一、桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析（论文文献综述）
王博[1]（2021）在《我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选》文中认为第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科,全球共70余种,我国分布有17种,优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物,其主要组分为神经毒素和多种酶类,致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同,海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青环海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的组成,比较分析两者差异情况,本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象,首先构建了海蛇毒腺转录组数据库;其次利用液相色谱-质谱联用技术,通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析;在组学基础之上,我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下:1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序,成功构建了高质量的毒腺转录组数据库,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中进行了功能注释,在NR数据库中,两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注释中,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes,主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中;对简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点检测,平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点,其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高,均超过了50%。通过与Uni Prot动物毒素库（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比对,在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。2.通过液相色谱-质谱联用技术,获得Hcu V和Hcy V蛋白组分的原始肽段,匹配检索Uni Prot动物毒素数据库,在Hcu V和Hcy V中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类,鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类,但也有少数见于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通过毒素蛋白组比较分析发现,不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具体的蛋白组成也有一定差异。Hcu V和Hcy V中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分别为54%和38%,在Hcy V中分别为69%和22%,与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半数致死量(LD50)分别为0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很强的致死性;两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性,但无明显的促凝与抗凝活性,这些活性检测结果与组学分析结果相一致。本部分通过对Hcu V和Hcy V进行多组学分析,并结合蛇毒生物学活性检测,揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性,也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系,为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价海蛇毒主要组分为神经毒素,能阻断神经突触传递,从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强,可诱发严重的呼吸衰竭,死亡率高,目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清,但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清,对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示,不同海域、不同种类的海蛇,其毒素组成存在一定差异,因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清,本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原,经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤,制备了高效价的抗毒血清;并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价,明确了抗毒血清的有效用量和使用时机,为今后临床应用提供了参考。