一、水稻体细胞突变体HX-3在细胞水平上对白叶枯病的抗性（论文文献综述）
徐乾坤[1]（2021）在《水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析》文中研究指明水稻（Oryza sativa L.）作为全球最重要的粮食作物之一。在水稻的整个生长发育进程中常常会遭受周围环境中许多不利因素的影响,比如温度、湿度、光照、及各种病原菌等。这些不利因素通常会导致水稻植株发生ROS爆发、PCD、代谢途径紊乱、胼胝质累积及防卫反应相关基因表达量升高等,从而造成水稻类病斑性状的出现。水稻类病斑突变体通常在其叶片、叶鞘、茎秆或种子上自发形成大小、颜色等各异的坏死斑点。目前已鉴定的水稻类病斑突变体大多都提高了对一些病原菌的抗性,因此,水稻类病斑突变体是研究植物PCD和防卫反应发生机制的良好材料,研究和分析造成水稻类病斑表型产生的基因对了解水稻的抗病机制有重要意义。本研究中的类病斑突变体材料lml11（lesion mimic leaf 11）是通过EMS诱变粳稻品种中花11（ZH11）而来。我们主要对lml11突变体进行了包括表型分析、生理生化分析、种子灌浆、稻米品质、突变体种子发芽分析、抗病性分析、基因的克隆与功能分析、基因表达分析、生物信息学和转录组测序分析等方面的研究。通过这一系列的研究和分析,我们了解了lml11突变体类病斑表型的发生机制及其抗病性能,为水稻类病斑突变体的研究提供了理论参考。主要的研究结果如下:1.lml11突变体的表型特征:lml11突变体从三叶期时就已经表现出了红褐色类病斑性状。在分蘖期,lml11突变体叶片上的病斑更加明显且更为密集。进入抽穗期后,lml11突变体整个植株的叶片在两到三周时间内迅速布满红褐色的斑点,并导致叶片迅速枯死。农艺性状调查发现,lml11突变体的一些主要农艺性状如:株高、分蘖数、穗长、一次枝梗、二次枝梗、每穗粒数、每穗实粒数和结实率都表现出显着地下降。2.lml11突变体的生理生化特征:lml11突变体叶片中光合色素含量（如叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）与野生型叶片相比呈现出极显着降低。光合速率测定显示lml11突变体叶片的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2的浓度等与野生型叶片相比表现出明显的降低。组织化学染色结果表明,lml11突变体叶片DAB染色后出现褐色沉积,NBT染色后出现蓝色沉淀,H2DCFDA探针染色后叶片气孔处出现绿色荧光;生理指标测定结果显示,H2O2和MDA含量显着升高,CAT酶活显着下降,这些结果均表明lml11突变体的叶片中积累了大量的活性氧。TUNEL检测和彗星实验均显示lml11突变体叶片中存在大量细胞程序性死亡。遮光实验和6-BA处理则证明了黑暗处理条件可以导致lml11突变体叶片中叶绿体的迅速降解,并造成了叶片细胞的快速死亡,表明lml11突变体的类病斑表型可能是黑暗诱导的。3.lml11突变体的灌浆速率和稻米品质:对lml11突变体和野生型不同灌浆时期种子进行调查和统计分析显示,lml11突变体中一部分种子基本没有灌浆,另一部分种子也因为突变体植株叶片的迅速死亡无法完全灌浆。与野生型相比,同一时期lml11突变体灌浆籽粒的鲜重和干重都显着下降。拷种分析显示,lml11突变体的种子除长度外,其宽度、厚度和千粒重都比野生型种子显着下降;lml11突变体的糙米在长度、宽度、厚度和千粒重方面较野生型下降更为显着。种子的灌浆情况和千粒重常影响种子的品质。调查发现,lml11突变体的种子有较多垩白,种子不通透。与野生型相比,lml11突变体种子胚乳的横截面有条柱状突起,淀粉颗粒无棱角,多呈现出球形或无规则形态型,大小各异,淀粉颗粒与颗粒之间存在肉眼可见的缝隙,且排列松散。稻米品质检测显示lml11突变体种子的总淀粉含量、直链淀粉含量和可溶性糖含量都比野生型种子显着下降;lml11突变体种子的糊化温度比野生型显着升高;lml11突变体种子的蛋白质含量较野生型种子明显升高。4.lml11突变体种子发芽分析:LML11基因突变后导致突变体种子无法通过正常的浸种途径发芽。GA处理发现,将lml11突变体种子用1μM、5μM和10μM浓度的GA溶液浸泡后,可以显着提高其发芽率。在GA处理7天后,1μM、和5μM浓度的GA甚至可以将lml11突变体种子的发芽率提高到55%。但10μM浓度的GA对lml11突变体和野生型发芽种子的根长和芽长有一定的抑制作用。5.lml11突变体类病斑性状的形成是由基因突变所致:lml11突变体的类病斑表型受一对单隐性基因控制。我们使用图位克隆的方法将LML11基因定位在11号染色体分子标记M5和M6之间,该区间的物理距离为61.3 kb。测序发现LOC＿Os11g40590的CDS上第277个碱基G突变成了碱基A,导致氨基酸序列中第93个氨基酸由缬氨酸转变为了异亮氨酸。将野生型的LML11基因的完整序列导入到lml11突变体中,转基因植株表现出了与野生型类似的表型。将野生型的LML11基因敲除后,转基因植株也出现了类病斑的表型。因此,LOC＿Os11g40590即为LML11基因。组织表达实验表明LML11是一个组成型表达基因。GUS转基因染色还显示LML11基因在发芽种子的胚芽中表达,LML11基因在灌浆籽粒中的表达分析显示其在灌浆9天左右时表达量达到最高。亚细胞定位结果表明LML11在细胞质和细胞核中均有表达。6.LML11基因的生物信息学分析:LML11基因的CDS有2793个碱基,编码930个氨基酸。在LML11蛋白氨基酸序列的N端存在一段甘氨酸重复序列,说明LML11蛋白可能属于GRDP。多重序列分析发现LML11蛋白的同源蛋白序列在多个单子叶植物、双子叶植物及苔藓中都有一段保守的未知功能区域,说明这一功能区域在进化的过程中是非常保守的。分析发现突变体中LML11基因的突变位点刚好在这个保守的未知功能区域上,我们推测水稻lml11突变体类病斑表型的产生与该保守未知区域的功能丧失有关。7.lml11突变体的抗病性:与野生型相比,lml11突变体对两个白叶枯菌小种PXO99A和PXOzhe173表现出了很好的抗性。而三个超表达株系对两个白叶枯菌小种PXO99A和PXOzhe173的抗性与野生型相比没有显着性差异。与野生型和三个超表达株系相比,病程相关基因PR1a、PR1b、PBZI、NAC和PAL在lml11突变体中的表达量极显着升高。8.lml11突变体的转录组测序分析:转录组数据显示野生型和lml11的转录组测序质量合格,且样本之间的重复性很好。lml11突变体和野生型的DEGs分析显示,lml11突变体中有2149个基因的表达量下调,有3380个基因的表达量上调;lml11突变体中绝大部分参与植物免疫反应基因的表达量较野生型显着升高。lml11突变体和野生型差异相关基因的GO富集结果显示,包括氧结合（GO:0019825）、新陈代谢过程（GO:0009607）、次生代谢过程（GO:0019748）、胁迫反应（GO:0006950）和激酶活性（GO:0003824）等与ROS积累相关的生物学进程得到了显着性富集。KEGG通路富集结果显示光合作用通路和光合生物中的碳固定通路得到了富集,表明lml11突变体类病斑表型的产生影响了突变体叶片的光合作用。
徐如梦[2]（2021）在《OsWRKY28转录因子在水稻抗病信号转导中的作用》文中提出WRKY转录因子与植物防御相关的转录重编程密切相关,其结合位点W-box存在于许多防御相关基因的启动子上,对调控植物的防御反应至关重要。本研究的主要目标是通过利用基因编辑材料,明确Os WRKY28基因的基本功能。同时利用相关分子生物学手段分析该基因的上下游调控网络和蛋白互作网络,从而探究其在抗病信号转导中的作用。本论文的主要的研究工作包括:1、通过转录组测序比较了抗病材料Y73与其轮回亲本DLX的防御相关基因在转录调控水平上的表达差异,发现无论是在接菌叶还是系统叶中对白叶枯菌响应的差异基因中均包含了大量的转录因子,而且这些转录因子中数量最多的一类是WRKY转录因子。这些WRKY转录因子在抗病材料中的表达水平往往明显高于它们在感病材料中的表达水平。这些发现表明这部分转录因子,尤其是其中的WRKY转录因子在水稻对白叶枯病的抗性形成中起非常重要的作用。2、鉴于Os WRKY28在水稻基础抗性中的潜在作用,本研究对Os WRKY28进行了更深入的时空表达分析。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）结果显示,在模式品种日本晴中,Os WRKY28基因的表达在接菌6 h后会发生显着上调,并且随着时间的推移呈现出一个波动上升的状态。利用Os WRKY28基因编辑材料开展的接菌实验显示,带有Os WRKY28突变的材料更易感病,从而证实Os WRKY28参与了水稻对白叶枯病抗性的形成。3、q RT-PCR的实验结果显示外源施加茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,Me JA）可以诱导Os WRKY28基因的表达,表明Os WRKY28基因受到茉莉酸信号的调控。同时,我们还利用双荧光素酶报告基因实验探索了茉莉酸信号转导中的重要节点MYC家族基因对WRKYK28的表达调控。发现Os MYC2可以抑制Os WRKY28的表达,而Os MYC4转录因子可以增强Os WRKY28的表达,这也进一步表明Os WRKY28在JA介导的信号转导途径中还受到MYCs的精细调控。