一、三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响（论文文献综述）
向华[1]（2018）在《可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究》文中研究表明禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）、马立克病病毒（Marerk’s disease virus,MDV）、传染性法氏囊病病毒（Infectious butsal disease virus,IBDV）是引发家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）是引发家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于传统的诊断检测方法难以进行多病原或多病原型的联合检测,使生产上发生的同类型疫病短时间内难以鉴别。考虑到家禽疫病防控急需,基于上述六种病原的高通量同步检测和部分病原同步分型检测方法尚未见报道。本研究结合金标银染显色技术,构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检可视化基因芯片,对芯片的制备及检测过程进行条件优化,并对临床初步应用进行评价。研究主要结果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建与检测条件优化。以ALV、MDV、IBDV的全基因组为模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,设计寡核苷酸探针,成功制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共检基因芯片（简称共检芯片Ⅰ）。对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol/L,40℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的使用浓度为4μg/mL,染色时间为5min,对阳性标本最终银染显色可见明显检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。芯片检测特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,特异性好,且以IBV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅰ杂交;敏感性试验显示,芯片的最低检测浓度是1pg/μl。稳定性试验发现,基因芯片能在常温条件下进行有效保存不少于60 d,4℃条件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片构建与检测条件优化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因组,以及合成制备的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6个靶基因,并成功制备出H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片（简称共检芯片Ⅱ）;对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现使用浓度为50μmol/L的寡核苷酸探针与含有生物素标记的靶基因PCR产物45℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的最佳使用浓度为4μg/mL,银染7min,阳性标本银染显色可见明显的检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。基因芯片的特异性试验显示芯片特异性高,无交叉反应,且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅱ杂交;敏感性试验显示芯片的敏感性好,H5和N1亚型芯片的最低检测浓度是1×10-10ngul,H7亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,N9亚型检测芯片的最低检测浓度是1×10-7ngul,H9和N2亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,均不同程度的高于RT-PCR检测技术;稳定性试验显示,本研究建立的可视化芯片4℃条件下可保存不少于90d。三、共检芯片Ⅰ和共检芯片Ⅱ的初步临床应用将本研究构建的两套基因芯片对四川安岳、彭州、泸州、广元、自贡、乐山、广汉、温江、重庆、山东等地区疑似患禽白血病、马立克病、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫和传染性喉气管炎的155份临床送检样品进行检测,其中,六类禽病毒病基因芯片的检测结果为ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的阳性检出率分别为7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV为4.5%,NDV和AIV为2.5%,ALV、MDV和IBDV为0.6%,ALV、AIV和NDV为1.2%,该检测方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR检测方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检芯片的检测结果为H5、H7、H9、N1、N9、N2的阳性检出率分别为4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亚型检出率为21.7%,H9N2亚型检出率为4.3%,H5和H9亚型共同感染检出率为4.3%,该检测方法与RT-PCR方法相比,敏感性为100%,特异性高于92.8%,符合率高于95.6%,对二者结果进行差方检验的Kappa值均>0.80,表明两种检测方法具有很好的一致性。综上,本研究成功构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型同步共检基因芯片,两种基因芯片具备较好的特异性、灵敏性和稳定性,能有效应用于上述禽类疫病的临床样本检测,为此类禽疫病的快速鉴别诊检提供了新的先进手段。
刘志鹏[2]（2018）在《同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用》文中研究指明猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒A型（Group A rota virus,GAR）以及猪delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原,这四种仔猪腹泻病在临床表现非常相似,难以鉴别诊断。本研究针对PEDV、TGEV、GAR以及PDCoV四种腹泻病毒,将酶促反应显色技术、不对称PCR单链扩增技术和基因芯片技术相结合,构建一套PEDV-TGEV-G AR-PDCoV可视化酶促寡核苷酸共检基因芯片技术,进行了初步临床应用评价研究。研究结果结果显示,各目的基因的不对称PCR上下游引物最佳浓度比分别为:PEDV-S:1:20;PEDV-M:1:10;TGEV-S:1:20;TGEV-N:1:20;GAR-VP7:1:10;GAR-NSP4:1:10;PDCoV-M:1:10;PDCoV-N:1:20,此时目的片段的单链产物量最多。确定了芯片检测的操作程序为:在50℃环境中杂交90 min后,进行洗涤。与2000倍稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶酶联后用DAB显色液显色后进行结果判读。本研究根据阳性对照生成棕褐色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。该可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR以及P DCoV的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV及FMDV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;各探针基因的灵敏性均可达10p g/μl（2.83×106copies/μl）;芯片在保存180天后仍可进行有效检测。研究应用所构建的芯片对四川、重庆地区的200份临床送检样本进行了检测。本研究成功构建了一套能高通量检测四种仔猪腹泻疾病的酶促可视化基因芯片,该方法特异性强,灵敏度高,为临床鉴别仔猪腹泻类疾病提供了一种新的方法。