主要结果如下:1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化,使毒素抗原获得最大的免疫原性,免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清;经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后,抗海蛇毒血清中抗体F（ab’）2蛋白纯度达到91.6%,杂质大量减少,同时具备较好的毒素中和能力。2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）体外抗毒实验结果显示,Hcu AV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能够对抗1.2 mg平颏海蛇毒或0.9 mg青环海蛇毒,使半数实验动物存活,提示Hcu AV能交叉中和多种海蛇毒,并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。3.Hcu AV体内抗毒实验结果显示,海蛇咬伤中毒后注射Hcu AV能显着提高实验动物的存活率,但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果,预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时,Hcu AV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。本部分以平颏海蛇毒为抗原,制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清,能显着地降低中毒死亡率,保护机体脏器免受损伤,为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成,是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外,也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质,具有多样的药理学效应如:镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象,分离其毒腺组织,利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子,经过多轮淘选,筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆,通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等,最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽,并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下:1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库,文库库容达到2.2×109,随机测序验证外源插入片段准确无误;c-Myc标签检测结果表明,外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。2.以LPS为靶标分子,经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程,获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明,该多肽富含碱性氨基酸,理论分子量为2523.15,理论等电点为10.76,在中性溶液中携带正电荷;该多肽的二级结构主要为α-螺旋,氨基与羧基端呈现出双亲性结构,能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽,纯度超过95%,质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符,证明合成的多肽无误,可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定,结果表明,该多肽与LPS具有较强的结合能力,结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明,该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果,因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,简称Hc-ENP。4.体外实验结果表明,Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L浓度下,能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示,Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活,从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应,包括:炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等,进而发挥抗炎活性。5.体内实验结果表明,Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应,包括:靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选,从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP,其在体内外均有明确的LPS拮抗效果,本研究为进一步开发利用海蛇基因资源,探索其开发应用价值提供了新的途径。
