D]. 胡博淳. 江南大学, 2021
- [3]构建生产三碳化合物的大肠杆菌细胞工厂[D]. 张超. 长春工业大学, 2021(01)
- [4]耐辐射异常球菌低温酯酶EstDR4的功能鉴定和分子改造[D]. 张亚格. 海南大学, 2021(09)
- [5]生物改性及表面活性剂结合策略对玉米秸秆生物质转化效率的影响[D]. 肖文静. 湖北大学, 2021(01)
- [6]金属有机骨架负载脂肪酶及其在油脂改性中的应用研究[D]. 陈文艺. 广东药科大学, 2021(02)
- [7]ATP以及S-腺苷甲硫氨酸的多酶催化合成研究[D]. 颜光波. 湖北大学, 2021(02)
- [8]用于生物分析的光功能涂层的构建[D]. 曾易. 东南大学, 2021(02)
- [9]低温脂肪酶基因的克隆、表达及脂肪酶基因高通量筛选方法的初步建立[D]. 张冰玉. 中国农业科学院, 2020(01)
- [10]微波辅助反胶束体系甲烷氧化菌素拟酶催化反应研究[D]. 马惠琳. 哈尔滨商业大学, 2020(10)