杜培[3]（2017）在《小麦、百萨偃麦草和花生染色体荧光原位杂交寡核苷酸探针（套）开发与应用》文中研究指明小麦（Triticum aestivum,2n=6x=42,AABBDD）是我国重要的粮食作物。百萨偃麦草（2n=2x=14,JJ）具有很强的耐盐性和抗多种小麦病害,是小麦改良的重要基因资源。染色体工程是小麦改良的有效途径,然而由于传统荧光原位杂交（FISH）所用的质粒探针数目有限,制备程序繁琐、成本高,因此限制了染色体工程效率的提高。寡核苷酸（single strand oligonucleotide,SSON）探针是人工合成的一种带有荧光集团的单链DNA或RNA片段,其长度通常为20～60 nt,具有易设计、合成和修饰,成本低、灵敏度高、重复性好等特点。基于寡核苷酸探针的寡核苷酸FISH技术省去了传统FISH制备探针必需的质粒引进、繁殖、提取、标记或PCR扩增等程序,具有简单、经济和高效的特点,是新一代染色体鉴定技术,具有很大的研究和应用潜力。（1）通过探针长度和浓度效应分析,发现29～59 nt比14～15 nt SSON探针在低浓度下更容易产生清晰稳定的信号,据此建立了利用已知重复序列、小麦染色体3B和百萨偃麦草染色体4JL基因组序列开发重复序列SSON探针的方法:在王艳芝（2013）将广泛应用的已知重复序列pSc119.2和pAs1开发成8个56～59 nt SSON基础上,新开发16个小麦和百萨偃麦草SSON探针用于染色体鉴定,其中4个（DP4J24903、DP4J27982、DP4J31304 和 DP4J28086）为百萨偃麦草基因组专化探针,1个（3K-5）为染色体3B专化探针;研究发现,这些SSON探针均可以进行FISH或非变性FISH（ND-FISH）,但均以FISH信号更多、效果更稳定;还发现 SSON 探针（GAA）10,（AAC）10 和 pSc119.2-1 可以分别在 0.01 ng/μl,0.01 ng/μl和0.2 ng/μl浓度和非变性条件下高效涂染小麦和黑麦染色体,据此开发了可以循环利用的寡核苷酸染液,为染色体自动化分析及基于不同荧光信号强度进行染色体分拣提供了有力工具。（2）根据单个SSON的杂交信号特征,组配出4个寡核苷酸探针套,通过一次FISH,用于清晰区分小麦、黑麦和百萨偃麦草全部染色体鉴定,建立了简单、经济和高效的染色体鉴定方法,其中multiplex#1和multiple x#4在杂交信号更丰富,易于根据不同颜色和信号强度准确识别小麦不同基因组和全部染色体;利用multiplex#1和multiplex#4建立了中国春和百萨偃麦草高清核型,并用于分析栽培小麦染色体多样性和中国春-百萨偃麦草异染色体系染色体组成;其中,利用multiplex#1和DP4J27982,准确鉴定了三个染色体代换系和五个易位系,明确了百萨偃麦草与普通小麦染色体部分同源性;利用multiplex#4通过一次FISH分析,可以清晰识别全部小麦染色体及其8个栽培品种（系）的染色体多态性,其中B基因组染色体变异最多,其次为A,最后为D。（3）花生（Arachis hypogaea,2n=4x=40,AABB）我国重要的油料和经济作物。然而由于花生核型清晰度低,花生属野生种基因组识别和分类困难,影响花生染色体工程进展。本研究利用SSR、端粒重复序列和4GbA.duranensis基因组序列,开发出7个花生SSON探针,信号主要分布在染色体末端、臂中和着丝粒区,据此组配出两个寡核苷酸探针套multiplex#5和multiplex#6用于区分花生全部染色体。综合SSON、45S rDNA、5S rDNA、A.duranensis基因组和A.ipaensis基因组探针顺序FISH分析,构建了栽培种花生和野生种高分辨率晰核型,可以识别9个物种的全部染色体,为花生基因组分类和染色体研究提供了新工具。发现花生野生种染色体存在多种变异,如同源染色体rDNA位点杂合、染色体倒位和重复序列扩增等,揭示花生物种演化过程中发生了复杂的染色体重排。（4）由于花生遗传研究相对薄弱,迄今尚未实现遗传图、序列图和实际染色体的完全对应,本文利用A.duranensis A6染色体基因组序列图短臂末端0-8.5 Mb区域的特异基因序列,设计了一个包含20000条42～48 nt SSON的寡核苷酸库6A-1,通过综合利用45S、5S rDNA和SSON DP-5顺序FISH,发现6A-1在细胞学核型中A3染色体上产生预期的清晰的杂交信号,首次将花生A6染色体序列图与花生实际染色体A3进行了对应,为建立花生基因组序列图与全部实际染色体的对应提供了可能。
杨国淋,赵松,黄小波,马锐,张仙,滑翔,赵玉佳,曹三杰,文翼平,伍锐,文心田[4]（2016）在《两种标记方法对cDNA芯片杂交信号的初步分析》文中研究指明为研究两种不同的标记方法对杂交效率的影响,将含NDV的F和HN基因、IBV的M和N基因、ILTV的TK和gB基因的重组质粒作为靶基因,分别采用Cy3直接引物标记法和间接掺入标记法进行PCR扩增。然后将荧光标记的样品与芯片进行杂交,收集扫描后的输出图像和荧光强度信号值,分析两种标记方法对芯片杂交效率的影响。结果显示,Cy3引物标记方法所获得NDV、IBV、ILTV芯片扫描数据结果,图像直观判断均优于间接掺入标记方法。表明Cy3直接引物标记法是一种能够提高杂交的信号值,降低背景信号值,提高杂交效率的方法,有利于检测型基因芯片的应用。
朱晓光[5]（2012）在《麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用》文中研究说明麻疹病毒属在病毒学分类上位于单负链RNA病毒目，副粘病毒科，副粘病毒亚科。根据国际病毒学委员会第8次分类会议的病毒分类目录，犬瘟热病毒、麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒和海豚瘟热病毒等六种病毒属于麻疹病毒属，这六种病毒分别在各自的宿主中引起重要的疾病，造成严重的公共卫生危害、社会影响和经济损失。上述病毒宿主范围广泛，致病性强，病死率高，已经引起了研究人员的重视，RT-PCR，实时定量PCR以及免疫学和血清学检测等多种方法被应用于上述病毒检测，但是这些方法多数是检测一种病毒或区分两种病毒，目前没有一种方法能同时检测麻疹病毒属上述六种重要病毒。本文研究目的是建立麻疹病毒属6种重要病毒的快速、准确、灵敏、高通量的基因芯片检测技术平台，同时完成麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒等麻疹病毒属病毒的种特异性检测，为疫病临床诊断、人畜传染病防控及反恐怖活动等提供有效的诊断手段。在NCBI网站下载上述病毒基因组序列信息，利用生物学软件对6种病毒下载的序列进行比对，获得每种病毒长度在200bp以上的种保守性特异核苷酸序列，以此作为设计oligo探针的备选序列，利用分子生物学软件PrimerPremier5.0设计特异性好、长度均一、Tm值相近的寡核苷酸探针。待检样品经荧光引物扩增后与基因芯片在优化的条件下杂交，激光扫描荧光信号分布和强度，Genepix软件分析结果；麻疹病毒属种特异性检测基因芯片制备后，用参比样品检验本基因芯片的敏感性、特异性、重复性和稳定性。麻疹病毒属种特异性基因芯片检测方法建立后，对来自吉林、辽宁和黑龙江的38例疑似犬瘟热病毒感染的临床病料进行了检测。在建立麻疹病毒属核酸检测基因芯片基础上，利用生物素-链霉亲和素的结合，引入胶体金显色及银染放大系统，建立麻疹病毒属的目视化基因芯片检测系统，使用目视化基因芯片对东北三省的48例临床病料进行了检测，共检测到38例犬瘟热病毒阳性样品，基因芯片方法和PCR方法的检测符合率为94.7%。本实验主要完成了以下四部分工作一、麻疹病毒属病毒种特异性寡核苷酸探针的设计从NCBI网站的Genome数据库下载麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒的基因组序列，从该网站的Oligonucleotide数据库下载上述病毒的核酸序列信息。每种病毒的下载序列分别比对后得到种特异性病毒保守区，在各自保守区内以Primer Premier5.0软件设计种特异性寡核苷酸探针及对应的PCR引物。遵循探针的设计原则，探针长度为25士5mer，TM值为48士5℃，使所有探针具有相近的杂交动力学参数。利用生物信息学技术在线比对，通过与公开发表的所有已知病毒序列进行比较，进行了病毒保守区和寡核苷酸探针的特异性验证，包括病毒属内序列同源性、种间序列的特异性、种内毒株的保守性。经过筛选与验证，从一千余条备选探针中确定了6条麻疹病毒属种特异性鉴定短寡核苷酸探针。二、麻疹病毒属病毒多重PCR扩增方法的建立上述实验确定了各病毒探针，在探针的两端分别设计麻疹病毒属各病毒特异性PCR扩增上下游引物，在上游引物的5′端标记HEX荧光染料，该染料可以被基因芯片扫描仪检测呈现绿色荧光。经优化各病毒引物比例，建立了麻疹病毒属多重PCR扩增方法。以细胞毒、合成模拟毒、质粒和病料为模板，验证了该多重PCR方法的特异性。实验结果显示，所建立的多重反应体系对麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒等均能扩增出与预期设计大小一致的特异条带，而对犬副流感病毒、VERO细胞和健康犬组织等无特异扩增，该结果与特异PCR方法检测结果一致。三、麻疹病毒属病毒种特异性基因芯片检测方法的建立及初步应用探针用MG2-610型点样仪通过机械手臂分别以夹缝针接触式点样方式印迹于醛基玻片上，探针浓度为40pmol/μl，点样温度为25℃，点样湿度为70%，点样后经NaBH4封闭。经优化杂交条件，初步建立了麻疹病毒属种水平鉴定基因芯片。基因芯片检测犬瘟热病毒、麻疹病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒、小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒的细胞毒和质粒结果均为阳性，而检测犬副流感病毒、VERO细胞和健康犬组织的结果为阴性，证明本基因芯片具有良好的麻疹病毒属种检测特异性。将TCID50为10-4的以犬瘟热病毒细胞毒10倍比稀释，分别用基因芯片和PCR方法梯度检测，基因芯片能检测到10-2TCID50的犬瘟热病毒，检测灵敏度是PCR方法100倍。分别使用同一批次和不同批次的多张芯片检测犬瘟热病毒，结果均为阳性，证明本芯片具有良好的重复性。制备的基因芯片放置1年以上仍然具有良好的检测活性。犬瘟热病毒能够感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊猫科、猫科等多种动物，且传染性强、致死率高，对我国家养犬类、宠物、经济动物、野生动物、动物园以及实验动物等危害极大。在基因芯片制备完成后，使用基因芯片对吉林、辽宁和黑龙江等省送检的犬、狐狸和貉子病料进行检测，38例标本中，普通PCR方法和基因芯片方法检测犬瘟热病毒均是阳性结果的为24例，而单独基因芯片方法检测为犬瘟热病毒阳性结果的有2例，两种方法的检测符合率为92.7%。四、麻疹病毒属目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用根据上述实验得到的各病毒种特异性探针，在5’端连接短臂后按照规律的阵列点样在玻璃片上，水合之后形成可以长期保存的芯片。在PCR引物的5’端引入生物素，于胶体金上引入链霉亲和素，利用生物素-链霉亲和素反应使胶体金在点样探针上特异性的结合与聚集，最后利用银染放大信号，形成肉眼可见的结果。该检测平台特异性好，通量高，灵敏度与基因PCR方法相仿，能应用于临床样品，与麻疹病毒属核酸检测基因芯片相互补充，更加适用于基础实验室及临床检测。本实验建立了四步法探针设计方法，建立了麻疹病毒属6种重要病毒探针数据库，制备了能同时检测12份样品、每份样品能同时检测6种病毒的基因芯片。在探针两端设计PCR扩增引物，建立了麻疹病毒属6种重要病毒多重PCR扩增方法，在此基础上，建立了麻疹病毒属种特异性鉴定扫描芯片和目视化芯片技术，并初步应用于犬瘟热病毒临床病料检测，该技术具有良好的灵敏度和特异性，在出现传染病疫情时，结合临床症状及流行病学特征等，可在种水平上快速鉴定上述六种病毒。