杨玉娥[2]（2016）在《中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族》文中认为蛇毒中含有许多有用组分,近年来,质谱技术和高通量测序技术的不断发展加快了对蛇毒组分的剖析进程。和传统的技术相比,最新的测序平台可以对更多的蛇毒组分进行分析。蛇毒腺的高通量测序可以从mRNA水平了解样品中所转录的基因,除了获得毒素蛋白质,也能够检测出非酶毒素成分的信息。基于串联质谱法的蛇毒蛋白质组学研究依赖于已有蛋白质序列数据库的信息量,但可从另一个侧面验证高通量测序的结果,二者互为补充,将两者结合起来从全局的角度探索蛇毒素蛋白具有重大意义。中介蝮（Gloydius intermedius）属于蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalinae）亚洲蝮属（Gloydius）,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,广泛分布于我国西北及华北地区。为了了解中介蝮的毒素全貌,本研究采用IlluminaHiseq2500高通量测序技术结合LC-MS/MS技术对中介蝮毒腺转录组和蛋白组进行了分析。主要结果如下:1、中介蝮毒腺转录组分析（1）利用BlastX程序将中介蝮毒腺转录组组装得到的19821条Unigene对NR蛋白数据库进行搜索,10547个Unigene得到功能注释,其中编码毒素蛋白的Unigene有27个,分别归属为10个毒素家族,金属蛋白酶（MP）6个,磷脂酶A2（PLA2）6个,蛇毒C型凝集素样蛋白（CTLP）4个,丝氨酸蛋白酶（SP）3个,三指毒素（3FTx）3个,透明质酸酶（Hydase）、磷酸二酯酶（PDE）、富含半胱氨酸的分泌蛋白（CRISP）、L-氨基酸氧化酶（L-AAO）以及神经生长因子（NGF）各1个。（2）按照RPKM值所揭示的表达丰度,毒素表达水平从高到低的排序依次为:PLA2 家族（82435.79）>SP 家族（30758.48）>CTLP 家族（6562.87）>L-AAO 家族（6347.89）>NGF 家族（4857.31）>CRISP 家族（1204.57）>MP 家族（1020.96）。其余低表达的毒素包括 PDE 家族（191.29）>Hydase 家族（148.39）>3-FTx 家族（27.93）。（3）对新获得的9个Gisps基因的序列进行的氨基酸序列分析表明,Gisp1和Gisp3属于激肽原酶（Kininogennase,KN）型丝氨酸蛋白酶;Gisp2属于蛋白酶C激活剂（C-protein activator,PCA）型;Gisp4 和 Gisp5 属于凝结酶（Cogulating enzymes,CL）型;Gi-PA1-4 属于纤溶酶原激活剂（plasminogen activators,PA）型。（4）实时定量PCR分析表明,中介蝮9个Gisps的相对表达量由高到底依次为:Gisp1>Gi-PA1>Gisp2>Gi-PA2>Gisp3>Gi-PA3>Gisp4>Gi-PA4>Gisp5。2、中介蝮毒素蛋白组分析采用LC-MS/MS技术对中介蝮粗毒样品进行鉴定,结果表明共有1146条肽段匹配到10个毒素家族,即510,356,192,27,26,12,12,7,2,2条肽段分别匹配到SP,LAAO,PLA2,MP,CTLP,CRISP,BPP-CNP,PDE,Hydase和NGF等毒素家族。值得注意的是,未发现PLB和3-FTx家族的肽段。比较转录组和蛋白组分析结果,可以看出SP、LAAO和PLA2是表达量最高的3个毒素家族。3、中介蝮丝氨酸蛋白酶的分离纯化及活性测定由于丝氨酸蛋白酶是中介蝮毒素中表达量较高的家族之一,该家族在医药领域有广泛的应用,尤其是在心血管疾病治疗方面。本研究在上述组学研究的基础上,通过凝胶过滤层析及阴离子交换层析对其粗毒进行了分离纯化,得到丝氨酸蛋白酶组分,利用特定底物对其活性分析进行了测定,利用SDS-PAGE分析了丝氨酸蛋白酶在每个组分中的含量,结果如下:（1）利用凝胶过滤层析介质Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行了分离得到6个组份,用小分子合成多肽底物BApNA检测丝氨酸蛋白酶活性,发现丝氨酸蛋白酶活性主要分布在P3组分,该组分为混合物,需要做进一步分离。（2）利用阴离子交换层析介质HiTrap DEAE FF对P3组分进行了进一步分离得到5个蛋白组份（P3-1～P3-5）。以4个合成发色肽（B7632、T1637、B2133、V7127）为底物检测发现:分离得到的5个组分（P3-1～3-5）的类激肽释放酶活性都比较低;P3-1和P3-2都显示出较高的凝血酶活性及类凝血酶活性,而纤溶酶活性及类激肽释放酶活性较低;P3-3具有较高的纤溶酶活性及凝血酶活性;对5个组分中丝氨酸蛋白酶所在位置（26kDa～35kDa）的分析意外的发现:P3-1和P3-2中丝氨酸蛋白酶相对含量较高但丝氨酸蛋白酶活性较低,而P3-3中丝氨酸蛋白酶含量相对较低,但是丝氨酸蛋白酶活性较高;P3-4和P3-5对四种底物都没有明显的水解活性。表明P3-4和P3-5中几乎不含有丝氨酸蛋白酶。结合对9种Gisps的理化性质的预测结果,推测 Gisp3、Gisp4、Gisp5 分布在 P3-1 中,Gisp1 分布于 P3-2 中,Gi-PA1、Gi-PA2、Gi-PA3 分组在 P3-3 中,Gi-PA4 分布于 P3-1 或 P3-2 当中。结论:（1）在亚洲蝮属的6个物种中,中介蝮毒素中表达的PLA2神经毒素最高,而其他大多数亚洲蝮主要含有出血性的毒素。和响尾蛇类似,本研究在亚洲蝮毒素中发现了毒素进化的二态现象。同时还发现亚洲蝮毒素中存在神经毒素与降血压组分（如KN-type SP和BPP-CNP）的共进化趋势。（2）在中介蝮蛇毒中只存在P-ⅢMP而没有P-Ⅰ和P-ⅡMP.获得了 9个丝氨酸蛋白酶家族成员。Gisp1和Gisp3为KN型,Gisp2为PCA型,Gisp4和Gisp5为CL型,Gi-PA1-4属于PA型丝氨酸蛋白酶。（3）除CRISP和Hydase,大部分中介蝮毒素的氨基酸序列与其他蝮蛇或者响尾蛇有高度的相似性（>90%）。蛇毒素的快速进化主要表现在一些关键毒素家族的表达水平差异以及新型毒素蛋白,而不是影响编码序列的点突变。