4、亚细胞定位实验结果表明,不管是在水稻原生质体中还是在烟草叶表皮细胞中,Os WRKY28均主要定位在细胞核中,这符合其转录因子的基本特性。鉴于转录因子常需要与其他调控因子一起行使转录调控的功能。因此,本研究在酵母双杂交系统中对Os WRKY28的潜在共调控因子进行了筛选,并采用Bi FC（Bimolecular Fluorescence Complementation）等方法对互作进行了验证。本研究筛选到的基因中,包括转录因子、泛素化修饰蛋白、衔接蛋白和受体蛋白（Os WIP1）等。初步的序列分析显示,Os WIP1包含一个Avr-Cleavage结构域,可能与细菌侵染植物的三型分泌系统的效应因子有紧密关联。5、构建了Os WRKY28的原核表达载体,并优化了相应的表达条件,从而获得了较高浓度的纯化蛋白并制备了Os WRKY28的抗体。利用制备好的抗体进行了蛋白质免疫印迹实验,我们发现相比于野生型,Os WRKY28基因编码的蛋白在多个基因编辑株系中均不能正常表达,从而证实了基因编辑材料在蛋白质水平上的可靠性。综上所述,本研究确认了Os WRKY28能够在水稻白叶枯病抗性形成中发挥重要作用。我们发现其表达不但受白叶枯菌影响,还受茉莉酸及其衍生物的影响。而MYC基因家族对Os WRKY28基因表达的调控,则进一步显示其在水稻抗病信号调控网络中受到了茉莉酸信号的精细调控。相信,对本研究中创制的WRKY28相关遗传材料及筛选获得的互作基因进行深入的研究,将为我们了解WRKY转录因子家族基因在抗病中的作用,尤其是该类转录因子在细菌性病害抗性形成中的作用增添更多的基础数据。
张标明[3]（2020）在《水稻抗白叶枯病主效基因Xa14的克隆与功能分析》文中研究表明水稻是世界上重要的粮食作物。由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的白叶枯病是造成水稻大面积减产的罪魁祸首之一,农业生产中控制白叶枯病流行的最佳方法是利用主效抗白叶枯病基因改良水稻品种的抗性。主效抗病基因的克隆与功能的研究对减轻水稻的病害有着非常重要的科学意义和应用价值。Xa14是完全显性抗性、特异性专抗白叶枯病菌菲律宾致病小种P5（PXO112）的主效抗病基因。本研究利用IR24/IRBB14杂交F2分离群体中的599个单株,将Xa14精细定位于分子标记52940和RM5473之间。通过生物信息学手段在定位区间找到一个编码BED-NLR蛋白的候选基因,命名为RGAf-BB14。将该候选基因转入感病亲本IR24中进行功能互补验证,结果发现携带RGAf-BB14转基因植株对PXO112都表现抗性,并且T1代家系符合共分离检测,说明RGAf-BB14就是Xa14基因。比较测序发现,Xa14与Xa1是等位基因。同时,通过同源克隆和转基因互补实验证明Xa1-2和Xa31（t）是同一个基因,并且也是Xa1和Xa14的等位基因。此外,我们对该位点各等位基因所编码蛋白进行分析,发现了它们LRR区中存在一种特异性且高度保守的重复结构,称为中间串联重复（central tandem repeat,CTR）。并且,我们还命名了多个可能影响水稻抗性的结构域。比如,感病基因RGAf编码的蛋白中有干涉基序（intervening motif）,而XA1、XA1-2和XA14蛋白中都没有;XA14中有连接子基序（linker）,而XA1与XA1-2蛋白中不存在连接子。为了研究Xa1、Xa1-2、Xa14基因的关系,将它们分别进行杂交。接种白叶枯病菌后发现,Xa1/Xa14和Xa1-2/Xa14杂交植株的抗病程度都比亲本抗病程度低,而Xa1/Xa1-2杂交植株的抗病程度与亲本相比无明显差异。说明Xa1、Xa1-2与Xa14对白叶枯病菌的抗性可能存在拮抗作用,Xa1与Xa1-2之间不存在这种作用。进一步分析,发现这三个基因编码的蛋白可能通过氨基端的BED结构域在细胞核中发生相互作用。此外,对100个来自禾本科的同源蛋白进行进化分析,结果显示,RGAf可能首先起源于一种野生水稻,然后Xa14起源于RGAf。Xa1和Xa1-2可能是由Xa14进化生成的,但是很难确定Xa1和Xa1-2哪个出现更早。为了探究Xa14的抗病机理,对抗感材料IRBB14与IR24分别接种PXO112后分析抗病相关下游基因的表达量情况。结果发现,抗病亲本IRBB14中的Os WRKY45基因表达量明显升高。我们在携带Xa14材料中超量表达细菌的水杨酸羟化酶Nah G基因后接种PXO112,发现超量表达Nah G基因的植株对病原菌的抗性显着下降。该结果表明,在超量Nah G植株中Xa14的抗病性受到了抑制。本研究以白叶枯病为研究对象,分离克隆了Xa14以及其等位基因Xa1-2和Xa31（t）,并发现Xa14、Xa1和Xa1-2之间有复杂的作用关系。如果将其聚合在同一水稻植株中,对抗性会产生不同的影响。该研究还对Xa14以及其等位基因的抗病机制进行了初步探究,发现Nah G基因可能会抑制Xa14的抗性。这些研究结果能够为水稻抗病育种提供基因资源和理论基础。
宗超峰[4]（2020）在《Cdr4介导水稻类病变及抗病性的分子机理研究》文中认为水稻类病变突变体是由于自身遗传物质的改变会在无逆境胁迫和病原菌侵染情况下自发出现坏死斑表型。大多数突变体会表现出抗病基因的上调表达,植株获得系统获得性抗性,增强对病原菌的抗性,因此类病变突变体被认为是研究细胞死亡和防御应答的重要材料。在本实验室前期研究中,从T-DNA插入突变群体中鉴定到一个类病变突变体Cdr4（cell death and resistance 4）。Cdr4突变体叶片在抽穗期开始出现类病斑,通过遮光实验发现Cdr4突变体的类病变表型受自然光诱导;Cdr4突变体叶片中大量活性氧的积累是产生类病斑的重要原因;遗传分析表明,Cdr4表型由一个显性单基因控制,通过Tail-PCR实验确定插入位点在在水稻2号染色体上1.6 Mb处。在此基础上通过定量实验分析插入位点下游10 kb内基因表达量变化来确定候选基因,又利用转基因技术验证候选基因的功能;确定候选基因CDR4后通过酵母双杂筛选出互作蛋白,并通过分析互作蛋白的功能来研究CDR4的功能;利用RNA-Seq及生物信息学分析,筛选CDR4调控的抗病相关基因,通过定量验证相关基因的表达量变化,最后结合互作蛋白功能研究来阐明CDR4调控水稻抗病反应的分子机理。首先通过RT-qPCR分析插入位点附近基因表达量,发现Os02g0131800基因的表达量在Cdr4突变体中上调19倍,并通过RT-PCR验证这一结果。利用转基因技术,在Cdr4突变体中敲除Os02g0131800基因,共获得24株转基因植株,其中有3株纯合突变体。在成熟期,Cdr4突变体叶片已充满类病斑,但这3株纯合突变体无类病斑的产生,确定CDR4的候选基因就是Os02g0131800基因。然后构建了酵母双杂的cDNA文库,并将CDR4基因构建到诱饵载体上（无自激活现象）,通过酵母双杂实验筛选到20个与CDR4有相互作用的蛋白,测序发现编码这20个蛋白的基因分布在水稻除7、9、12外的其他9条染色体中,这些蛋白的功能各不相同,推测CDR4可能参在水稻多个生命活动过程发挥重要作用。其中OsSPL1会参与调控植株抗病反应,可能与CDR4介导的水稻抗病相关,实验有对OsSPL1和CDR4做了一对一酵母双杂验证,结果表明CDR4和OsSPL1确实存在相互作用,说明CDR4通过与OsSPL1相互作用,可能改变OsSPL1的酶活性,从而影响植株内S1P的含量,进而提高了植株的抗病性。最后通过RNA-Seq技术和生物信息学分析,发现Cdr4与野生型基因表达量具有显着差异,在Cdr4突变体中变现为表达上调的有187个,在Cdr4突变体中变现为表达下调的有134个,总共筛选出321个具有显着表达量差异的基因。通过GO分析发现差异表达基因富集在几丁质分解代谢和几丁质酶活性中;KEGG Pathway分析发先差异表达基因富集在植物-病原体相互作用通路中,这表明差异表达基因的功能大多与植物防御反应相关,通过定量分析发现在Cdr4中抗病相关基因表达量存在上调趋势,接菌实验表明Cdr4对白叶枯病菌的抗病性显着增强。综上所述,CDR4基因的表达上调是导致Cdr4突变体产生类病变的原因,CDR4通过与OsSPL1互作,可能增加了植株内S1P的含量,使得抗病相关基因表达量上升,激活植株防御反应,从而提高了植株的抗病性。