季新成[6]（2010）在《牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究》文中进行了进一步梳理牛传染性鼻气管炎（IBR）和牛病毒性腹泻（BVD）是危害养牛业的两种重要病毒性传染病,给养牛业造成巨大的经济损失,我国进出境牛及其产品大多有对这两种疫病检疫的要求。牛精液中可携带这两种病毒,其在人工受精技术中的广泛应用是将该病传播给未感染牛群及地区的重要途径之一。目前对牛精液中这两种病的检测大多采用病毒分离的方法,因精液自身的细胞毒性及抗病毒活性,致使检测灵敏度极大的降低。虽然PCR方法已应用于这两种病毒的检测,但因精液中抑制PCR扩增成分的存在,致使检测灵敏度降低或操作复杂,抑制成分的存在也常造成假阴性结果的发生。结合进出境检验检疫工作,本研究完成了以下内容:1.采用Institue pourquier公司的IBRV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区684份牛血清IBRV抗体检测,检出阳性血清370份,最高阳性率达97.6%,最低为5.0%,平均为54.1%。在近3年具有流产史记录的四个牛群中,有3个牛场牛IBRV抗体阳性率高达100.0%,1个牛场为12.5%,平均为90.5%。结果显示该病已在新疆普遍存在,感染没有明确的地域分布。2.根据牛疱疹病毒1型（BHV1）gB基因序列,设计引物和荧光探针,通过搭桥法PCR扩增,构建了BHV1内标法荧光定量PCR共扩增模板,进一步构建了共扩增荧光PCR检测体系,该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子。经对牛精液中抑制荧光PCR扩增成分进行分析和去除方法的研究,将该方法直接用于牛精液中IBRV的检测,可检测到牛精液中0.02 TCID50病毒,检测时间在2.5h之内。检测灵敏度比不含内标的荧光PCR检测方法低10倍,比病毒分离方法高500倍,比普通PCR方法高50倍,比OIE已报道的方法灵敏度高40倍。通过对120份新鲜牛精液、40份冷冻牛精液和39份牛鼻腔拭子检测,得到阳性样品27份。含有共扩增内标模板的检测体系可对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。通过对定期采集的10头牛血清样品IBRV抗体检测,发现精液阳性牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性牛精液中也不一定带毒,本试验结果初步表明不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒也只是间歇性的。3.采用Idexx公司BVDV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区875份牛血清BVDV抗体检测,共检出抗体阳性血清759份,最高阳性率为100.0%,最低为55.0%,平均为86.7%,从已有的数据来看,近3年有过流产史的牛血清BVDV抗体阳性率普遍偏高。感染牛没有明显的年龄差别。结果显示该病已在新疆普遍存在,且有不断增强的趋势。与病毒中和试验相比较,ELISA操作简便,并具有较好的敏感性和特异性,两者符合率为80.0%。4.采用Idexx公司BVDV抗原检测试剂盒从160份牛血清中检测出6份阳性血清,对这6分血清和随机选择的20份肛门拭子进行了病毒分离,成功分离出8株BVDV,8株分离毒株TCID50为4.38×103～5.82×106。对BVDV阳性血清的中和效价为1:23～1:26。8株分离株之间的同源性为87.5%～99.7%;与NADL株核苷酸序列同源性为82.0%～94.8%;与KE9株核苷酸序列同源性为81.0%～82.0%;分离株之间具有较高的同源性,表明该8株病毒与NADL株为同一基因型。5.建立了牛精液中BVDV荧光RT-PCR检测方法,该方法可检测到新鲜牛精液和冷冻牛精液中0.0125TCID50的病毒。灵敏度比常规RT-PCR高100倍,比病毒分离法高200～2000倍,研究发现,新鲜精液本身对RT-PCR扩增具有一定的抑制性,精液冻存液中的卵黄是抑制RT-PCR扩增的主要成分。用该方法对120份新鲜精液40份冻存精液进行检测,没有检测到阳性样品。对定期采集的10头牛血清BVDV抗体进行了检测,结果表明不能以血清抗体结果作为精液是否带毒的判定标准,血清抗体效价至少持续半年以上。6.根据IBRV gB基因、BVDV5’UTR区和犬新孢子虫Nc-5基因,通过PCR扩增各目的基因的特异性片段,成功构建了各特异性基因的重组质粒,在此基础上,建立了上述3种病原的多重PCR检测方法。将标有荧光染料的PCR产物变性后与芯片上寡核苷酸探针杂交,经系列反应条件的优化,建立了IBRV、BVDV和N. caninum 3种病原的基因芯片检测方法,本研究对三种病原重组DNA的检测灵敏度均为103拷贝/反应。对牛精液中IBRV和BVDV两种病毒的检测灵敏度约为0.1TCID50,且具有较好的特异性和可重复性。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。7.建立了IBRV、BVDV和N. caninum xMAP悬浮液态芯片检测技术。对基因组DNA分别进行xMAP悬浮芯片单重和多重目标物的检测试验,建立的方法具有较好的特异性和可重复性。对BVDV重组质粒可检测到102拷贝/反应,对NCP和IBRV的检测灵敏度为103拷贝/反应。比PCR灵敏度高10100倍。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。根据检测项目的不同,对临床样品分别采用了病毒分离、普通PCR、荧光PCR、基因芯片和悬浮芯片等方法进行了检测,结果表明,荧光PCR具有较高的灵敏度,悬浮芯片和基因芯片灵敏度次之。目前虽然有采用荧光PCR法、基因芯片法和悬浮芯片法等技术对动物疫病检测的研究,但尚未见将这些技术作为一个整体进行研究的报道,也没有以共扩增内标模板对检测结果进行质量控制的研究。本研究搭建了DNA病毒、RNA病毒和寄生虫病芯片检测技术平台,为今后更多动物疫病检测技术的研究开展奠定了基础。并同步完成了精液带毒与血清抗体关系进行了分析。结果的取得为出入境检验检疫条款的制定和检测方法的选择提供了依据,为进出境动物检验检疫提供了必要的技术储备。
李泽松[7]（2008）在《缺失型α-地中海贫血基因诊断芯片及在分子流行病学研究中的应用》文中认为α-地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病,也是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病。本病是由于第16号染色体短臂末端α-珠蛋白基因缺陷所致,有缺失型和非缺失型两种,缺失型是主要类型。在广东人中,超过96%的α-地中海贫血是由东南亚缺失（--SEA）、左侧缺失（-α4.2）和右侧缺失（-α3.7）引起。本病尚无有效治疗方法,携带者筛查及产前基因诊断是唯一防止新的患儿出生、提高人口素质的有效措施。实施该措施的前提是对人群中α-地中海贫血的流行病学的了解和相应的诊断技术的建立。目前,多种分子诊断技术已用于α-地中海贫血的诊断检测。其中多重Gap-PCR已广泛用于α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断,但其在检测陈旧DNA时尚有一定局限性。基因芯片技术已用于多种遗传性疾病的诊断和研究。该技术可为α-地中海贫血的分子诊断提供进一步发展完善的可能。因此,本课题将研制一种可用于临床的、具有稳定性好、重复性高的快速检测中国人中常见的三种缺失型α-地中海贫血的基因芯片。在参照国内外文献的基础上,我们首先设计了特异性的PCR引物,建立并优化了PCR反应体系和条件。我们也设计了一系列长短不同的特异性的探针。在对醛基片的质量、探针的合成、点样液成分、探针浓度、杂交和洗涤等条件进行了研究比较后,我们获得了最适合的制备工艺和条件,并制备了含有70个寡核苷酸的探针的芯片。通过对临床标本的检测,设定了检测信号的判定标准:仅信噪比大于10,并且信号强度大于1000的探针才被认为是阳性的;如果-α3.7探针检测为阳性,那么α2的信号值必须大于-α3.7的一半时才能被判定为阳性。在上世纪八十年代使用血液学方法对全国范围的地中海贫血的流行病学研究结果对地中海贫血的预防起了巨大的作用。但是伴随我国经济高速发展的大规模的人口移动以及几十年来对地中海贫血的有效防治,我国人群中地中海贫血的流行病学可能发生变化。同时,血液学研究的结果与实际情况可能有偏差,需要从基因水平进一步验证和核实。因此,新一轮的基于分子分析的全国范围的地中海贫血流行病学的调查研究势在必行。这将是一个浩大的工程。一个小规模具有代表性的人群中地中海贫血流行病学的调查研究,将具有积极意义。深圳作为一座移民城市,其人口来源于全国各地,深圳市人群中地中海贫血的流行病学对于全中国人群有一定的代表性。因此,我们也进行了深圳市人群中地中海贫血流行病学的研究。使用自制的芯片我们对广东省深圳市人群地中海贫血的分子流行病学进行了调查。在检测过程中,我们检测到了一例特殊的病例,病人--SEA、?α3.7和α2均为阳性。血液血表型表现为典型的α-地中海贫血特点。通过分子分析鉴定其为HKαα和--SEA的复合杂合子。病人母亲基因型也为HKαα/--SEA,其父亲基因型为αα/--SEA。据我们所知,这是首次报道HKαα和--SEA的复合杂合子。由于HKαα/--SEA有典型的α-地中海贫血特点,与αα/--SEA的临床表型一致,因此在HKαα和αα之间并无明显的血液学和临床差异。这也反映了HKαα与αα基因序列的一致性。通过对到深圳几家大的医院就诊和寻求产前咨询的3713个人进行了表型筛查和基因分析,我们获得了深圳市人群中地中海贫血的流行病学和突变谱带。深圳人口地中海贫血基因携带率为6.49%,其中α-地中海贫血为4.34%,β-地中海贫血为1.99%;α-地中海贫血和β-地中海贫血双重杂合子0.16%。较广东省其他地区的低。这可能与深圳市人口多为外来移民有关。我们共检测到3种缺失型α-地中海贫血突变、1种非缺失型α-地中海贫血点突变和9种β-地中海贫血。与广东省其他地区相比,深圳人口中地中海贫血基因的突变谱带并无明显差异。综上所述,我们通过设计特异性的探针,与使用单管多重PCR扩增产物直接杂交,从而建立了一种新的检测缺失型α-地中海贫血的方法。该方法不仅方便快速,而且灵敏度高、特异性好,有利于在临床中推广应用。通过对深圳市人口地中海贫血流行病学的研究显示,该方法可应用于大规模人口地中海贫血流行病学调查,为地中海贫血的预防、诊断和基因治疗提供科学的理论根据。