郭妍妍[3]（2011）在《纤溶酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达》文中研究指明血栓性疾病已成为常见病和多发病,列致残和致死病因的第一位,严重影响人类生存质量和寿命,针对溶栓药物的临床应用要求,研发特异、高效、安全、价廉的纤溶酶类溶栓药物具有广阔应用前景。运用分子生物学技术和基因工程技术,将现有溶栓药的优点集合起来,设计出完美的溶栓药将是国内外的研究热点,同时,开发新型天然来源溶栓药和探索新型结构溶栓药将是今后研究方向。假蕈状芽孢杆菌纤溶酶BpFE是土壤中分离得到的一种新型纤溶酶,基因全长1701 bp（GenBank FJ463037）,其中954 bp为成熟肽基因,据报道基因全长编码成熟肽之前的序列（基因长为747 bp）可能与调控有关,为了进一步探讨之间的关系,即分析前端序列的作用及是否与活性有关,所以本工作进行了成熟肽基因的克隆与表达研究,并且为了将来的生产和研究摸索了其在毕赤酵母中的表达研究,主要研究内容如下:结合本实验室对假蕈状芽孢杆菌纤溶酶BpFE的报道,分析其基因序列,设计合成一对含EcoRI和XhoI酶切位点的引物,扩增得到纤溶酶成熟肽基因G,使用EcoRI和XhoI双酶切表达载体pET-28a和纤溶酶成熟肽基因,通过连接构建了重组质粒pET-28a-G,利用热激转化法转化宿主菌DH5α后测序。测序结果表明,插入序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank中BpFE成熟肽的954 bp序列一致。BpFE所包含的锌蛋白酶家族结构域（序列为VIGHELTHAV）没有发生改变。将重组质粒pET-28a-G转化大肠杆菌宿主菌BL21,成功获得pET-28a-G/BL21工程菌。终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白表观分子量约为40 kD,与理论值一致。诱导菌体超声破壁后用纤维蛋白平板法检测表达产物具有纤溶酶活性,并进一步镍柱亲和层析获得纯化,纯化产物有纤溶酶活性。由此说明基因全长编码成熟肽之前的序列在原基因组序列中起调控作用,对纤溶酶的活性无直接影响,因此成熟肽部分就表现有纤溶酶活性。为利于外源基因的胞外表达便于工业生产,将纤溶酶全长基因BpFE克隆到毕赤酵母中进行初步研究。根据所获得的基因序列FJ463037和真核表达载体pPIC9K的多克隆位点重新设计含有EcoRI和Not I酶切位点的引物,构建重组质粒pPIC9K-G。将重组质粒线性化后,电转化毕赤酵母GS115中构建重组菌株pPIC9K-G/GS115,经MD、MM平板快慢型初筛和G418加压筛选得到阳性转化菌株,25℃甲醇诱导后,得到表观分子量为64 kD的有纤溶活性的蛋白。镍柱亲和层析纯化后用纤维蛋白平板法检测到纤溶酶活性。本文采用分子克隆及基因重组技术,不但成功表达了纤溶酶BpFE成熟肽基因,探讨了纤溶酶BpFE的全长基因和成熟肽基因之间的关系,而且纤溶酶BpFE全长基因在真核生物毕赤酵母中也得到了有效表达,为基因工程药物的研究开发奠定必要的理论和实践基础。
刘慧娟,郭晓军,郭妍妍,朱宝成[4]（2011）在《假蕈状芽孢杆菌34kDa纤溶酶成熟肽基因的原核表达、纯化及活性分析》文中研究表明为进一步探讨全长基因和成熟肽基因的关系,根据已发表的假蕈状芽孢杆菌34 kDa纤溶酶全长基因DNA序列（GenBank FJ463037）和纤溶酶活性位点的位置,设计合成一对引物,扩增得到纤溶酶成熟肽基因G（951 bp编码317个氨基酸）,连接pET-28a构建pET-28a-G载体,热激转化大肠杆菌BL21,成功获得pET-28a-G/BL21工程菌。终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测表达在胞内的融合蛋白,融合蛋白表观分子量约为40 kDa,符合所预测的结果。诱导菌体超声破壁后用纤维蛋白平板法检测表达产物具有纤溶酶活性,镍柱亲和层析纯化后的目的产物仍保留纤溶活性。本研究成功得到了34 kDa纤溶酶成熟肽基因活性表达的重组菌。
张志晓[5]（2010）在《利用生物信息学方法制备尖吻蝮蛇蛇毒DNA疫苗》文中研究表明长久以来,毒蛇咬伤给人们的生产生活带来了严重危害,据世界卫生组织网站最新公布的数字显示:全世界每年被蛇咬伤的人数有250万人,导致死亡人数高达12.5万人。我国每年毒蛇咬伤患者达10万人次,其中73%为中青年,死亡率为5%～10%,蛇伤致残丧失劳动能力者占25%～30%。蛇毒毒素按其性质可分为神经毒、血循毒、混合毒三大类。蛇毒中引起出血的主要是血循毒中的蛇毒金属蛋白酶。根据已报道的蛇毒金属蛋白酶的cDNA序列和蛋白质的结构,将蛇毒金属蛋白酶分成4类:其中PI类仅含金属蛋白酶域,分子量20～30kDa;PII类含金属蛋白酶域和去整合素域,分子量30～50kDa;PIII类含金属蛋白酶域、去整合素域和富半胱氨酸域,分子量50～80kDa;PIV类在PIII类基础上多了二硫键连接的类C型凝集素域。传统的治疗毒蛇咬伤的方法是外敷、口服中草药和注射抗蛇毒血清。由于中草药的治疗机制没有完全弄清楚,因此其使用范围较小。抗蛇毒血清是目前世界公认的最有效的治疗蛇伤药物,但由于蛇毒本身成分复杂,含有数百种功能各异的蛋白质,用全毒免疫马生产的抗蛇毒血清中,不仅含有能中和毒素成分的抗体,同时也含有大量针对蛇毒中其它非毒素成分的抗体,这不仅使得抗血清的临床使用剂量大大增加,增加了过敏反应几率,也浪费了宝贵的血清资源。为了更有效、快捷的获得多价、特异性强的蛇毒抗体,我们用生物信息学方法预测蛇毒中能诱导机体产生特异性免疫反应的抗原位点,并通过实验验证其有效性,以从毒腺总RNA中扩增出的天然抗原位点序列作为阳性对照。本实验选取血循毒的代表蛇种尖吻蝮蛇,BLAST得到所有已经提交到GenBank数据库中的尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶序列,用Jameson-Wolf方法和Clustal X软件分析其抗原位点,人工合成含有各个位点的序列,连接到真核表达载体pIRESneo后免疫小鼠,诱导其产生抗体,通过ELISA实验、出血中和实验和攻毒实验测定DNA疫苗的效果,将天然的PIII金属蛋白酶DNA疫苗作为阳性对照。实验结果表明,用人工合成的抗原位点序列和PIII金属蛋白酶序列均能诱导小鼠产生抗体,ELISA实验测定二者诱导的血清稀释100倍均能检测到抗体,出血中和实验表明对蛇毒引起的出血有明显中和效果,攻毒实验测定的活体保护率均为80%;且比较两者的效果差异不显着,说明用生物信息学方法预测抗原位点的方法是可行和可靠的。本研究为以后通过生物信息学方法制备多价抗蛇毒DNA疫苗奠定了理论和实验基础。
