噬菌体展示技术筛选乙肝病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白

一、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白（论文文献综述）

杨艳杰,成军,王琦,郭江^[1]（2011）在《尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4上调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ表达的研究》文中提出目的研究乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原基因启动子Ⅱ（SPⅡ）与肝细胞蛋白——尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4（NADHDH4）结合机制及其调节功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术,参照HBVayw基因序列与NADHDH4cDNA序列全编码区设计相应引物,以pCP10质粒及肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增SPⅡ和NADHDH4的DNA片段,将其分别克隆至pCAT3及pcDNA3.1（-）中,构建pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcD-NA3.1（-）-NADHDH4真核表达载体,以其质粒共转染HepG2细胞。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体对pcDNA3.1（-）-NADHDH4真核表达载体的调节活性。结果成功构建了pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcDNA3.1（-）-NADHDH4真核表达载体,pCAT3-SPⅡ实验组酶表达为pCAT3的2.8倍,而pcDNA3.1（-）-NADHDH4+pCAT3-SPⅡ实验组酶表达约为pCAT3-SPⅡ的5倍,结果显示NADHDH4对HBVSPⅡ具有上调作用。结论共转染实验证实了NADHDH4对SPⅡ有明显的上调作用,为进一步阐明乙型肝炎病毒致病的分子生物学机制奠定了基础。

田江克^[2]（2007）在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF），分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白（SHBs），中蛋白（MHBs．前-S2+S）和大蛋白（LHBs：前-S1+前-S2+S）。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白（MHBst）具有反式调节功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用，但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达95％。我们首先利用多聚酶链反应（PCR）方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109（a型）并在其内表达，Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187（α型）进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到9种已知基因，ADP核糖基因子2个，RAB6相互作用蛋白1个，CCR4-NOT转录复合体亚基10（CCR4-NOT-10）1个，脂多糖蛋白结合蛋白（LBP）1个，醛缩酶B（ALDOB）1个，补体成分3（C3）1个，丙酮酸脱氢酶（PDH）1个，人类细菌人工染色体（BAC）1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白（LBP）基因并克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素35S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白，为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。

钟彦伟^[3]（2006）在《干扰素β调节分子机制研究》文中研究指明乙型、丙型病毒性肝炎严重危害我国人民健康。但是到目前为止还没有有效而可靠的抗病毒根治办法。虽然干扰素α（IFNα）有一定的抗病毒作用,但研究表明仅对30%～40%的病人有效。拉米夫定、阿德福韦酯等虽然有一定抗病毒效果,但长期使用易引起病毒耐药变异,限制了其广泛应用。因此,对IFNα或拉米夫定等治疗无效的患者仍需探索新的治疗途径。 近年来研究表明,干扰素β（IFNβ）与干扰素α一样,是一种具有多种生物学作用的重要细胞因子,虽然其与IFNα抗病毒作用机理相似,但IFNβ具有独特性,而这一独特性与IFNβ的抗病毒效果紧密相关。因而IFNβ在乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗中具有重要应用前景。近年来的临床资料表明,由于IFNβ不易产生抗体,可有效治疗干扰素α治疗无效的慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者,而且在治疗慢性丙型肝炎导致的肝细胞癌方面IFNβ比IFNα有更好的抗肿瘤治疗效果。但是到目前为止,IFNβ对于机体的免疫调节和抗病毒、抗肝纤维化、抗肝细胞癌治疗的分子机制还不十分清楚。 本研究利用先进的分子生物学技术,研究肝细胞内影响IFNβ转录调节的因素、IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响以及与IFNβ具有相互作用的肝细胞结合蛋白。以期能从中发现某些有价值的线索,为阐明IFNβ独特的抗病毒功能提供重要的实验依据。 为探索IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响,我们首先以分子生物学技术构建了真核表达质粒pcDNA3.1（-）-IFNβ,以空载体pcDNA3.1（-）为平行对照,转染HepG2细胞,并制备细胞裂解液。应用抑制性消减杂交（SSH）技术,构建差异表达的cDNA消减文库,对阳性克隆进行测序和同源性分析,初步确定IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后上调或下调的基因;同时应用不同浓度的重组IFNβ刺激对数生长期的HepG2细胞,以生理盐水处理的HepG2细胞为平行对照,制备细胞裂解液。提取总mRNA,逆转录为cDNA,进行SSH的2次杂交PCR扩增,筛选重组IFNβ作用肝细胞后差异表达的基因。抑制性消减杂交结果表明,共获得了25种上调表达的基因,其中包括