张媛[8]（2008）在《肉（鱼）源性寄生虫检测方法的研究》文中认为内容摘要:食品安全是事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题,但食品中寄生虫（卵）污染所引起的食源性疾病流行,一直未得到足够的重视。面对日益严重的肉类及水产品中寄生虫的食品安全问题,大力研究和发展新型、快速、灵敏、集成、高通量的检测技术,己成为一个重要方向。而现有的检测方法还仅仅局限于病原学检查和寄生虫免疫学诊断技术,只能在患者发病后才能做到,此时只能治疗而不能预防。因此,建立食品中主要寄生虫的快速检测方法是很有必要的。本论文应用普通PCR、变性高效液相色谱和实时荧光PCR分别对鱼源性寄生虫中最常见的华支睾吸虫进行检测,采用基因芯片技术对三种肉源性寄生虫（绦虫、弓形虫和旋毛虫）进行检测。其中在对鱼源性寄生虫的检测中,利用寄生虫核糖体非转录区的ITS2区域高度可变的性质,设计特异性普通PCR引物;使用primer express 3.0软件在可变区设计合成华支睾吸虫实时荧光PCR的特异性引物和探针,经过引物特异性实验证明,自行设计的普通PCR引物及实时PCR检测用引物和探针特异性强;建立的实时荧光PCR及变性高效液相色谱检测华支睾吸虫法的灵敏性都达到了1.37×10-5ng/μL。本文还利用基因芯片方法建立食品中绦虫、弓形虫和旋毛虫三种肉源性寄生虫的快速检测技术,选用弓形虫B1基因、旋毛虫SB2基因、绦虫12SrDNA上的可变区设计引物及探针,点样于玻片制成基因芯片;寄生虫DNA经过引物扩增后与芯片上的探针杂交,然后通过扫描图象对结果的特异性、灵敏性等进行判断,此外还进行了模拟污染实验。结果表明:设计的引物能够扩增三种寄生虫,而且探针的特异性很高。本体系的基因芯片杂交检测灵敏度约为1.5×10-5ng/μL。以食品中弓形虫和旋毛虫为例,每200mg模拟污染样品中可以检测出10个弓形虫速殖子;每200mg模拟污染样品中可检测出1条旋毛虫。
易萍[9]（2006）在《母体血浆中胎儿DNA点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:近年来研究发现在妊娠过程中母体血浆中存在游离胎儿DNA,这一发现为基于母体外周血的无创性产前诊断开辟了新的领域。胎儿DNA一半来自于母亲,另一半来自于父亲,目前已报道利用母体血浆DNA来检测胎儿父系来源的致病基因,可应用于父亲为常染色体显性遗传病患者的胎儿无创性产前诊断,而且将这种检测方法应用于父亲为常染色体隐性遗传病携带者的产前诊断,也可使50%的胎儿避免了传统的绒毛吸取或羊膜腔穿刺检查。但由于母体血浆总DNA量少,且在血浆总DNA中胎儿DNA所占的比例甚微,母体等位DNA片段可干扰胎儿DNA的检测,因此对这种低丰度胎儿DNA检测必须采用高灵敏度和高特异性的分析系统。点突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的检测是目前DNA分子诊断中的主要研究内容,对母体血浆中的这些单核苷酸差异的检测在技术上要求更高,目前所用的检测方法仍不够理想。DNA连接酶对单个核苷酸差异具有很强的鉴别能力,其核心在于它可以把与模板完全配对的两相邻寡核苷酸片段连接起来,如果连接处出现一个碱基错配,连接反应就不能进行。以该酶为基础的技术如空隙-连接酶链反应（gap ligase chain reaction,Gap-LCR）和连接酶检测反应（ligase detection reaction,LDR）在低丰度基因单核苷酸差异检测方面具有很强的应用潜力。因此本研究拟以β地中海贫血的常见突变和雌激素受体α的SNP位点（c.454-397T>C）作为研究对象,在Gap-LCR或LDR技术的基础上,结合荧光定量PCR、毛细管电泳和纳米金新型通用型芯片来检测低丰度基因的单核苷酸差异,探索检测母体血浆中胎儿父系来源DNA点突变的新方法,为胎儿遗传性疾病的无创性产前诊断寻求新的有效途径。主要方法与结果如下:第一部分:母体血浆DNA实验模型的建立1.用反向斑点杂交技术检测β地中海贫血IVS-Ⅱ-654（C→T）、CD17（A→T）、CD26（G→A）、CD41-42（-CTTT）和CD71-72（+A）突变的外周血标本,然后进行DNA序列分析,结果发现反向斑点杂交技术在突变位点周围存在SNP时可造成误诊。2.利用pVUⅡ限制酶酶切方法鉴定雌激素受体α基因SNP（c.454-397T>C）分型,
高爽[10]（2006）在《运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究》文中研究指明致病菌污染食品可导致多种疾病的暴发与流行，严重威胁人类的健康。因此，若想有效控制食品细菌性疾病的发生，快速而准确地检测食品中致病菌是关键的技术基础之一。传统的细菌培养方法及生化鉴定，操作繁琐，且需要数天才能得到结果。免疫学方法和探针杂交技术也存在特异性或敏感性的问题。常规PCR一次只能检出一种致病菌，对食品中分离的未知菌，或有多种细菌污染的样品则显得无从下手。为了实现对食品中致病菌的快速检测与鉴定，预防肠道细菌性疾病的发生，我们运用寡核苷酸芯片技术建立了对常见食源性致病菌进行检测的方法，检测的目的菌株是霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌0157：H7、副溶血性弧菌、耶尔森氏菌、单增李氏菌、富氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌。我们利用在细菌分类学上具有重要意义的16SrRNA和23S rRNA基因作为检测的靶分子，并在其间设计探针，建立一套食品致病菌的基因芯片快速检测技术。不同细菌的16SrRNA和23SrRNA基因具有序列一致的恒定区和序列不同的可变区，恒定区和可变区交错排列。这样，我们在恒定区设计PCR引物，在可变区设计检测探针；用四对引物在同一反应条件下就可以将全部九种致病菌的相应基因片段扩增出来，再用每种细菌的特异性探针阵列与标记的靶片段进行杂交反应，杂交后用专用设备读取分析荧光信号，可以定性和半定量地检出致病菌。通过杂交结果可以看出设计的探针特异性强，并且相对于传统的方法操作简单、用时少，稳定性、重复性都非常好，灵敏度可达到1.6×103cfu／mL，另外，我们还对单独DNA模极下多重PCR扩增反应条件进行了摸索。上述实验结果表明运用寡核苷酸芯片技术所建立的检测方法准确、可靠、实用性强，是检测食品中常见致病菌技术的一次飞跃，并且可一次实验操作同时检测多种食源性致病菌。本文所建立的检测方法为今后在食源性致病菌检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定了可靠的理论与技术基础。
二、三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响（论文提纲范文）
（1）可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 六种禽类疫病及其病原学特征 |
| 1.1.1 禽白血病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.2 禽白血病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.3 马立克病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.4 马立克病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.5 传染性法氏囊病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.6 鸡传染性法氏囊病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.7 新城疫概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.8 新城疫的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.9 禽流感概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.10 禽流感的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.11 传染性喉气管炎概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.12 传染性喉气管炎的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.2 禽类病毒病诊断方法 |
| 1.3 基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展 |
| 1.3.1 基因芯片检测技术的概述 |
| 1.3.2 基因芯片技术在禽类病原检测方面的应用 |
| 1.3.3 可视化基因芯片技术的起源及分类 |