王彩娥[6]（2009）在《眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抑制血小板聚集作用及其部分机制研究》文中研究说明目的:研究从中华眼镜蛇毒中分离纯化出的金属蛋白酶atrase A和B抑制血小板聚集的作用及其部分机制;并对补体激活引起血小板活化、聚集的抑制作用进行评价。方法:采用比浊法测定atrase A和B对六种诱导剂（ADP、AA、PAF、胶原、瑞斯托霉素、凝血酶）引起的血小板聚集的抑制作用,蛋白免疫印迹法测定atrase A和B对血小板膜糖蛋白GPⅠb和vWF的裂解作用;采用眼镜蛇毒因子激活补体,观察atrase A和B对补体激活引起血小板聚集的抑制作用,流式细胞仪检测血小板活化膜P-选择素和糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的表达。结果:Atrase A和B能显着抑制瑞斯托霉素和凝血酶诱导的血小板聚集,并呈一定的剂量和时间依赖性,和血小板预孵5min,Atrase A和B对上述六种诱导剂引起的血小板聚集有较弱的抑制作用,延长至30min有明显的抑制作用。蛋白免疫印迹法结果显示atrase A和B特异性的水解血小板膜糖蛋白GPⅠb,但对vWF则没有裂解作用。Atrase A和B还能有效抑制补体激活引起的血小板活化、聚集;流式细胞仪结果显示atrase A和B能明显抑制补体激活引起的血小板膜P-选择素和糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的表达,这种抑制作用呈量效时效关系。结论:从中华眼镜蛇毒中分离纯化的atrase A和B通过水解血小板膜糖蛋白GPⅠb而显着抑制瑞斯托霉素和凝血酶引起的血小板聚集,对ADP、AA、PAF、胶原引起的血小板聚集呈时间依赖性的抑制作用;且能有效抑制补体激活引起的血小板活化、聚集。
姜升阳[7]（2005）在《尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理研究目的: 抗血小板药物是抗血栓药物中非常重要的一类,血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa(即整合素α2bβ3)阻断药是第三代抗血小板药,它可阻断血小板凝集的最终通路,不仅具有极强的抗血小板凝集作用,而且不会增加出血危险性。目前应用于临床的GPⅡb/Ⅲa阻断药主要以阿昔单抗、埃替非巴肽、替罗非班为代表,但这些药物来源困难,国内应用目前主要依赖进口,价格居高不下,很难满足我国普通民众的医疗需要,因此迫切需要我们自己研发一种可大量制备,工艺简便,成本低廉的抗血小板新药。 蛇毒中含多种具有生物活性的蛋白质,在抗血栓、止血、镇痛和抗肿瘤等多方面具有良好的应用前景。蛇毒去整合素是蛇毒前金属蛋白酶原的加工产物,它可阻断α2bβ3、αvβ3、α5β人1整合素与其配体结合,具有抑制血小板聚集、抗肿瘤、诱导血管内皮细胞凋亡等功能。蛇毒成分复杂,从蛇毒中直接分离目的蛋白不但难度高、工艺繁琐,而且蛇资源日益溃乏,蛇毒来源受限,若应用分子生物学方法体外表达蛇毒蛋白,则可大大降低生产成本,提高蛋白质产量。 基于以上目的,我们从广西产尖吻蝮蛇毒腺中提取RNA,应用基因工程方法克隆表达一种新的去整合素,并对其生物学功能进行了初步分析。 研究内容与结果: 1.尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与序列分析 本研究从广西产尖吻蝮蛇毒腺组织提取了总RNA,经反转录获得了cDNA
闫峻[8]（2005）在《乌苏里蝮蛇具抑制血小板聚集活性的金属蛋白酶分离纯化及基因信息学分析》文中认为提取中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺mRNA,逆转录合成cDNA,并以其为模板,进行PCR 扩增,PCR 产物克隆入pGEM-T Easy 载体并进行了序列分析。结果显示,乌苏里蝮蛇前金属蛋白酶原基因开框读码序列由1434bp 组成,编码478 个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出,前金属蛋白酶原基因最初的翻译产物是酶原前体;依次含有18 氨基酸组成的信号肽,171 个氨基酸组成的酶原区和由289 个氨基酸组成的前金属蛋白酶原基因（200 个氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16 个氨基酸组成的间隔区和73 个氨基酸组成的解整合蛋白结构域）。乌苏里蝮蛇前金属蛋白酶原的金属蛋白酶结构域含有3 对二硫键;解整合蛋白结构域含有6 对二硫键和特征性RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）结构。其基因序列和结构域组成与GenBank 中蛇毒金属蛋白酶/解整合蛋白呈现高度同源性属于PⅡ。氨基酸序列blast 比对发现,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域。