于玉凤[5]（2020）在《OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机理初探》文中进行了进一步梳理水稻白叶枯病是一种世界性水稻细菌性病害,对水稻生产以及粮食的安全都造成了严重危害,因此对水稻抗病相关机制的研究尤为重要。本实验室前期已证明了OsmiR1858a超表达株系显着提高了对白叶枯病的抗性,它的剪切靶基因为OsHIN1（Harpin-induced 1 domain containing protein）,超表达OsHIN1的水稻植株减弱了对白叶枯的抗性,而RNAi和敲除突变体则正好相反。这些结果证明OsHIN1负调控水稻对白叶枯病的抗性,但机制不详。因此,对OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机制进行探索非常必要。OsHIN1为未知功能蛋白,为了明确它可能的作用网络,拟通过鉴定OsHIN1表达特点、亚细胞定位与鉴定它的互作蛋白,为阐明OsHIN1负调控水稻白叶枯病中的机制提供线索。主要研究结果如下:（1）克隆2kb OsHIN1启动子,构建了pOsHIN1::GUS表达载体并遗传转化水稻,经PCR检测筛选获得12株独立转基因株系（已经获得T1代种子）。对转基因水稻GUS染色结果表明,GUS在水稻幼嫩部位表达较多,成熟部位较少;在叶节点、根茎结合部、根毛等分生组织旺盛部位发现强的GUS表达。对同一株系接种白叶枯病菌P6和模拟接水,3 d后取样染色,发现相同部位中GUS在接种P6后的表达强于模拟接水植株。（2）利用35S::eGFP::OsHIN1载体与定位于质膜Marker（mCherry）共转化水稻原生质体,经激光共聚焦显微镜（confocal）观察发现OsHIN1定位于细胞质膜。（3）经农杆菌介导的水稻胚法进行遗传转化,经PCR检测获得10个35S::OsHIN1:eGFP转基因株系与1个35S::eGFP转基因株系,为后续通过免疫沉淀鉴定互作蛋白提供材料基础。（4）利用P6接种水稻3 d后样品,构建了酵母膜蛋白文库,用OsHIN1::BD筛选酵母文库,获得27个阳性克隆。经分析筛选确定了12个靶基因进行酵母双杂交（片段）一对一验证,其中7个候选基因再次显示阳性。在此基础上,克隆这7个基因的CDS序列,分别经酵母双杂交（全长）和双分子荧光互补验证,胆碱磷酸酶在酵母和本氏烟中均显示与OsHIN1互作,另有4个蛋白与OsHIN1在本氏烟中互作,但在酵母中不互作。
杜丹[6]（2020）在《水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析》文中研究说明水稻（Oryza sativa L.）不仅是研究单子叶生物重要的模式植物,也是世界上重要的粮食作物之一。而水稻在种植过程中会受到环境中许多生物胁迫,特别是一些病虫害可以导致水稻严重减产、影响品质。同时,大量农药的使用严重污染了环境,提高了病虫的耐药性,造成了粮食安全的隐患。因而,水稻抗病机制的基础研究对阐释植物的抗性机理具有重大的理论意义,在水稻抗病育种中也具有巨大的应用价值。稻瘟病（Pyricularia oryzae）和白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）均是水稻的主要病害,严重时可导致水稻颗粒无收。因此,稻瘟病和白叶枯病抗病机制研究有助于阐释水稻的抗性机理和抗性育种。本研究利用EMS（ethyl methane sulfonate）诱变籼稻恢复系缙恢10号（J10）获得稳定遗传的叶片类病变突变体并进行了系列研究。通过遗传分析和图位克隆技术得到了目的基因,RPM1 like gene 1（OsRLR1）,进一步分析了该抗病基因的表达模式,解析了野生型和突变体OsRLR1的蛋白结构以及在水稻抗病机制中的功能,主要研究结果如下:1.OsRLR1基因的定位与克隆在自然种植条件下,突变体rlr1从苗期开始在叶片中出现类似病变的细胞死亡现象并伴随着叶片衰老黄化的表型,而病变和黄化表型受到光的诱导。在突变体中,抗病相关基因OsNPR1、OsWRKY45、PAL1、OsPR1a、OsPR10被激活,对稻瘟病和白叶枯病的抗性显着增强。遗传分析表明,突变体rlr1的表型受一对隐性核基因的控制。利用分子标记将目的基因OsRLR1定位在第10染色体66 kb的区间内。通过gDNA和cDNA的测序发现,只有基因LOCOs10g07978编码框的第953位碱基由A颠换为T,导致编码氨基酸由GLU变为了VAL。因而,初步将LOCOs10g07978作为候选的目的基因。2.OsRLR1基因功能互补分析为了验证LOCOs10g07978是否是目的基因,克隆了其在野生型中的编码框序列,并在突变体rlr1中过量表达,突变体rlr1细胞死亡、早衰以及植株农艺性状得到了恢复。同时,与突变体rlr1相比,转基因互补植株的抗病性也得到了削弱,接近野生型的水平。因此,LOCOs10g07978是目的基因OsRLR1。3.OsRLR1基因的蛋白结构分析OsRLR1编码一个CC-NBS-LRR（CNL）抗病蛋白,多重序列比对与系统进化树分析表明OsRLR1编码蛋白与其他CNL蛋白很好的聚类在一起,与拟南芥抗病蛋白AtRPM1和玉米ZmRPM1同源,并与水稻的一个稻瘟病抗性蛋白OsPid3高度一致。对OsRLR1蛋白序列分析表明突变位点位于NB结构域,临近一个相对保守的RNBS-B/Se模体。参照蛋白ZAR1的三维建模表明:在OsRLR1（E318V）中,突变导致了其三维空间结构与结合ATP时的活化状态极为相似,暗示突变可能会导致结合的ATP不能水解或影响ADP结合而持续处于活化状态。同时,OsRLR1蛋白在酵母中能够通过CC结构域形成聚合体。OsRLR1和OsRLR1（E318V）蛋白均定位于细胞核。OsRLR1是一个典型的CNL抗病蛋白。4.OsRLR1基因的表达分析在水稻生长发育的苗期、分蘖期和抽穗期,对各个组织定量分析表明:基因OsRLR1主要在叶片中表达。OsRLR1的启动子表达GUS基因染色表明:GUS蛋白主要在叶片维管束中表达。在突变体中,OsRLR1基因的表达水平与叶片过敏反应程度正相关。稻瘟病和白叶枯病接种后,OsRLR1基因的表达上调。因此,OsRLR1在叶片维管束中组成性表达,但也受阳光和病菌的诱导。5.OsRLR1基因的过表达功能分析在野生型J10中,利用Ubiquitin强启动子过量表达OsRLR1基因。与野生型相比,转基因纯合植株对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病性显着增强,抗病相关基因OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也上升,但其抗病性仍然没有达到突变体rlr1的水平。不过,过量表达OsRLR1植株中没有出现类似病变的表型,同时对株高、结实率等农艺性状也没有影响,因而该基因在育种上具有潜在的应用价值。6.OsRLR1的互作蛋白筛选与验证通过酵母双杂交（Y2H）系统,利用OsRLR1的CC端结构域,筛选到了OsRLR1的互作转录因子OsWRKY19。并利用OsRLR1和OsRLR1（E318V）的CC-NB、CC-NB-ARC和全长蛋白序列在酵母中对互作关系进行了验证,进一步利用双分子荧光互补实验（BiFC）对OsWRKY19与OsRLR1的相互作用在植物体内进行验证分析。在烟草叶片细胞中,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生相互作用而发出黄色荧光信号,并与核指示剂DAPI指示信号高度吻合。因此,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生蛋白质的相互作用。7.互作蛋白OsWRKY19的干涉分析在突变体rlr1中,利用干涉技术（RNAi）沉默基因OsWRKY19的表达,获得了纯合的T2代干涉植株,OsWRKY19的表达量在不同的转基因株系中均得到了不同程度的降低,与突变体rlr1相比,干涉植株黄化和过敏反应的类病变表型得到了很大程度的减轻,植株长势和相关农艺性状也得到了很大程度的恢复。干涉植株接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后,OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也得到了很大程度的降低,对稻瘟病和白叶枯病的抗病性减弱。因此推测OsWRKY19正向调控了OsRLR1介导的抗性反应。8.转录因子OsWRKY19的转录分析在水稻原生质体中瞬时表达融合蛋白OsWRKY19-GAL,并测量LUC的活性发现OsWRKY19具有转录激活活性。进一步瞬时共表达OsWRKY19和OsPR10的1000bp的启动子发现OsWRKY19能够激活OsPR10的表达。而在烟草中,瞬时共表达实验表明OsRLR1和OsRLR1（E318V）均对OsWRKY19的转录具有增强作用,且OsRLR1（E318V）的增强效果远高于OsRLR1。
梅琼[7]（2019）在《高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究》文中认为水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的一种毁灭性病害,可造成水稻大量减产。抗病品种的利用是一种经济且对环境友好的防治手段,但是其前提是需要不断挖掘新的抗白叶枯病基因资源并明确抗病基因功能。本研究利用前期诱变获得的广谱高抗白叶枯病的水稻类病变突变体hpil3开展了抗病目标基因定位、克隆,蛋白组学,目标基因的互作基因筛选等相关研究,同时对疣粒野生稻中RCA在抗白叶枯病中的作用机理进行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通过基于重测序的图位克隆策略成功定位并克隆了该突变体的目标基因。该基因定位在4号染色体的20-22Mb区域内,进一步筛选得到7个候选的基因。通过对突变位点的验证和生物信息学分析最终确定了一个可能性较大的候选基因。转基因功能互补验证结果表明,该野生型基因成功使hpil3的表型恢复为野生型并丧失了对白叶枯病的抗性,从而确证了该候选基因就是hpil3的目标基因。通过实时荧光定量PCR发现hpil3中病程相关基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表达量显着高于其野生型大粒香（DLX）,而PR9略高于DLX;未接病菌的hpil3体内的HPIL3表达量显着高于野生型,这可能是由于基因突变导致的功能丧失从而使植株提高了该基因的表达量;突变体中HPIL3的表达量受白叶枯病菌诱导表达,且接菌后该基因表达量迅速升高,分析认为该基因与水稻抗白叶枯病具有相关性。