陈琳^[4]（2006）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究》文中研究表明丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原,近年来临床发现丙型肝炎的慢性化程度较其他各型病毒性肝炎更为严重。HCV表达十种蛋白质的多肽:C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b,目前还发现核心蛋白C的编码基因通过移框从而编码一种新的17KD的F蛋白,这些蛋白在病毒的复制和繁殖中各有不同的功能,但有些具体功能还不清楚。 其非结构蛋白基因NS2编码的NS2蛋白具有基质金属蛋白酶活性,通过抑制细胞凋亡及抑制肝脏和非肝特异性的启动子及增强子而使病毒持续感染,本课题组张黎颖等研究HCV NS2发现其可上调下调多种肝细胞蛋白,在肿瘤的发生发展中具有重要意义,可能是丙型肝炎发生发展的分子生物学机制之一。NS2TP是本课题组在国内首次发现的具有CHCH（螺旋—卷曲）结构域的新蛋白家族成员,HCV NS2可下调其在HepG2细胞中表达水平,与细胞内外源性脂肪代谢密切相关,推测其在HCV相关肝脂肪变中有重要作用。本课题组在完成NS2TP克隆化和蛋白表达的基础上,已用酵母双杂交完成其结合蛋白的筛选,发现其与细胞信号转导通路当中的多种蛋白可发生作用以外,还确实验证其可与细胞色素P4502E1结合,在免疫调节中具有不可忽视的作用。且经过现代生物信息学技术的分析,NS2TP为分泌型蛋白,定位于胞外,易与各种药物相互作用而可作为药品或药靶。 应用噬菌体展示技术,以NS2TP启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。噬菌体经富集后,筛选出30个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和NS2TP启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白。用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到NS2TP启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS2TP的转录调节机制,系统阐述HCV NS2的致病机制提供依据。

纪冬^[5]（2005）在《乙型肝炎病毒表面抗原蛋白反式调节作用的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病。尽管抗病毒治疗在一部分患者中取得了一定的疗效,但总的疗效不满意。因此,必须探索新的治疗技术和方法,要探索新的治疗技术和方法,就要以肝炎病毒致病的机制作为基础。我们应用分子生物学技术对于肝炎病毒与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制进行系统的探讨,目的是为病毒性肝炎新型治疗技术和方法的研究寻找新的思路、奠定理论基础。 HBV是一种嗜肝部分双链DNA病毒,其基因组长约3.2kb,具有4个主要的开放读码框架（ORF）,分别命名为S、C、P、X区,其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域:前-S1,前-S2和S结构域,从这三个ATG开始编码产生三种大小不等的表面抗原蛋白:主蛋白（SHBs）,中蛋白（MHBs:前-S2+S）和大蛋白（LHBs:前-S1+前-S2+S）。HBV表面抗原蛋白具有多种功能,其中反式调节功能在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用。 为研究HBV表面抗原蛋白的反式调节作用,我们以分子生物学技术构建表面抗原蛋白的真核表达载体pcDNA3.1（-）-SHBs、pcDNA3.1（-）-PreS1、pcDNA3.1（-）-PreS2,并将构建好的重组质粒转染HepG2细胞,以空载体为平行对照,制备细胞裂解液。应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）技术,构建表面抗原蛋白激活基因差异表达的cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆,多聚酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。对转染后的细胞裂解液同时应用基因表达谱芯片技术筛选差异表达的mRNA。筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、蛋白质翻译合成、肿瘤、物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测表面抗原蛋白在体内可能存在的调控机制的线索,并发现一些未知功能的基因,其中之一命名为HBV前-S1蛋白反式激活蛋白1（PS1TP1）。 在新基因功能研究方面,我们对PS1TP1的功能进行了初步探讨。应用生物信息学及常规分子生物学技术从HepG2细胞中得到了PS1TP1基因的编