杨海波,樊晓晖,侯小琼,黄企光,黎肇炎[9]（2004）在《桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析》文中提出目的 :克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因 ,并对其进行序列分析。方法 :采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经 RT- PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因 ,将扩增产物克隆至 p GEM- T Easy载体 ,挑选白色菌落 ,用酶切和 PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化 PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果 :RT- PCR和 PCR扩增得到一约 1137bp产物 ,并将其克隆及测序。结论 :和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较 ,二者之间有 91%的同源性
杨海波,樊晓晖,侯小琼,黄企光,黎肇炎[10]（2003）在《桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1200 bp片段的克隆和序列分析》文中研究表明 五步蛇含有丰富的与血液凝固和纤溶作用有关的蛋白水解酶,根据其结构不同,主要分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,类凝血酶属于前者,后者如纤溶酶属于金属蛋白酶家族。80年代末以来,随着部分蛇毒出血毒素氨基酸序列的测定和生化性质的深入研究,发现大部分出血毒素都是含锌金属蛋白酶,其特点是含有一个结合锌离子的保守区域HEXXHXXGXXH,为金属蛋白酶的活性中心。
二、桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗平颏海蛇毒血清的制备及抗毒效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛇毒中活性组分的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 转录组介绍 |
| 1.2 蛋白组介绍 |
| 1.3 目前已发现的主要蛇毒素家族介绍 |
| 1.3.1 蛇毒磷脂酶A2(PLA2) |
| 1.3.2 蛇毒金属蛋白酶(MP) |
| 1.3.3 蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO) |
| 1.3.4 蛇毒磷酸二酯酶(PDE) |
| 1.3.5 透明质酸酶(Hydase) |
| 1.3.6 富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISP) |
| 1.3.7 神经生长因子(NGF) |
| 1.3.8 舒缓激肽增强肽(BPP-CNP) |
| 1.3.9 蛇毒C-型凝集素样蛋白(CTLP) |
| 1.3.10 三指毒素(3-FTx) |
| 1.4 蝮亚科主要毒蛇的组学研究进展 |
| 1.5 蛇毒丝氨酸蛋白酶家族研究概况 |
| 1.5.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶超家族分类 |
| 1.5.2 蛇毒丝氨酸蛋白酶家族结构概述 |
| 1.5.3 几种已知空间结构的蛇毒丝氨酸蛋白酶结构与功能关系 |
| 1.5.4 蛇毒丝氨酸蛋白酶的分离纯化 |
| 1.5.5 丝氨酸蛋白酶活性检测常用底物 |
| 1.5.6 丝氨酸蛋白酶的临床应用 |
| 1.6 中介蝮研究现状 |
| 1.7 选题依据及意义 |
| 第2章 中介蝮毒素转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 毒腺总RNA的提取 |
| 2.3.2 构建cDNA文库 |
| 2.3.3 转录组数据组装及分析 |
| 2.3.4 Gisps的系统进化树分析 |
| 2.3.5 实时定量PCR检测GiSPs的相对表达量 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 中介蝮毒腺总RNA质量检测 |
| 2.4.2 数据产量统计与质量评估 |
| 2.4.3 转录组数据组装结果 |
| 2.4.4 Unigene功能注释结果统计: |
| 2.4.5 PLA2家族分析 |
| 2.4.6 svSP家族分析 |
| 2.4.7 CRISP家族分析 |
| 2.4.8 CTLP家族分析 |
| 2.4.9 Hydase家族分析 |
| 2.4.10 svMP家族分析 |
| 2.4.11 L-AAO家族分析 |
| 2.4.12 其他低丰度毒素家族 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 2.5.1 svSP家族讨论 |
| 2.5.2 CTLP家族讨论 |
| 2.5.3 svMP家族讨论 |
| 2.5.4 LAAO家族讨论 |
| 第3章 中介蝮毒素蛋白组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 FASP酶解 |
| 3.3.2 LC-MS/MS质谱鉴定 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第4章 中介蝮丝氨酸蛋白酶家族的分离纯化及初步表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.2.1 中介蝮粗毒 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 中介蝮蛇毒采集及处理 |
| 4.3.2 蛋白浓度的测定 |
| 4.3.3 凝胶过滤层析 |
| 4.3.4 阴离子交换 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 凝胶过滤层析结果 |
| 4.4.2 阴离子交换层析结果 |
| 4.5 本章小结与讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（3）纤溶酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 血栓性疾病及危害 |