对hpil3和DLX不同叶位进行荧光差异双向凝胶电泳结合质谱分析鉴定了291个差异表达倍数≥1.5倍且t-test≤0.05的蛋白,其中74个蛋白上调,217个蛋白下调。这些蛋白功能涉及氨基酸/蛋白代谢和修饰、光合作用、核苷酸代谢、防御相关、能量代谢、糖代谢、氧化还原等。进一步的数据分析显示hpil3多种主要的代谢途径如光合作用、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、卡尔文循环相关酶的表达量大多跟hpil3类病变表型发生程度呈负相关。一些抗病相关蛋白如PR10、14-3-3蛋白上调,而负调控细胞凋亡的AAA-type ATP酶下调,同时抗氧化的酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）上调,这些结果表明hpil3植株体内产生了抗性反应,与此同时各种相关代谢途径也受到影响,为了保持细胞稳态,ROS清除系统也在发挥积极的作用。采用酵母双杂交筛选到四个hpil3目标基因的互作基因。这些互作基因经过了基因全长的酵母双杂验证。其中质体蓝素和光系统Ⅱ的23kDa多肽是叶绿体蛋白。另外两个蛋白其中一个是包含C末端结构域的YL1核蛋白和一个胁迫应答蛋白。推测hpil3目标基因的突变导致编码蛋白不能与相关蛋白互作从而介导了下游抗病信号途径的激活。接种Xoo的疣粒野生稻产生的大量H2O2可诱导叶片内RCA与类囊体膜的结合。本研究发现接种Xoo会诱导疣粒野生稻发生H2O2的迸发,且氧化迸发的时间段和RCA从叶绿体基质向类囊体膜转移的时间段高度吻合,这暗示了二者存在某种关系。H2DCFDA染色试验发现生成的H2O2积累在叶片的叶绿体。进一步体外实验表明H2O2可诱导疣粒野生稻RCA的转移,且这种转移是疣粒野生稻特异的,混合疣粒野生稻和栽培稻大粒香得叶绿体组分不会发生这种转移。综上所述,本文利用基于二代基因组测序的图位克隆策略,克隆了并通过转基因功能互补确证了hpil3的目标基因,结果表明HPIL3的突变和功能缺失导致了水稻叶片类病变表型,既HPIL3负调控水稻叶片细胞程序性死亡和类病变表型;实时荧光定量PCR研究结果表明hpil3叶片多个抗病相关基因显着上调;蛋白质组学的研究表明HPIL3通过多种途径参与调节水稻类病变的形成;进一步通过酵母双杂交筛选获得了HPIL3的4个候选互作基因;疣粒野生稻可能通过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco activase,RCA）与类囊体膜的结合从而避免其受到激增的H2O2伤害,说明RCA除了我们通常所知的调节光合作用外也可能在疣粒野生稻抗Xoo中发挥作用。本研究为水稻抗白叶枯病机制的深入研究以及水稻抗病育种提供了重要的基因资源和前期理论基础。
高志强[8]（2019）在《OsCUL3a介导的水稻细胞死亡和广谱抗病性研究》文中研究表明揭示水稻抗病与生长的协调机制,培育具有广谱抗病性的水稻品种对于水稻的稳产和增产具有重要现实意义。本研究主要利用蛋白质组学与基因编辑等技术,从表型、生理生化、亚细胞结构、代谢途径、蛋白互作等不同层面,对OsCUL3a协调抗病与生长,特别是与重要免疫相关基因OsNPR1/2/3在控制细胞死亡方面的关系进行研究。本文主要研究结果如下:1.利用体视显微镜观察发现oscul3a突变体类病斑的形成可能由叶片局部组织区域的H2O2积累和细胞死亡产生,然后逐渐扩展到整片叶片;不同时期水稻叶片DAB染色发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体叶片在50 DPS开始H2O2积累,在60 DPS时H2O2积累表型非常明显。这种动态的生理变化,使oscul3a突变体对稻瘟病和白叶枯病具有广谱抗病性,使其在生长后期的抗病性会显着提高。2.相比野生型ZH11和转基因互补材料p1300-OsCUL3a-1和p1300-OsCUL3a-2,oscul3a突变体的生长速率在35 DPS-55 DPS阶段相对较慢,与oscul3a突变体H2O2的动态积累和细胞死亡表型出现阶段的细胞生理条件变化有关,最后导致oscul3a突变体的株高显着降低,这主要反应在显着变短的穗长和水稻茎秆倒数第一节间长度。3.透射电镜观察发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体在70 DPS生长期的叶片细胞胞质中有大量脂质体积累,在叶绿体中有大量嗜锇颗粒积累,脂质体和嗜锇颗粒的积累与脂类代谢有关;oscul3a突变体的稻米千粒重降低,其稻米的粗脂肪含量显着升高,总淀粉和总蛋白含量略有降低;随后稻米扫描电镜观察发现oscul3a突变体的淀粉颗粒结构变小,大小不一。4.利用串联质谱标记（Tandem Mass Tag,TMT）的蛋白质组检测技术,在oscul3a突变体叶片类病斑表型出现前和出现后分别检测到4623和4572个蛋白信息。相比野生型ZH11,在oscul3a突变体叶片中分别含有263和947个差异表达蛋白,其主要定位在叶绿体和胞质中,主要参与细胞内代谢过程,使oscul3a突变体的脂类次生代谢途径增强,而碳氮代谢途径减弱;并发现苯丙烷类（phenylpropanoid）代谢途径中具有抗病功能的水杨酸（salicylic acid,SA）含量在oscul3a突变体叶片中显着升高;并首次鉴定发现该代谢途径另一种次生代谢产物香豆素具有稻瘟病菌生长抑制活性,可诱导水稻愈伤ROS产生。STRING分析发现OsCUL3a与鉴定到的分子开关蛋白间会形成一个具有核心互作区的复杂调控网络,并通过平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring,PRM）靶向蛋白检测技术,验证了其中在水稻叶片类病斑表型出现前后高表达的蛋白CM-LOX1和CM-LOX2,其属于脂氧合酶类蛋白,是参与脂质过氧化造成铁诱导的细胞死亡（ferroptosis）的重要酶类。5.利用CRISPR-Cas9技术,获得在野生型ZH11背景下定向敲除了OsCUL3a的转基因植株,其具有类病斑表型;随后的酵母双杂交实验证明OsNPR2、OsNPR3与OsNPR1间存在相互作用;而在oscul3a突变背景下分别敲除OsNPR2和OsNPR3,敲除成功的oscul3a/osnpr2双突叶片类病斑较少,但敲除成功的oscul3a/osnpr3双突叶片具有非常严重的细胞死亡和类病斑表型;结合前期已有的OsNPR1敲除可以消除oscul3a突变体叶片类病斑表型,从而发现OsNPR1/2和OsNPR3在oscul3a突变背景下具有相反的细胞死亡与类病斑表型控制机制。
陈征[9]（2019）在《水稻斑点叶突变体spl24基因克隆与功能验证》文中提出水稻斑点叶突变体spl24是利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）诱变水稻品种IR64所得来的一个褐色斑点的新型抗病的突变体,属于类病斑突变体,研究学者通常用该类突变体来研究植物PCD（Programmed cell death,PCD）以及植物的抗逆性。对spl24斑点叶突变体的研究包括表型特征、生理生化指标、抗病性、遗传特性、目的基因的克隆和功能分析、生物信息学分析、转录组测序等,通过这一系列的测定和分析了解斑点叶突变体的斑点发生机制以及其突变体的抗病机制,为斑点叶的突变体的研究提供理论参考,主要的研究包括以下几个方面:1、斑点叶突变体spl24表型:spl24斑点叶突变体在大田的自然条件下出现斑点的时间为抽穗初期,斑点是从叶尖部位开始出现逐渐蔓延,斑点较小形状圆或者椭圆均匀分布在整张叶片,从斑点出现开始叶子一直有斑点生长,到抽穗后期和灌浆期整个植株的所有叶片均成为褐色。在植株成熟以后进行田间农艺性状考察,spl24与野生型IR64相比,结实率和千粒重等上均存在极显着的降低,而spl24突变体在有效分蘖数、穗长、每穗实粒数和产量等性状也存在着降低的情况。2、斑点叶突变体spl24生理生化:在分蘖期,斑点未出现,所以在分蘖期只有叶绿素a含量显着降低,在抽穗时期,spl24叶片出现斑点后类胡萝卜素和叶绿素a、b含量极显着降低,叶绿素a/叶绿素b的比值没有变化。与野生型IR64相比,DAB染色后褐色沉积,过氧化氢含量显着升高以及CAT酶活性显着下降,这些结果均显示spl24叶片存在过氧化氢的沉积。而突变体spl24叶片清除活性氧的酶系统中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性显着高于野生型。此外,spl24突变体叶片中丙二醛（MDA）的含量升高、TUNEL实验检测到断裂DNA、可溶性蛋白含量显着下降和死亡相关基因的表达上调结果证明了spl24叶片中存在细胞死亡情况。遮光实验表明突变体spl24斑点的产生受到光照的诱导,在突变体spl24和野生型IR64中,光合作用指标的参数也存在显着差异。3、斑点叶突变体spl24的抗病性:白叶枯接种实验结果表明spl24的抗性与IR64相比普遍增强。相关防卫反应基因的qRT-PCR实验证明OsPR1a、OsPR1b、OsPR3、OsPR4、OsPAL3、OsPAL6、OsCHS1、OsAOS2、OsJAZ6、OsWRKY45等基因表达量显着增高,而基因OsJAR1两者表达水平相似。植物激素测定结果发现SA、JA和ABA含量显着升高,说明SA和JA通路以及相关抗病基因的表达水平提升可以增强spl24的抗病性。