| 1.3.4 可视化基因芯片技术在目前疾病诊断中的应用及展望 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 ALV-ENV、MDV-MEQ、IBDV-VP2靶基因的扩增及鉴定 |
| 2.2.3 靶基因的复苏及鉴定 |
| 2.2.4 寡核苷酸探针设计 |
| 2.2.5 可视化基因芯片的制备 |
| 2.2.6 可视化基因芯片的检测步骤 |
| 2.2.7 可视化基因芯片的条件优化 |
| 2.2.8 可视化基因芯片的质量评价 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 2.3.2 基因芯片制备的初检 |
| 2.3.3 可视化基因芯片的条件优化结果 |
| 2.3.4 可视化基因芯片的质量评价结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA、N2-NA基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测 |
| 3.2.3 寡核苷酸探针设计与芯片制备 |
| 3.2.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的检测 |
| 3.2.5 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的质量评价 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 3.3.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测结果 |
| 3.3.3 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片制备的初检 |
| 3.3.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片的质量评价结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 六种禽病毒病及禽流感分型的可视化共检基因芯片检测技术的临床应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 临床样本核酸的提取及PCR扩增标记 |
| 4.2.2 阳性质粒的提取 |
| 4.2.3 可视化基因芯片的制备 |
| 4.2.4 PCR/RT-PCR和可视化基因芯片检测临床样本的比较 |
| 4.2.5 RT-PCR和可视化基因芯片检测禽流感病毒亚型的比较 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR/RT-PCR检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.2 可视化基因芯片检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.3 两种检测六种禽病毒病方法的符合率 |
| 4.3.4 RT-PCR检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.5 可视化芯片检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.6 两种检测禽流感六种亚型方法的符合率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附录 |
（2）同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1.猪病毒性腹泻病毒的研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.3 猪轮状病毒A型概述 |
| 1.4 猪delta冠状病毒概述 |
| 1.5 猪病毒性腹泻传统诊断方法 |
| 2.基因芯片技术及其在病原诊断上的应用 |
| 本研究的目的与意义 |
| 1.材料 |
| 1.1 阳性病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 临床样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 目的基因重组质粒的构建 |
| 2.2 寡核苷酸探针设计和合成 |
| 2.3 芯片的制备 |
| 2.4 不对称PCR引物浓度的优化 |
| 2.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片检测步骤 |
| 2.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的条件优化 |
| 2.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的评价及应用 |
| 3.结果 |
| 3.1 靶基因阳性质粒提取结果 |
| 3.2 不对称PCR扩增体系的条件优化结果 |
| 3.3 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片探针浓度的选择 |
| 3.4 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交时间选择 |
| 3.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交温度选择 |
| 3.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片酶浓度的选择 |
| 3.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片显色时间的选择 |
| 3.8 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的特异性检测结果 |
| 3.9 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的敏感性检测结果 |
| 3.10 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的保存期检测结果 |
| 3.11 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的临床样品检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 靶基因的选择 |
| 4.2 寡核苷酸探针的设计 |
| 4.3 不对称PCR扩增技术的讨论 |
| 4.4 可视化芯片条件优化的讨论 |
| 4.5 关于可视化芯片质量评估结果的讨论 |
| 4.6 关于可视化芯片临床应用评价的讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 ：探针基因序列 |
| 附录二 ：试验试剂的配置 |
| 附录三 ：部分临床样品可视化基因检测结果 |
| 作者简历 |
（3）小麦、百萨偃麦草和花生染色体荧光原位杂交寡核苷酸探针（套）开发与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 染色体分带 |
| 2 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH) |
| 3 单拷贝基因(序列)FISH |
| 3.1 gDNA FISH |
| 3.2 cDNA FISH |
| 4 寡核苷酸FISH |
| 4.1 寡核苷酸探针类型与开发方法 |
| 4.2 寡核苷酸探针标记物和标记方法 |
| 4.3 非变性FISH(ND-FISH) |
| 4.4 影响寡核苷酸FISH因素 |
| 4.5 寡核苷酸FISH的应用 |
| 5. 本研究目的与意义 |
| 第二章 小麦和百萨偃麦草寡核苷酸探针(套)开发和应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同长度寡核苷酸探针FISH和ND-FISH分析 |
| 2.2 利用Afa family重复序列开发小麦新探针 |
| 2.3 小麦3B染色体特异重复序列寡核苷酸探针开发 |
| 2.4 百萨偃麦草基因组特异寡核苷酸探针开发 |
| 2.5 小麦和百萨偃麦草寡核苷酸探针套开发 |
| 2.6 栽培小麦品种染色体多样性分析 |
| 2.7 普通小麦-百萨偃麦草异染色体系分析 |
| 2.8 寡核苷酸探针染液染色体涂染技术 |
| 3 讨论 |
| 3.1 寡核苷酸FISH的优势与局限性 |
| 3.2 百萨偃麦草基因组和小麦染色体3B特异寡核苷酸探针开发 |
| 3.3 小麦和百萨偃麦草寡核苷酸探针套的开发和应用潜力 |
| 第三章 花生寡核苷酸探针(套)开发及应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 花生寡核苷酸探针开发及定位 |
| 2.2 花生野生种染色体多样性分析 |
| 2.3 花生染色体结构变异分析 |
| 2.4 A.duranensis染色体序列图与核型对应 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利用A.duranensis基因组测序开发花生寡核苷酸探针 |
| 3.2 花生染色体识别 |
| 3.3 花生染色体结构变异 |
| 3.4 不同花生种染色体组关系 |
| 3.5 花生序列图与染色体核型对应 |
| 第四章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 短寡核苷酸探针的设计和生物信息学验证 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 麻疹病毒属多重PCR 扩增方法的建立 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 麻疹病毒属种特异性基因检测芯片的建立及其初步应用 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 麻疹病毒属目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用 |