| 1.2 血栓疾病的治疗及溶栓药物的发展 |
| 1.2.1 血栓性疾病的治疗方法 |
| 1.2.2 溶血栓药物的发展 |
| 1.3 纤溶酶类溶栓剂的来源及研究 |
| 1.3.1 动物来源的纤溶酶 |
| 1.3.2 植物来源的纤溶酶 |
| 1.3.3 微生物来源的纤溶酶 |
| 1.4 纤溶酶基因克隆表达的研究 |
| 1.5 大肠杆菌表达系统 |
| 1.5.1 表达载体 |
| 1.5.2 各种类型表达系统的构成及特点 |
| 1.5.3 目的蛋白表达的形式和在细胞中的位置 |
| 1.5.4 大肠杆菌表达系统研究的新进展 |
| 1.6 毕赤酵母表达系统研究 |
| 1.6.1 表达菌株 |
| 1.6.2 表达载体 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要培养基及试剂 |
| 2.2 大肠杆菌表达方法 |
| 2.2.1 假蕈状芽孢杆菌基因组DNA 的提取 |
| 2.2.2 DNA 的纯度检测 |
| 2.2.3 引物设计与合成 |
| 2.2.4 成熟肽基因的扩增 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.2.6 PCR 产物回收 |
| 2.2.7 载体与PCR 产物的酶切 |
| 2.2.8 酶切产物的纯化 |
| 2.2.9 载体与目的片段的连接 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.12 阳性重组克隆的筛选 |
| 2.2.13 质粒 DNA 的酶切验证 |
| 2.2.14 序列分析 |
| 2.2.15 重组菌在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.16 镍柱亲和层析 |
| 2.2.17 表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 2.2.18 表达蛋白活性的检测 |
| 2.3 毕赤酵母表达方法 |
| 2.3.1 引物设计与合成 |
| 2.3.2 目的片段的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒pPIC9K-G 的构建 |
| 2.3.4 重组表达载体的线性化 |
| 2.3.5 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 |
| 2.3.6 甲醇利用表型的确定 |
| 2.3.7 重组酵母的PCR 验证 |
| 2.3.8 多拷贝转化子的筛选 |
| 2.3.9 目的基因在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.10 TCA 浓缩步骤 |
| 2.3.11 镍柱亲和层析及活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大肠杆菌表达结果 |
| 3.1.1 假蕈状芽孢杆菌DNA 的提取及检测 |
| 3.1.2 引物设计与合成 |
| 3.1.3 纤溶酶BpFE 成熟肽基因扩增 |
| 3.1.4 重组质粒pET28a-G 的双酶切检测 |
| 3.1.5 重组质粒pET28a-G 的测序分析 |
| 3.1.6 重组菌的诱导表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 3.1.7 融合蛋白的纯化 |
| 3.1.8 融合蛋白的活性检测 |
| 3.2 毕赤酵母表达结果 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 纤溶酶基因BpFE 的扩增 |
| 3.2.3 重组质粒pPIC9K-G 的双酶切检测 |
| 3.2.4 重组质粒pPIC9K-G 的测序结果 |
| 3.2.5 重组酵母甲醇利用表型的确定 |
| 3.2.6 重组毕赤酵母的PCR 鉴定 |
| 3.2.7 多拷贝转化子的筛选 |
| 3.2.8 重组菌的诱导表达 |
| 3.2.9 镍柱亲和层析后SDS-PAGE 检测 |
| 3.2.10 纯化后产物的活性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 4 小结与展望 |
| 4.1 本论文的主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（4）假蕈状芽孢杆菌34kDa纤溶酶成熟肽基因的原核表达、纯化及活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计、G基因的扩增 |
| 1.2.2 表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组菌的诱导表达 |
| 1.2.4 镍柱亲和层析及活性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 G基因的克隆 |
| 2.2 重组质粒的双酶切检测 |
| 2.3 重组质粒的测序分析 |
| 2.4 重组菌的诱导表达 |
| 2.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.6 融合蛋白的活性检测 |
| 3 讨论 |
（5）利用生物信息学方法制备尖吻蝮蛇蛇毒DNA疫苗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言及研究背景 |
| 1.1 毒蛇种类及危害 |
| 1.2 研究背景及意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 主要方法 |
| 2.2.1 总RNA 提取 |
| 2.2.2 通过RT-PCR 方法进行cDNA 合成 |
| 2.2.3 扩增PI 金属蛋白酶cDNA 序列 |
| 2.2.4 扩增PIII 金属蛋白酶cDNA 序列 |
| 2.2.5 胶回收DNA 片段 |