高学松^[6]（2005）在《应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白》文中进行了进一步梳理目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种严重危害人类健康的致病因子。在我国,它是导致肝炎、肝硬化、肝细胞癌的主要原因。HBV 属嗜肝DNA 病毒,其基因组为3.2kb 部分双链的环状DNA。HBV 基因组的功能单位十分密集,高度压缩,重复利用。HBV 核心启动子（HBV Core promoter,CP）在HBV 的转录和复制上起重要作用,指导前基因组mRNA 和前核心mRNA 转录。由于病毒基因的表达与调控是研究病毒复制的核心问题,所以本文旨在通过研究与HBV CP 结合的肝细胞特异性蛋白质因子,进一步了解HBV CP 在病毒致病过程中的作用。方法:根据文献报道设计上下游引物,采用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术克隆了HBV CP 的基因片段,将其与氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransfe -rase,CAT 报告基因载体连接,构建了重组报告基因载体pCAT-CP,转染人肝癌细胞系HepG2,同时转染实验室保存的不同的HBV CP 变异株, 用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测氯霉素乙酰转移酶的表达,验证其活性。以此结论为基础,我们应用噬菌体展示技术筛选HBV CP结合蛋白基因,以HBV CP PCR产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA 文库进行4 轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,将第4 轮阳性噬斑裂解液

成军^[7]（2005）在《加强肝细胞对乙型肝炎病毒调节作用机制的研究》文中指出

成军,洪源,刘妍,王琳,钟彦伟,戴久增,张玲霞,陈菊梅^[8]（2005）在《乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选》文中指出目的 应用表达谱基因芯片技术 ,研究乙型肝炎病毒 （HBV）表面抗原基因启动子DNA结合蛋白 1（SBP1）反式调节基因 ,阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成SBP1基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 （PCR）技术扩增SBP1基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1（-） SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 .1（-）的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因容量的表达谱芯片的筛选中 ,发现有 12个基因表达水平显着上调 ,6个基因表达水平显着下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。

高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,刘妍^[9]（2004）在《噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究》文中认为目的 :通过筛选乙型肝炎病毒 （HBV）核心启动子 （corepromoter ,CP）结合蛋白 ,为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径。方法 :应用噬菌体展示技术 ,以HBV的核心启动子的聚合酶链反应 （PCR）产物作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 4轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 :噬菌体经富集后 ,随机筛选得到 7个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列 ,分别编码 β2微球蛋白和 3种未知功能蛋白。 结论 :用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径

成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳^[10]（2004）在《HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化》文中指出目的:利用生物信息学（bioinformatics）技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白（PS1BP）编码基因的同源基因. 方法:人PS1BP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PS1BP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院（MH）国立医学图书馆（NLM）生物工程信息学研究中心（NCBI）建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASTn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PS1BP的cDNA序列之后,对于大鼠PSIBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PS1BP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PS1BP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析. 结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PS1BP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PS1BP的cDNA及其编码产物的序列.大鼠PS1BP的cDNA由1455 nt组成,编码产物由484 aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%（391/484）和92.98%（450/484）.利用在线分析软件,在大鼠PS1BP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点. 结论:大鼠PS1BP基因及其编码产物序列被确定

二、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白（论文提纲范文）

（1）尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4上调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ表达的研究（论文提纲范文）

（2）乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究（论文提纲范文）

（3）干扰素β调节分子机制研究（论文提纲范文）

（4）丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究（论文提纲范文）

（5）乙型肝炎病毒表面抗原蛋白反式调节作用的研究（论文提纲范文）

（6）应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文提纲范文）

（9）噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究（论文提纲范文）

四、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白（论文参考文献）

• [1]尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4上调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ表达的研究[J]. 杨艳杰,成军,王琦,郭江. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2011(03)
• [2]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
• [3]干扰素β调节分子机制研究[D]. 钟彦伟. 中国人民解放军军医进修学院, 2006(09)
• [4]丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究[D]. 陈琳. 安徽理工大学, 2006(10)
• [5]乙型肝炎病毒表面抗原蛋白反式调节作用的研究[D]. 纪冬. 中国人民解放军军医进修学院, 2005(06)
• [6]应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白[D]. 高学松. 河北医科大学, 2005(06)
• [7]加强肝细胞对乙型肝炎病毒调节作用机制的研究[J]. 成军. 胃肠病学和肝病学杂志, 2005(01)
• [8]乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选[J]. 成军,洪源,刘妍,王琳,钟彦伟,戴久增,张玲霞,陈菊梅. 胃肠病学和肝病学杂志, 2005(01)
• [9]噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究[J]. 高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,刘妍. 中西医结合肝病杂志, 2004(04)
• [10]HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化[J]. 成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳. 世界华人消化杂志, 2004(07)