| 一 材料 |
| 二 方法 |
| 三 结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 期间撰写的论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 牛传染性鼻气管炎及其检测技术研究进展 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎的病原学 |
| 1.1.1 牛传染性鼻气管炎概况 |
| 1.1.2 牛传染性鼻气管炎的流行历史和分类地位 |
| 1.1.3 病毒粒子结构、形态及理化特性 |
| 1.1.4 培养特性和致病性 |
| 1.1.5 IBRV 的基因组结构 |
| 1.1.6 IBRV 基因组编码的主要蛋白 |
| 1.2 牛传染性鼻气管炎的流行病学 |
| 1.2.1 流行历史和分布 |
| 1.2.2 易感动物和传播途径 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.2.5 血清型 |
| 1.2.6 免疫 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎病的防控 |
| 1.3.1 弱毒苗 |
| 1.3.2 灭活苗 |
| 1.3.3 新型疫苗 |
| 1.4 牛传染性鼻气管炎检测技术研究进展 |
| 1.4.1 血清学检测 |
| 1.4.2 IBRV 亚型鉴别 |
| 1.4.3 病原鉴定 |
| 第二章 牛病毒性腹泻及其检测技术研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病原学 |
| 2.1.1 牛病毒性腹泻概况 |
| 2.1.2 牛病毒性腹泻病毒的分类地位 |
| 2.1.3 牛病毒性腹泻病毒粒子形态结构及理化特性 |
| 2.1.4 牛病毒性腹泻病毒的培养特性 |
| 2.1.5 牛病毒性腹泻病毒的基因组结构 |
| 2.1.6 病毒蛋白及功能 |
| 2.2 牛病毒性腹泻流行病学 |
| 2.2.1 流行历史、分布 |
| 2.2.2 传染源 |
| 2.2.3 传播媒介 |
| 2.2.4 易感动物和流行特征 |
| 2.2.5 分子流行病学特征 |
| 2.2.6 临床症状和致病机理 |
| 2.3 牛病毒性腹泻的预防与控制 |
| 2.3.1 常规疫苗 |
| 2.3.2 新型疫苗 |
| 2.4 牛病毒性腹泻检测技术研究进展 |
| 2.4.1 血清学试验 |
| 2.4.2 病原鉴定（国际贸易指定试验） |
| 第三章 生物芯片技术及其研究进展 |
| 3.1 固相芯片 |
| 3.1.1 基本概念及原理 |
| 3.1.2 固态生物芯片制备步骤 |
| 3.1.3 固态芯片的应用 |
| 3.1.4 存在的问题及展望 |
| 3.2 悬浮芯片 |
| 3.2.1 悬浮芯片技术基本原理 |
| 3.2.2 悬浮芯片技术的应用现状 |
| 3.2.3 液相芯片技术的优点及存在的不足 |
| 3.2.4 前景和展望 |
| 试验研究 |
| 第四章 新疆地区牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器及耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 酶联免疫吸附试验检测 |
| 4.2.2 病毒中和试验（VN） |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同地区IBRV 血清抗体检测结果 |
| 4.3.2 两种试剂盒检测比较 |
| 4.3.3 病毒TCID50 的测定 |
| 4.3.4 ELISA 法与病毒中和试验比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 引物和探针的设计合成 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 DNA 提取 |
| 5.2.2 目标模板的制备 |
| 5.2.3 内标模板的制备 |
| 5.2.4 不含内标的荧光PCR 反应条件建立 |
| 5.2.5 内标共扩增荧光定量PCR 反应体系建立 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目标模板的制备 |
| 5.3.2 内标模板的构建 |
| 5.3.3 单重荧光PCR 反应条件建立 |
| 5.3.4 共扩增检测低限的测定 |
| 5.3.5 标准曲线的建立 |
| 5.3.6 方法的特异性、重复性检测 |
| 5.3.7 方法的灵敏度比较 |
| 5.3.8 方法的应用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 PCR 法是检测牛精液中IBRV 的良好方法 |
| 5.4.2 牛精液中抑制PCR 扩增成分的研究与去除 |
| 5.4.3 内标在荧光PCR 检测中的作用 |
| 5.4.4 本研究内标荧光PCR 体系的构建 |
| 5.4.5 内标限量的确定 |
| 5.4.6 关于精液带毒与血清抗体关系的分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 新疆地区牛病毒性腹泻病毒血清抗体检测 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 主要仪器及耗材 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 酶联免疫吸附试验检测 |
| 6.2.2 中和试验（VN）对血清抗体效价的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 ELISA 法对不同地区BVDV 抗体检测结果 |
| 6.3.2 病毒TCID50 的测定 |
| 6.3.3 ELISA 法与病毒中和试验比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定与同源性分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 引物的设计与合成 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 酶联免疫吸附试验对血清抗原的检测 |
| 7.2.2 病毒分离鉴定 |
| 7.2.3 分离毒株RT-PCR 检测鉴定 |
| 7.2.4 分离毒株测序及序列分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 病毒分离 |
| 7.3.2 分离株TCID50 的测定 |
| 7.3.3 分离毒株病毒中和试验结果 |
| 7.3.4 分离毒株RT-PCR 检测结果 |
| 7.3.5 重组质粒的鉴定 |
| 7.3.6 测序鉴定及同源性分析 |
| 7.3.7 核苷酸序列同源性比较 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 牛病毒性腹泻病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立与应用 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 病毒、样品和菌种 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.1.4 引物、探针的设计与合成 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 RNA 提取 |
| 8.2.2 荧光RT-PCR 扩增条件的优化 |
| 8.2.3 方法的特异性、重复性检测 |
| 8.2.4 方法的灵敏度检测 |
| 8.2.5 方法的应用 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 荧光RT-PCR 反应条件的优化 |
| 8.3.2 方法的特异性和重复性 |
| 8.3.3 方法的检测灵敏度比较 |
| 8.3.4 方法的应用 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 第九章 IBRV、BVDV 和 N.caninum 基因芯片检测方法的建立与应用 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 病毒、样品 |
| 9.1.2 主要试剂 |
| 9.1.3 主要仪器设备 |
| 9.2 方法 |
| 9.2.1 模板的制备 |
| 9.2.2 引物、探针的设计与合成 |
| 9.2.3 目的基因片段PCR 的扩增 |
| 9.2.4 目的基因克隆与阳性质粒构建 |
| 9.2.5 芯片的制备 |
| 9.2.6 芯片杂交及结果判读 |
| 9.2.7 杂交条件的优化 |
| 9.2.8 芯片特异性检测 |
| 9.2.9 芯片敏感性检测 |
| 9.2.10 芯片重复性试验 |
| 9.2.11 方法的应用 |
| 9.3 结果 |
| 9.3.1 目的基因PCR 扩增结果 |
| 9.3.2 目的基因阳性质粒的制备与鉴定 |
| 9.3.3 芯片制备结果 |
| 9.3.4 寡核苷酸探针杂交结果 |
| 9.3.5 反应条件优化 |
| 9.3.6 特异性试验 |
| 9.3.7 芯片检测的敏感性 |
| 9.3.8 重复性试验 |
| 9.3.9 方法的应用 |
| 9.4 讨论 |
| 9.4.1 基因芯片技术是一种高通量鉴定手段 |
| 9.4.2 特异性是基因芯片的关键 |
| 9.4.3 基因芯片制备中样品荧光标记方法 |
| 9.4.4 影响芯片杂交信号的因素 |
| 9.5 小结 |
| 第十章 IBRV、BVDV 和 N. caninum 悬浮芯片检测方法的建立与应用 |