| 2.2.6 连接T 载体 |
| 2.2.7 转化DH5α感受态细胞 |
| 2.2.8 质粒小量提取 |
| 2.2.9 序列测定 |
| 2.2.10 生物信息学方法进行抗原位点分析 |
| 2.2.11 连接真核表达载体pIRESneo |
| 2.2.12 质粒大量制备 |
| 2.2.13 质粒免疫小鼠 |
| 2.2.14 全毒免疫马 |
| 2.2.15 用ELISA 法检测抗体水平 |
| 2.2.16 出血中和实验 |
| 2.2.17 攻毒实验 |
| 2.2.18 实验结果数据统计分析 |
| 第三章 结果及数据分析 |
| 3.1 总RNA 提取结果和鉴定 |
| 3.2 扩增PI 金属蛋白酶cDNA 序列结果 |
| 3.3 扩增PIII 金属蛋白酶cDNA 序列结果 |
| 3.4 酶切鉴定pMD19-T 质粒 |
| 3.5 测定的金属蛋白酶cDNA 序列 |
| 3.6 用BLAST 检索到的序列 |
| 3.7 生物信息学方法分析得到的抗原位点 |
| 3.8 人工合成序列 |
| 3.9 连接真核表达载体pIRESneo 结果 |
| 3.10 用ELISA 法检测抗体水平结果 |
| 3.11 出血中和实验结果 |
| 3.12 攻毒实验结果 |
| 第四章 讨论及展望 |
| 4.1 重叠延伸PCR 方法的使用 |
| 4.2 生物信息学方法进行抗原位点分析 |
| 4.3 蛇毒DNA 疫苗和佐剂 |
| 4.4 免疫效果评价 |
| 4.5 下一步实验计划 |
| 4.6 展望 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抑制血小板聚集作用及其部分机制研究（论文提纲范文）
| 眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抗血小板聚集及其部分机制研究 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抗血小板聚集的作用及其机制研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抑制补体激活引起的血小板聚集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述1 蛇毒金属蛋白酶与血小板作用的研究进展 |
| 综述2 补体激活与血小板聚集的研究进展 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（7）尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一节 尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与序列分析 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与分析 |
| 第二节 原核表达载体构建 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与分析 |
| 第三节 融合蛋白的表达与纯化 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与分析 |
| 第四节 融合蛋白体外抑制血小板聚集活性的初步分析 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与分析 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 在学期间发表的论文 |
| 在学期间发表的综述(一) |
| 在学期间发表的综述(二) |
| 致谢 |
（8）乌苏里蝮蛇具抑制血小板聚集活性的金属蛋白酶分离纯化及基因信息学分析（论文提纲范文）
| 英文缩写词 |
| 引言 |
| 乌苏里蝮蛇金属蛋白酶分离纯化和特性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果与讨论 |
| 乌苏里蝮蛇前金属蛋白酶原基因克隆和序列分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
四、桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选[D]. 王博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族[D]. 杨玉娥. 陕西师范大学, 2016(04)
- [3]纤溶酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达[D]. 郭妍妍. 河北农业大学, 2011(07)
- [4]假蕈状芽孢杆菌34kDa纤溶酶成熟肽基因的原核表达、纯化及活性分析[J]. 刘慧娟,郭晓军,郭妍妍,朱宝成. 华北农学报, 2011(02)
- [5]利用生物信息学方法制备尖吻蝮蛇蛇毒DNA疫苗[D]. 张志晓. 云南大学, 2010(05)
- [6]眼镜蛇毒金属蛋白酶atrase A和B抑制血小板聚集作用及其部分机制研究[D]. 王彩娥. 遵义医学院, 2009(S1)
- [7]尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析[D]. 姜升阳. 中国人民解放军军事医学科学院, 2005(06)
- [8]乌苏里蝮蛇具抑制血小板聚集活性的金属蛋白酶分离纯化及基因信息学分析[D]. 闫峻. 吉林大学, 2005(06)
- [9]桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析[J]. 杨海波,樊晓晖,侯小琼,黄企光,黎肇炎. 广西医科大学学报, 2004(06)
- [10]桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1200 bp片段的克隆和序列分析[A]. 杨海波,樊晓晖,侯小琼,黄企光,黎肇炎. 广西微生物学会2003年学术年会论文集, 2003