4、斑点叶性状由半显性基因控制:以spl24为母本,IR64为父本进行杂交,发现F1呈现与突变体spl24一样的斑点,但是斑点数量减少,自交得到F2群体呈现三种性状,类似于野生型的无斑植株,类似于F1斑点少的中间型植株和类似于突变体的有斑植株,说明斑点叶突变体spl24由半显性基因控制。在spl24/IR64的F2群体中卡方检验无斑植株、中间型植株和有斑植株的分离比符合1:2:1(χ20.05=0.78<χ20.05=3.84),符合1对基因遗传分离定律,三种表型可以说明控制斑点叶的性状是一个半显性核基因。5、叶片斑点表型的产生由碱基突变导致:基因定位结果显示该基因属于第11染色体,其中第6个开放阅读框的DNA序列上的第7695位碱基由T突变成A（T7695A）,该突变位于第五个外显子上,导致一个氨基酸的替换,由野生型中的亮氨酸（Leu）突变为异亮氨酸（Ile）,该基因为斑点叶突变体中未报道的基因。为验证该基因功能,转基因互补实验所得到的转基因植株出现更多的斑点;RNAi干涉日本晴愈伤组织得到的转基因植株叶片具有斑点,组织表达实验表明,OsSPL24是一个组成型表达的基因,GUS实验表明OsSPL24在各个组织中都有表达,但是在颖壳和成熟的种子表达极少。6、OsSPL24基因分析编码细胞质受体蛋白激酶:OsSPL24基因分析结果显示OsSPL24基因包含7个外显子和6个内含子,CDS全长1791bp,编码596个氨基酸。OsSPL24编码几丁质受体蛋白激酶,具有两个LysM基序和一个蛋白激酶结构域。对水稻OsSPL24基因进行亚细胞定位发现,该基因定位在内质网,酵母双杂实验发现,OsSPL24可能与线粒体转录终止因子和钙调蛋白相互作用。综上,突变体spl24的斑点性状受一个半显性基因控制,该基因是一个从未被报道过的几丁质受体激酶,该基因的突变体使突变体的生理生化发生显着差异,也促使突变体对白叶枯多个小种产生较强的抗病性,所以对该基因的研究能够进一步了解水稻的抗病机理和抗病分子机制。
何利娟[10]（2019）在《水稻OsWRKY28基因表达调控途径分析及其抗白叶枯病机理的探索》文中认为水稻白叶枯病（Bacterial blight,BB）曾被列为水稻的三大病害之一,由黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）引起,发病严重时对水稻的品质及产量均危害严重。结合水稻的抗病机制研究,运用水稻育种新技术来培育抗性品种,是防治水稻白叶枯病等病害的最有效的办法。本研究一方面筛选负调控水稻抗性的相关基因,借助CRISPR/Cas9基因编辑技术,在性状优良的水稻品种中进行基因敲除,从而获得类似于自发突变的新型材料;另一方面延续实验室前期的研究,结合转录组数据,对OsWRKY28基因在水稻抗白叶枯病以及褐飞虱中的功能研究进行初步分析。研究的主要内容包括以下几点:1.运用适用于多靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,构建了靶向OsPi21和OsBON1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,经农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得了水稻日本晴转基因植株,检测并得到了相关转基因突变材料。在验证多靶点基因编辑载体的同时,也为应用基础研究和育种研究拓展了材料。2.对OsWRKY28基因进行启动子元件分析,在Plant CARE网站上分析后发现,其含有多个响应激素如MeJA、ABA、GA和IAA等的元件,其中响应MeJA的元件有4个。除此之外,还有响应生物胁迫的TC重复区域,响应非生物胁迫的低温应答元件以及类黄酮合成调控元件等。3.定量PCR结果显示:OsWRKY28基因的表达受MeJA、GA和IAA诱导。OsWRKY28基因由于能够感受这些激素的变化,且表达受到这些激素的调控,因此推测其可能参与MeJA等介导的抗性信号通路。4.转录组结果显示:OsWRKY28过表达植株与野生型植株相比有1287个基因出现2倍以上差异表达,其中有807个上调,480个下调。OsWRKY28-Cas9转基因植株中有2293个基因差异表达,包括1594个上调表达基因和699个下调表达基因。这些基因中包括抗病虫相关调控基因NPRs和OsLecRKs,激素合成相关关键基因OsICS、OsLOXs、OsEILs等以及转录因子家族基因如OsWRKYs、OsbZIPs、OsNACs等。这些基因的差异表达预示着OsWRKY28可能参与激素介导的抗病虫害信号调控通路。5.对Dongjing（Oryza sativa Japonica cv.Dongjin,DJ）为背景的T-DNA插入纯合突变体水稻植株进行接菌实验,结果显示:普通的DJ水稻在接菌14天后的平均病斑长于T-DNA插入突变体水稻株系。对普通的日本晴水稻和以日本晴为背景的OsWRKY28转基因过表达材料以及CRISPR/Cas9基因敲除转基因材料进行白叶枯菌接菌实验,14天后进行病斑统计,统计结果为:OsWRKY28超表达材料病斑长度略高于日本晴,而敲除后的OsWRKY28材料病斑长度略低于超表达材料。两种材料的接菌抗性鉴定结果相一致,由此证推测OsWRKY28转录因子在水稻对白叶枯病的抗性中其负调控作用。6.通过对DJ和DJ为背景的T-DNA插入突变体进行褐飞虱抗性鉴定。初步结果表明:在对14天苗龄的DJ（对照组）和OsWRKY28的T-DNA插入突变体（实验组）进行接虫试验,OsWRKY28的T-DNA插入突变体材料叶片出现叶片萎蔫,整个株型较弱的表型,推测其对褐飞虱的抗性略弱于野生型DJ材料。
二、水稻体细胞突变体HX-3在细胞水平上对白叶枯病的抗性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水稻体细胞突变体HX-3在细胞水平上对白叶枯病的抗性（论文提纲范文）
（1）水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物类病斑突变体的发生方式 |
| 1.2 植物类病斑突变体的特征与分类 |
| 1.3 植物类病斑突变体的发生机制 |
| 1.4 植物类病斑基因参与的防御信号通路 |
| 1.4.1 活性氧信号通路 |
| 1.4.2 水杨酸信号通路 |
| 1.4.3 茉莉酸和乙烯信号通路 |
| 1.4.4 脱落酸信号通路 |
| 1.4.5 R基因信号通路 |
| 1.4.6 一氧化氮信号通路 |
| 1.5 水稻类病斑突变体基因的克隆 |
| 第二章 水稻类病斑基因LML11 的图位克隆与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 生化试剂与仪器 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 突变体的农艺性状调查 |
| 2.3.2 叶绿素含量测定 |
| 2.3.3 光合速率的测定 |
| 2.3.4 生理生化实验分析 |
| 2.3.5 H_2O_2、CAT和 MDA的测定 |
| 2.3.6 遮光和黑暗处理实验 |
| 2.3.7 叶绿体透射电镜观察及种子胚乳扫描电镜观察 |
| 2.3.8 蛋白提取和Western blot分析 |
| 2.3.9 灌浆速率调查 |
| 2.3.10 稻米品质测定 |
| 2.3.11 GA处理种子发芽分析 |
| 2.3.12 LML11 的图位克隆 |
| 2.3.13 植物总RNA的提取、反转录和qRT-PCR反应 |
| 2.3.14 主要载体的构建 |
| 2.3.15 水稻的遗传转化 |
| 2.3.16 水稻原生质体的提取和转化 |
| 2.3.17 白叶枯病抗性鉴定 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 lml11 突变体的表型分析与农艺性状 |
| 2.4.2 lml11 突变体的叶绿素含量与叶绿体结构分析 |
| 2.4.3 lml11 突变体光合速率的测定 |
| 2.4.4 lml11 突变体的活性氧积累分析 |
| 2.4.5 lml11 突变体的PCD分析 |
| 2.4.6 lml11 突变体的遮光处理与离体黑暗处理分析 |
| 2.4.7 lml11 突变体的灌浆速率调查与拷种分析 |
| 2.4.8 lml11 突变体的稻米品质分析 |
| 2.4.9 lml11 突变体的种子GA处理分析 |
| 2.4.10 lml11 突变体的遗传分析与LML11 的图位克隆 |
| 2.4.11 LML11 的转基因验证 |
| 2.4.12 LML11 的生物信息学分析 |
| 2.4.13 LML11 的基因表达分析 |
| 2.4.14 LML11 的亚细胞定位分析 |
| 2.4.15 lml11 突变体的抗病性分析与病程相关基因的表达 |
| 2.4.16 lml11 突变体的转录组测序分析 |
| 2.5 结论与讨论 |
| 2.5.1 类病斑的产生影响了lml11 突变体的农艺性状 |
| 2.5.2 类病斑的产生影响了lml11 突变体的生理生化特征 |
| 2.5.3 lml11 突变体的类病斑表型是黑暗诱导的 |
| 2.5.4 类病斑的产生影响了lml11 突变体的灌浆速率和稻米品质 |
| 2.5.5 LML11 基因的突变影响了种子的发芽 |
| 2.5.6 LML11 蛋白属于GRDP家族蛋白 |
| 2.5.7 LML11 属于组成型表达基因 |