| 10.1 材料与方法 |
| 10.1.1 病毒、样品 |
| 10.1.2 主要试剂 |
| 10.1.3 xMAP 液态芯片检测中用的主要缓冲液及其配置 |
| 10.1.4 主要仪器设备 |
| 10.2 方法 |
| 10.2.1 模板的制备 |
| 10.2.2 引物、探针的设计与合成 |
| 10.2.3 目的基因片段PCR 的扩增及重组质粒的构建 |
| 10.2.4 探针与微球的耦联 |
| 10.2.5 探针交联效率的验证 |
| 10.2.6 杂交并检测 |
| 10.2.7 悬浮芯片杂交条件的优化 |
| 10.2.8 特异性试验 |
| 10.2.9 敏感性试验 |
| 10.2.10 重复性试验 |
| 10.2.11 方法的应用 |
| 10.3 结果 |
| 10.3.1 目的基因的单重和多重PCR 扩增及重组质粒的获得 |
| 10.3.2 色标微球上交联探针的确证 |
| 10.3.3 悬浮芯片杂交条件的优化结果 |
| 10.3.4 xMAP 悬浮芯片对3 种病原单重PCR 扩增和多重PCR 扩增检测 |
| 10.3.5 特异性试验 |
| 10.3.6 敏感性试验 |
| 10.3.7 重复性试验 |
| 10.3.8 方法的应用 |
| 10.3.9 悬浮芯片技术的应用 |
| 10.4 讨论 |
| 10.4.1 引物和探针的设计是基因芯片的关键 |
| 10.4.2 芯片制备的质量控制是悬浮芯片技术的主要保证 |
| 10.4.3 杂交条件的优化 |
| 10.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点和今后的研究思路 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）缺失型α-地中海贫血基因诊断芯片及在分子流行病学研究中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.1.1 问题的提出 |
| 1.1.2 研究的意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 地中海贫血定义、起源和分类 |
| 1.2.2 地中海贫血的分子基础 |
| 1.2.3 地中海贫血的治疗 |
| 1.2.4 地中海贫血的诊断 |
| 1.2.5 地中海贫血的流行病学 |
| 1.2.6 基因芯片技术及其在地中海贫血诊断中的应用 |
| 1.3 本文研究的目的和研究内容 |
| 1.3.1 本文的研究目的 |
| 1.3.2 本文研究的主要内容 2 缺失型α-地中海贫血基因芯片的研制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 基因组DNA 的提取 |
| 2.2.3 DNA 的定量与稀释 |
| 2.2.4 引物的设计与合成 |
| 2.2.5 多重PCR 反应体系的优化 |
| 2.2.6 特异性寡核苷酸探针的设计与合成 |
| 2.2.7 玻片醛基化处理和选择 |
| 2.2.8 芯片的制备及后处理 |
| 2.2.9 芯片的杂交及洗涤 |
| 2.2.10 芯片的扫描和分析 |
| 2.2.11 芯片性能指标评价 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 标准品的选择与制备 |
| 2.3.2 PCR 引物的设计 |
| 2.3.3 PCR 反应体系的优化 |
| 2.3.4 醛基片的选择 |
| 2.3.5 探针浓度的确定 |
| 2.3.6 点样液的选择 |
| 2.3.7 寡核苷酸探针的选择 |
| 2.3.8 杂交检测体系的优化 |
| 2.3.9 基因芯片检测的特异性 |
| 2.3.10 芯片检测判定标准的确定 |
| 2.3.11 芯片检测的限度 |
| 2.3.12 芯片检测的重复性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 缺失型α-地中海贫血的基因诊断 |
| 2.4.2 芯片检测缺失型α-地中海贫血 |
| 2.4.3 质控参比品的选择 |
| 2.4.4 多重PCR体系的建立 |
| 2.4.5 芯片的制备 |
| 2.4.6 检测标准的建立和检测结果的判定 |
| 2.5 本章小结 3 第一例东南亚缺失与HKαα复合杂合子鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 血液学检测 |
| 3.2.3 血红蛋白电泳 |
| 3.2.4 DNA 的提取 |
| 3.2.5 基因诊断 |
| 3.2.6 非缺失点突变的检测 |
| 3.2.7 β-地中海贫血的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血液学分析 |
| 3.3.2 分子分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于HKαα |
| 3.4.2 关于HKαα和--SEA 的复合杂合子 |
| 3.4.3 在临床中的意义 |
| 3.5 本章小结 4 深圳市人群地中海贫血的分子流行病学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 血液学检测 |
| 4.2.3 血红蛋白电泳 |
| 4.2.4 DNA 的提取 |
| 4.2.5 缺失型α-地中海贫血的基因诊断 |
| 4.2.6 非缺失点突变的检测 |
| 4.2.7 β-地中海贫血的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 地中海贫血的流行病率 |
| 4.3.2 α-地中海贫血 |
| 4.3.3 β-地中海贫血 |
| 4.3.4 α-和β-地中海贫血双重杂合子 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 地中海贫血流行病学 |
| 4.4.2 深圳市地中海贫血流行病学 |
| 4.4.3 深圳与广东省其他地区地中海贫血流行病学比较 |
| 4.5 本章小结 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 后续研究工作的展望 致谢 参考文献 附录 |
（8）肉（鱼）源性寄生虫检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 文献综述 |
| 1.1 常见肉(鱼)源性寄生虫及危害 |
| 1.1.1 常见肉(鱼)源性寄生虫的种类 |
| 1.1.2 常见肉(鱼)源性寄生虫的危害 |
| 1.2 肉（鱼）源性寄生虫检测技术研究进展 |
| 1.2.1 实时荧光PCR 技术 |
| 1.2.1.1 实时荧光 PCR 的原理 |
| 1.2.1.2 实时荧光 PCR 的分类 |
| 1.2.1.3 实时荧光PCR 技术在寄生虫检测中的应用 |
| 1.2.2 变性高效液相色谱技术 |
| 1.2.2.1 变性高效液相色谱的原理 |
| 1.2.2.2 变性高效液相色谱的三种操作模式 |
| 1.2.2.3 变性高效液相色谱技术的应用 |
| 1.2.3 基因芯片技术 |
| 1.2.3.1 基因芯片技术的原理 |
| 1.2.3.2 基因芯片技术的分类 |
| 1.2.3.3 基因芯片技术在寄生虫检测中的应用 第二章 肉（鱼）源性寄生虫 DNA 的提取 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 供试虫株 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 改进的酚-氯仿法 |
| 2.1.2.2 供试虫株DNA 的提取 |
| 2.1.2.3 模拟污染样品DNA 的提取 |
| 2.1.2.4 基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.1.2.5 基因组DNA 的纯度测定 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果 |
| 2.2.2 DNA 纯度的分光光度计检测结果 |
| 2.3 小结 第三章 鱼源性寄生虫的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 供试虫株 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 普通PCR 检测华支睾吸虫 |
| 3.1.2.2 PCR-DHPLC 检测华支睾吸虫 |
| 3.1.2.3 实时荧光PCR 检测华支睾吸虫 |
| 3.1.2.4 特异性实验 |
| 3.1.2.5 灵敏性实验 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 普通PCR 特异性实验结果 |
| 3.2.2 PCR-DHPLC 特异性实验结果 |
| 3.2.3 实时荧光PCR 特异性实验结果 |
| 3.2.4 普通PCR 灵敏性实验结果 |
| 3.2.5 PCR-DHPLC 灵敏性实验结果 |
| 3.2.6 实时荧光 PCR 灵敏性实验结果 |
| 3.2.7 三种方法检测华支睾吸虫的比较结果 |
| 3.3 小结 第四章 运用基因芯片技术检测三种肉源性寄生虫 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 供试虫株 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 样品DNA 的提取 |
| 4.1.2.2 引物及探针的设计与合成 |
| 4.1.2.3 基因芯片的制备 |
| 4.1.2.4 PCR 扩增及产物纯化 |
| 4.1.2.5 基因芯片的杂交 |
| 4.1.2.6 基因芯片检测灵敏度实验 |
| 4.1.2.7 基因芯片检测特异性实验 |
| 4.1.2.8 基因芯片检测重复性和稳定性实验 |
| 4.1.2.9 基因芯片模拟污染实验 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 引物及探针的设计 |