| 2.5.8 lml11 突变体对白叶枯病菌的抗性增强 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）OsWRKY28转录因子在水稻抗病信号转导中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Xoo对水稻的侵染过程 |
| 1.2 水稻抵御Xoo侵染的免疫防御反应 |
| 1.2.1 PTI反应 |
| 1.2.2 ETI反应 |
| 1.3 WRKY转录因子在水稻中的研究进展 |
| 1.3.1 WRKY转录因子的结构特征和分类 |
| 1.3.2 WRKY转录因子在水稻响应非生物胁迫应答中的作用 |
| 1.3.3 WRKY转录因子在水稻响应生物胁迫应答中的作用 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 抗病材料Y73的转录组的时空表达分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 抗(Y73)感(DLX)材料的抗病性分析 |
| 2.3.2 抗(Y73)感(DLX)材料的转录组分析 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 OsWRKY28在水稻抗白叶枯病的防御反应中的作用 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 OsWRKY28的表达模式分析 |
| 3.2.2 OsWRKY28的亚细胞定位分析 |
| 3.2.3 OsWRKY28相关遗传材料的鉴定与抗病性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 OsWRKY28的表达模式分析 |
| 3.3.2 OsWRKY28的亚细胞定位 |
| 3.3.3 OsWRKY28相关遗传材料的鉴定与抗病性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交技术筛选OsWRKY28的互作蛋白 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 诱饵载体的构建 |
| 4.2.2 酵母感受态的制备和自激活验证 |
| 4.2.3 Mating法筛库 |
| 4.2.4 酵母双杂验证 |
| 4.2.5 BiFC法验证互作 |
| 4.2.6 OsWIP1的生物学功能分析 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 诱饵载体构建 |
| 4.3.2 自激活验证 |
| 4.3.3 利用酵母双杂(Y2H)建库筛选与OsWRKY28互作的蛋白 |
| 4.3.4 酵母双杂验证互作 |
| 4.3.5 BiFC验证互作 |
| 4.3.6 OsWIP1的生物学功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 OsWRKY28的基因编辑材料的蛋白水平检测 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 原核表达载体的构建 |
| 5.2.2 融合蛋白诱导表达 |
| 5.2.3 包涵体蛋白的纯化 |
| 5.2.4 SDS-PAGE和Western Blot |
| 5.2.5 蛋白浓度的测定 |
| 5.2.6 利用制备的抗体检测基因编辑材料中的蛋白表达水平 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 融合蛋白的诱导表达与优化 |
| 5.3.2 融合蛋白OsWRKY28-His的纯化 |
| 5.3.3 利用制备的抗体检测基因编辑材料中的蛋白表达水平 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新之处 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（3）水稻抗白叶枯病主效基因Xa14的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 水稻白叶枯病 |
| 1.2 植物的先天免疫系统 |
| 1.2.1 PTI |
| 1.2.2 ETI |
| 1.2.3 PTI和ETI的关系 |
| 1.3 水稻抗白叶枯病主效基因的研究进展 |
| 1.4 NLRs抗病基因的结构与功能 |
| 1.5 NLRs抗病基因的进化 |
| 1.6 水稻抗病等位基因的研究 |
| 1.7 稻属的组成和进化 |
| 1.8 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 水稻材料和主要菌株 |
| 2.2 病原菌的培养、接种、调查及分析 |
| 2.2.1 病原菌的培养、接种及调查 |
| 2.2.2 细菌生长曲线分析 |
| 2.3 载体构建 |
| 2.3.1 功能互补遗传载体的构建 |
| 2.3.2 酵母双杂交载体的构建 |
| 2.3.3 双分子荧光互补载体的构建 |
| 2.3.4 免疫共沉淀载体的构建 |
| 2.4 核酸操作及基因分析 |
| 2.4.1 DNA抽提及SSR分析 |
| 2.4.2 高质量DNA抽提及Southern杂交分析 |
| 2.4.3 水稻叶片总RNA抽提 |
| 2.4.4 RNA反转录和基因表达检测 |
| 2.5 蛋白质互作分析 |
| 2.5.1 酵母双杂交实验 |
| 2.5.2 BiFC实验 |
| 2.5.3 Western blot实验 |
| 2.5.4 免疫共沉淀实验 |
| 2.6 RGAF同源蛋白的进化分析 |
| 2.7 水稻种质资源中等位基因分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Xa14的克隆与功能分析 |
| 3.1.1 Xa14的精细定位 |
| 3.1.2 Xa14候选基因的鉴定 |
| 3.1.3 候选基因RGAf-BB14 的功能验证 |
| 3.1.4 转基因植株的共分离分析 |
| 3.1.5 Xa14抑制白叶枯病菌的生长繁殖 |
| 3.1.6 Xa14基因不受病原菌诱导表达 |
| 3.1.7 Xa14基因的拷贝数分析 |
| 3.2 Xa1-2的克隆与功能分析 |
| 3.2.1 候选基因的序列分析 |
| 3.2.2 RGAf-BB2基因增强水稻对白叶枯病菌的抗性 |
| 3.2.3 Xa1的功能验证 |
| 3.2.4 Xa1、Xa1-2和Xa14基因的抗谱比较 |
| 3.3 Xa1、Xa1-2和Xa14基因的遗传关系 |
| 3.3.1 Xa1减弱Xa14介导的抗病功能 |
| 3.3.2 Xa1不影响Xa14的表达量 |
| 3.3.3 Xa1-2也减弱Xa14介导的抗病功能 |
| 3.4 XA1、XA1-2和XA14蛋白的功能分析 |
| 3.4.1 XA1、XA1-2和XA14蛋白的序列分析 |
| 3.4.2 XA1和XA14蛋白在酵母中的互作关系 |
| 3.4.3 Bi FC验证XA1-BED和XA14-BED蛋白互作 |
| 3.4.4 Co-IP验证XA1-BED和XA14-BED蛋白互作 |
| 3.5 XA1、XA1-2和XA14蛋白同源物的进化分析 |
| 3.6 Xa1、Xa1-2和Xa14基因的全球地理分布 |
| 3.7 Xa14抗病机制的探究 |
| 3.7.1 Os WRKY45在携带Xa14的植株中表达量显着上升 |
| 3.7.2 超量表达NahG基因会减弱Xa14的抗病功能 |
| 3.7.3 Xa1-2和Xa14的抗性受病原菌TALE的诱导 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Xa1、Xa1-2和Xa14的抗性不同的探讨 |
| 4.2 Xo1 可能是Xa1、Xa1-2和Xa14 的等位基因 |
| 4.3 Xa1、Xa1-2和Xa14发生互作影响水稻的抗病性 |
| 4.4 Xa14抗病机制的初探 |
| 4.4.1 OsWRKY45可能参与Xa14介导的抗病反应 |
| 4.4.2 SA可能介导Xa14基因的抗病功能 |
| 4.5 Xa1、Xa1-2和Xa14复等位基因在育种中的应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录I |
| 附录II 作者简介 |
| 致谢 |
（4）Cdr4介导水稻类病变及抗病性的分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 类病变突变体 |
| 1.1 类病变突变体的分类 |
| 1.2 类病变表型形成的因素 |
| 1.3 程序性细胞死亡 |
| 1.4 超敏反应 |
| 1.5 系统获得性抗性 |
| 2 水稻类病变突变体 |
| 2.1 水稻作为研究的模式植物 |
| 2.2 水稻类病变突变体研究进展 |
| 2.3 水稻类病变突变体抗病性研究 |
| 3 研究意义 |
| 第二章 水稻CDR4基因的确定和功能验证 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 植物材料及种植 |
| 1.2 水稻叶片RNA的提取 |
| 1.3 逆转录合成cDNA的第一条链 |
| 1.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 半定量RT-PCR |
| 1.6 CRISPR/Cas9 敲除载体的构建 |
| 1.7 过表达载体的构建 |
| 1.8 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 1.9 敲除突变体的鉴定 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 CDR4候选基因定量分析 |
| 2.2 CDR4基因敲除载体构建及突变体的获得 |
| 2.3 敲除突变株系的测序鉴定 |
| 2.4 敲除突变株系的表型分析 |
| 2.5 CDR4基因过表达载体构建及转基因株系的获得 |
| 3 讨论 |
| 第三章 CDR4互作蛋白的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料及取样 |
| 1.2 含水稻cDNA的酵母文库的构建 |
| 1.3 酵母双杂交表达载体的构建 |
| 1.4 质粒的酵母转化 |
| 1.5 PGBKT7-CDR4 载体的自激活及毒性检测 |
| 1.6 酵母双杂筛选与CDR4有互作的蛋白 |
| 1.7 酵母双杂验证 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 酵母文库的构建 |
| 2.2 PGBKT7-CDR4 载体自激活和毒性检测 |
| 2.3 酵母双杂筛选CDR4互作蛋白 |
| 2.4 CDR4和Os SPL1 蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 第四章 水稻CDR4基因调控下游基因的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料及取样 |
| 1.2 水稻叶片RNA提取 |
| 1.3 RNA-Seq分析 |
| 1.4 差异表达基因的筛选和功能分析 |
| 1.5 白叶枯病菌的培养 |
| 1.6 白叶枯病菌的侵染 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 Cdr4和WT植株的转录组分析 |
| 2.2 表达差异基因生物信息学分析 |
| 2.3 抗病相关差异基因定量分析 |
| 2.4 白叶枯病抗病性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机理初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻白叶枯病概述 |
| 2 水稻白叶枯病抗性基因研究进展 |
| 2.1 水稻抗白叶枯病主效基因研究进展 |
| 2.1.1 NBS-LRR类 |
| 2.1.2 LRR-RLK类 |
| 2.1.3 细胞壁相关激酶类 |
| 2.1.4 隐性基因类 |
| 2.1.5 Executor R基因类 |
| 2.2 水稻感白叶枯病主效基因研究进展 |
| 2.2.1 OsSWEET11和OsSWEET13 |
| 2.2.2 OsSWEET14 |
| 2.2.3 OsSWEET12和OsSWEET15 |
| 2.3 水稻抗白叶枯病微效基因研究进展 |
| 2.3.1 WRKY转录因子类 |
| 2.3.2 MAPK基因家族 |
| 2.3.3 免疫反应相关类 |
| 2.3.4 miRNA |
| 3 水稻感白叶枯病机理研究 |
| 4 水稻抗白叶枯病资源挖掘策略 |
| 5 鉴定互作蛋白对抗病机理研究的作用 |
| 6 研究意义及技术路线 |
| 6.1 研究目的及意义 |
| 6.2 技术路线 |
| 第二章 OsHIN1的器官表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂与菌株 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 pOsHIN1::GUS载体的构建 |
| 3.1.1 引物的设计 |
| 3.1.2 目的片段的扩增 |
| 3.1.3 载体的酶切 |
| 3.1.4 目的片段及载体回收 |
| 3.1.5 连接与转化 |
| 3.1.6 载体的验证与保存 |
| 3.2 农杆菌EHA105的转化 |
| 3.2.1 农杆菌EHA105感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 表达载体农杆菌转化 |
| 3.2.3 转化农杆菌的鉴定及菌液保存 |
| 3.3 水稻遗传转化 |
| 3.3.1 水稻愈伤组织的诱导 |
| 3.3.2 愈伤组织的继代 |
| 3.3.3 农杆菌培养 |
| 3.3.4 愈伤组织的侵染和共培养 |
| 3.3.5 脱菌和筛选 |
| 3.3.6 分化 |
| 3.3.7 生根及炼苗 |
| 3.4 pOsHIN1::GUS转基因苗的验证 |
| 3.4.1 基因组DNA的提取 |
| 3.4.2 PCR验证 |
| 3.5 GUS染色 |
| 3.5.1 水稻白叶枯菌P6的培养 |
| 3.5.2 水稻白叶枯菌的接种 |
| 3.5.3 GUS染色 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 pOsHIN1::GUS的载体构建 |
| 4.2 pOsHIN1::GUS遗传转化 |
| 4.3 GUS染色 |
| 5 讨论 |
| 第三章 OsHIN1的亚细胞定位 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 高纯度质粒提取 |
| 3.2 水稻原生质体的制备及转化 |
| 4 结果分析 |
| 5 讨论 |
| 第四章 OsHIN1互作蛋白的筛选 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂和菌株 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 35S::eGFP(ATG)和35S::OsHIN1:eGFP载体的构建 |
| 3.1.1 引物的设计 |
| 3.1.2 目的片段的扩增 |
| 3.1.3 载体的酶切 |
| 3.1.4 目的片段及载体回收 |
| 3.1.5 连接与转化 |
| 3.1.6 载体的验证与保存 |
| 3.2 农杆菌EHα105的转化 |
| 3.3 水稻遗传转化 |
| 3.4 35S::eGFP和35S::OsHIN1:eGFP转基因苗的验证 |
| 3.5 酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选 |
| 3.5.1 水稻幼苗的培养 |
| 3.5.2 水稻白叶枯菌P6的培养 |
| 3.5.3 水稻白叶枯菌P6的接种 |
| 3.5.4 样品的取送 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 载体构建结果 |
| 4.2 遗传转化结果 |
| 4.3 酵母筛库结果 |
| 5 讨论 |
| 第五章 OsHIN1互作蛋白的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 试剂与菌株 |
| 2.2 材料与载体 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 片段式酵母点对点验证 |
| 3.2 互作蛋白各基因CDS序列的克隆 |
| 3.2.1 水稻总RNA的提取 |
| 3.2.2 cDNA一链的合成 |
| 3.2.3 基因序列的克隆 |
| 3.3 双分子荧光互补载体构建 |
| 3.4 酵母双杂交载体构建 |
| 3.5 双分子荧光互补验证 |
| 3.5.1 BiFC载体转化农杆菌GV3101 |
| 3.5.2 烟草注射 |
| 3.6 酵母双杂交(全长)验证 |
| 3.6.1 载体的自激活验证 |
| 3.6.2 酵母双杂交(全长)一对一验证 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 片段式酵母点对点验证 |
| 4.2 互作蛋白基因CDS序列克隆 |
| 4.3 双分子荧光互补载体构建 |
| 4.4 酵母双杂交载体构建 |
| 4.5 双分子荧光互补验证 |
| 4.6 酵母双杂交验证 |
| 4.6.1 载体的自激活验证 |
| 4.6.2 酵母双杂交(全长)一对一验证 |
| 5 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物体的防御反应机制 |
| 1.1.1 基础免疫 |
| 1.1.2 特异性免疫反应 |
| 1.1.3 WRKY转录因子概述 |
| 1.1.4 植物激素介导的抗病反应 |
| 1.1.5 系统获得性免疫反应SAR |
| 1.1.6 小RNAs在抗病反应中的作用 |
| 1.2 水稻抗病机制研究 |
| 1.2.1 抗病基因介导稻瘟病抗病机制研究 |
| 1.2.2 R基因介导白叶枯病研究进展 |
| 第二章 OSRLR1的克隆与功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要培养基配方 |
| 2.2.4 主要生化试剂的配方 |