| 4.2.1.1 引物及探针的设计过程 |
| 4.2.1.2 各虫株引物和探针位点的选择 |
| 4.2.2 杂交结果判断标准 |
| 4.2.2.1 杂交结果判断标准的确定 |
| 4.2.2.2 非特异性信号的判定标准的确定 |
| 4.2.2.3 重复实验的判定标准的确定 |
| 4.2.3 基因芯片特异性实验结果 |
| 4.2.3.1 探针的BLAST 同源分析 |
| 4.2.3.2 PCR 扩增电泳结果 |
| 4.2.3.3 基因芯片杂交扫描检测结果 |
| 4.2.4 基因芯片灵敏度实验结果 |
| 4.2.5 基因芯片重复性与稳定性实验结果 |
| 4.2.6 基因芯片模拟污染实验结果 |
| 4.3 小结 第五章 结论 本论文主要创新点 参考文献 致谢 |
（9）母体血浆中胎儿DNA点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 母体血浆中胎儿DNA 点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 母体血浆DNA 实验模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Gap-LCR 结合荧光定量PCR 技术在低丰度DNA 点突变检测中的应用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PCR/LDR 结合毛细管电泳技术在母体血浆中胎儿DNA 单核苷酸差异检测中的应用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 PCR/LDR 结合纳米金新型通用型芯片技术的建立及其在低丰度DNA 点突变检测中的应用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 母体血浆中胎儿核酸物质的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 DNA 连接酶及相关检测技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的文章 |
（10）运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 1 食品中常见致病菌及常规的检测技术 |
| 1.1 食源性致病菌危害的严重性 |
| 1.2 常见的食源性致病菌 |
| 1.3 食源性致病菌检测技术应用的现状 |
| 1.4 上述检测技术应用的不足 |
| 2 基因芯片技术简介 |
| 2.1 基因芯片技术的原理 |
| 2.2 基因芯片技术的种类 |
| 2.2.1 按载体材料分类 |
| 2.2.2 按点样方式分类 |
| 2.2.3 按探针种类分类 |
| 2.2.4 按用途分类 |
| 2.3 基因芯片的应用范围及现状 |
| 2.3.1 基因芯片在微生物方面的应用 |
| 2.3.2 基因芯片在其他方面的应用 |
| 2.4 基因芯片的发展前景 |
| 3 基因芯片技术检测肠道致病菌 |
| 3.1 检测肠道致病菌的毒力因子 |
| 3.2 通用引物结合基因芯片检测肠道致病菌 |
| 3.2.1 通用引物扩增16S rDNA基因、16S-23S rDNA、23S rDNA基因 |
| 3.2.2 基因芯片直接检测致病菌的16S rRNA基因 |
| 3.2.3 基因芯片直接检测致病菌的DNA |
| 3.3 基因芯片用于细菌分型 |
| 3.4 基因芯片在肠道致病菌检测方面的前景 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 细菌培养基 |
| 1.2.2 细菌基因组DNA提取试剂 |
| 1.2.3 PCR试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.3.1 PCR仪 |
| 1.3.2 基因芯片相关仪器 |
| 1.3.3 其他仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 运用寡核苷酸芯片技术检测食源性致病菌的研究 |
| 2.2 运用寡核苷酸芯片技术检测的九种食源性致病菌 |
| 2.3 寡核苷酸芯片检测使用的引物和探针 |
| 2.4 寡核苷酸芯片的制备 |
| 2.4.1 引物和氨基化探针的制备 |
| 2.4.2 芯片点样及后处理 |
| 2.4.3 芯片的质量验证 |
| 2.5 细菌培养及模板DNA的提取 |
| 2.5.1 细菌基因组DNA提取 |
| 2.5.2 细菌基因组DNA提取结果检测 |
| 2.6 PCR扩增反应及产物标记 |
| 2.6.1 PCR反应 |
| 2.6.2 PCR产物的精制及定量 |
| 2.6.3 精制后标记 |
| 2.7 芯片的杂交及扫描 |
| 2.7.1 杂交过程 |
| 2.7.2 扫描检测并分析结果 |
| 2.8 寡核苷酸芯片杂交条件的优化 |
| 2.8.1 不同杂交温度的比较 |
| 2.8.2 不同杂交液的选择 |
| 2.9 寡核苷酸芯片特异性实验 |
| 2.10 寡核苷酸芯片灵敏度实验 |
| 2.11 模拟污染实验 |
| 2.12 多重PCR反应实验 |
| 2.12.1 多重PCR反应体系的筛选 |
| 2.12.2 多重PCR反应参数的优化 |
| 2.12.3 四重PCR扩增反应及芯片检测 |
| 2.12.4 三重PCR扩增反应及芯片检测 |
| 2.13 细菌DNA的几种不同提取方式的比较试验 |
| 2.13.1 实时荧光PCR检测用引物的设计与优化 |
| 2.13.2 实时荧光PCR反应条件 |
| 2.13.3 不同方法提取的模板进行实时荧光PCR检测比较 |
| 2.13.4 以煮沸沙门氏菌落的水溶液做为模板时所需的最短煮沸时间的摸索 |
| 结果与分析 |
| 1 PCR扩增反应结果 |
| 1.1 琼脂糖凝胶电泳检查DNA提取结果 |
| 1.2 九种细菌的PCR检测 |
| 1.3 九种细菌基因组DNA分光光度计检测结果 |
| 2 引物和探针的研究设计 |
| 2.1 引物和探针的设计过程 |
| 2.1.1 九种致病菌引物和特异性探针位点的选择 |
| 3 寡核苷酸芯片检测结果 |
| 3.1 杂交结果判定标准 |
| 3.1.1 有效的杂交结果判定标准的确定 |
| 3.1.2 非特异性信号的判定标准的确定 |
| 3.1.3 重复实验的判定标准的确定 |
| 3.2 寡核苷酸芯片杂交条件优化结果 |
| 3.2.1 杂交温度优化结果 |
| 3.2.2 不同杂交液的选择结果 |
| 3.3 九种致病菌寡核苷酸芯片特异性实验结果 |
| 3.3.1 副溶血性弧菌芯片检测结果 |
| 3.3.2 霍乱弧菌芯片检测结果 |
| 3.3.3 肠出血性E.coli 0157：H7芯片检测结果 |
| 3.3.4 空肠弯曲菌芯片检测结果 |
| 3.3.5 耶尔森氏菌芯片检测结果 |
| 3.3.6 单增李斯特氏菌芯片检测结果 |
| 3.3.7 鼠伤寒沙门氏菌芯片检测结果 |
| 3.3.8 弗氏志贺氏菌芯片检测结果 |
| 3.3.9 金黄色葡萄球菌芯片检测结果 |
| 3.4 寡核苷酸芯片检测的重复性和稳定性实验结果 |
| 3.5 寡核苷酸芯片灵敏度实验结果 |
| 3.5.1 平板计数结果 |
| 3.5.2 不同浓度菌液的PCR产物电泳结果 |
| 3.5.3 芯片检测结果 |
| 3.6 模拟污染实验结果 |
| 4 多重PCR实验结果 |
| 4.1 四重PCR实验结果 |
| 4.2 三重PCR实验结果 |
| 5 模板DNA的几种不同提取方式的比较试验结果 |
| 5.1 不同方法提取的模板进行实时荧光PCR检测比较的结果 |
| 5.2 以煮沸沙门氏菌落的水溶液做模板时所需的最短煮沸时间摸索结果 |
| 6 使用荧光标记试剂盒时出现的问题 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 英文摘要 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文独创性声明 |
| 学位论文版权的使用授权书 |
四、三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响（论文参考文献）
- [1]可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究[D]. 向华. 四川农业大学, 2018(02)
- [2]同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用[D]. 刘志鹏. 四川农业大学, 2018(02)
- [3]小麦、百萨偃麦草和花生染色体荧光原位杂交寡核苷酸探针（套）开发与应用[D]. 杜培. 南京农业大学, 2017(05)
- [4]两种标记方法对cDNA芯片杂交信号的初步分析[J]. 杨国淋,赵松,黄小波,马锐,张仙,滑翔,赵玉佳,曹三杰,文翼平,伍锐,文心田. 中国兽医科学, 2016(03)
- [5]麻疹病毒属6种重要病毒目视化基因芯片检测方法的建立及其初步应用[D]. 朱晓光. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [6]牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究[D]. 季新成. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [7]缺失型α-地中海贫血基因诊断芯片及在分子流行病学研究中的应用[D]. 李泽松. 重庆大学, 2008(06)
- [8]肉（鱼）源性寄生虫检测方法的研究[D]. 张媛. 辽宁师范大学, 2008(09)
- [9]母体血浆中胎儿DNA点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究[D]. 易萍. 第三军医大学, 2006(11)
- [10]运用寡核苷酸芯片鉴定检测食源性致病菌技术的研究[D]. 高爽. 辽宁师范大学, 2006(11)