| 2.2.5 主要生化、分子生物学试剂与仪器 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 农艺性状调查 |
| 2.3.2 光和色素的测定 |
| 2.3.3 衰老相关指标的测定 |
| 2.3.4 组织化学分析 |
| 2.3.5 图位克隆 |
| 2.3.6 质粒的提取 |
| 2.3.7 候选基因的克隆 |
| 2.3.8 载体的设计与构建 |
| 2.3.9 基因RT-PCR表达分析 |
| 2.3.10 生物信息学分析 |
| 2.3.11 水稻原生质体瞬时表达 |
| 2.3.12 烟草叶片瞬时表达体系 |
| 2.3.13 酵母双杂交实验 |
| 2.3.14 双分子荧光互补实验 |
| 2.3.15 稻瘟病的培养与接种 |
| 2.3.16 白叶枯病的培养与接种 |
| 2.3.17 纹枯病接种实验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 rlr1的表型与组织化学分析 |
| 2.4.2 突变体rlr1中病程相关基因表达情况 |
| 2.4.3 OsRLR1候选基因的遗传图谱分析 |
| 2.4.4 OsRLR1基因功能互补验证 |
| 2.4.5 OsRLR1的生物信息学分析 |
| 2.4.6 OsRLR1基因的表达分析 |
| 2.4.7 OsRLR1 的亚细胞定位 |
| 2.4.8 OsRLR1的过表达分析 |
| 2.4.9 OsRLR1与OsWRKY19 相互作用 |
| 2.4.10 OsWRKY19 正调控OsRLR1 介导的抗病反应 |
| 2.4.11 OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 Rlr1是抗性反应自激活类病变突变体 |
| 2.5.2 OsRLR1 是一个典型的CLR抗病基因 |
| 2.5.3 OsRLR1 E318V自激活机制 |
| 2.5.4 OsRLR1正调控水稻抗性反应 |
| 2.5.5 OsRLR1与OsWRKY19 互作调控OsPR10 的表达 |
| 2.6 结论 |
| 1、OsRLR1 是一个典型的CC-NB-LRR抗病蛋白 |
| 2、E318V是一个新的自激活位点 |
| 3、OsWRKY19与OsRLR1 在细胞核中互作并正调控抗性反应 |
| 4、OsWRKY19 调控OsPR10 的表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 发表与待发表的论文 |
（7）高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 水稻抗白叶枯病研究进展 |
| 1.1 水稻白叶枯病 |
| 1.1.1 水稻白叶枯病概述 |
| 1.1.2 水稻抗白叶枯病基因的挖掘和功能研究 |
| 1.2 细胞程序性死亡和类病变突变体 |
| 1.2.1 细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 水稻类病变突变体及其在水稻抗病性中的研究 |
| 1.3 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性研究及利用 |
| 1.4 Rubisco活化酶的研究进展 |
| 1.5 病程相关蛋白 |
| 1.6 蛋白质组学及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.7 酵母双杂交及其在水稻抗病研究中的应用 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 hpil3 目标基因的定位、克隆和转基因功能互补验证 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 CTAB法大量提取水稻基因组DNA |
| 2.2.2 候选基因的克隆和表达载体的构建 |
| 2.2.3 转基因水稻植株的鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 hpil3 的表型及抗性鉴定 |
| 2.3.2 hpil3 目标基因的定位和候选目标基因的筛选 |
| 2.3.3 hpil3 候选目标基因的克隆和超表达载体的构建 |
| 2.3.4 hpil3 目标基因超表达植株的转化 |
| 2.3.5 hpil3 转基因植株的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HPIL3 和抗病相关基因的表达及蛋白组学分析 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 接种白叶枯病菌后不同时间目标基因的表达量变化 |
| 3.2.2 hpil3和DLX病程相关基因的表达 |
| 3.2.3 水稻叶片总蛋白的提取 |
| 3.2.4 总蛋白的裂解 |
| 3.2.5 总蛋白的纯化 |
| 3.2.6 总蛋白的定量 |
| 3.2.7 荧光标记 |
| 3.2.8 荧光差异双向凝胶电泳 |
| 3.2.9 凝胶扫描和图像分析 |
| 3.2.10 考马斯亮蓝凝胶制备 |
| 3.2.11 差异表达蛋白质谱鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 RT-qPCR分析HPIL3的表达 |
| 3.3.2 RT-qPCR分析病程相关蛋白表达 |
| 3.3.3 hpil3 的蛋白组学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HPIL3 的互作基因筛选 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 Trizol法提取样品RNA并检测 |
| 4.2.2 cDNA的 frist strand合成 |
| 4.2.3 LD-PCR合成ds-cDNA |
| 4.2.4 构建诱饵载体和猎物载体 |
| 4.2.5 试剂盒和碱法大量抽提质粒 |
| 4.2.6 酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.7 酵母自激活 |
| 4.2.8 ds cDNA和 Sma? 酶切后的PGADT7-Rec共转酵母感受态细胞 |
| 4.2.9 酵母质粒的提取 |
| 4.2.10 互作基因的酵母双杂验证 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 HPIL3 的克隆和筛库相关载体构建 |
| 4.3.2 酵母双杂交的建库 |
| 4.3.3 HPIL3 的自激活检测 |
| 4.3.4 酵母双杂筛库结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 疣粒野生稻对白叶枯病的抗性机制研究 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.2.2 叶绿体的提取和分离 |
| 5.2.3 SDS-PAGE和免疫分析 |
| 5.2.4 叶片提取物中H_2O_2 含量的测定 |
| 5.2.5 H_2O_2 的亚细胞定位 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 疣粒野生稻对Xoo的抗性鉴定 |
| 5.3.2 H_2O_2 含量测定、亚细胞定位及其对RCA的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）OsCUL3a介导的水稻细胞死亡和广谱抗病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物类病斑形成机制 |
| 1.1.1 光温反应与细胞器功能 |
| 1.1.2 激素水平与细胞代谢 |
| 1.2 泛素化修饰与细胞死亡和抗病性 |
| 1.2.1 植物泛素蛋白酶体途径及其生物学功能 |
| 1.2.2 CRL3类E3泛素连接酶的生物学功能 |
| 1.2.3 植物泛素化修饰与抗病性 |
| 1.3 蛋白质组学技术在类病斑形成机制中的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 oscul3a突变体的类病斑表型分析与抗病性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 农艺性状考察 |
| 2.1.2.2 叶片DAB染色 |
| 2.1.2.3 透射电镜观察 |
| 3.1.2.4 扫描电镜观察 |
| 3.1.2.5 稻米品质分析 |
| 2.1.2.6 稻瘟病接种鉴定 |
| 2.1.2.7 白叶枯病接种鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 oscul3a突变体类病斑表型与生长的关系 |
| 2.2.2 oscul3a突变体的稻米扫描电镜观察与品质分析 |
| 2.2.3 oscul3a突变体具有稻瘟病和白叶枯病抗性 |
| 2.2.4 oscul3a突变体的亚细胞观察 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 oscul3a突变体具有动态的ROS积累和细胞死亡 |
| 2.3.2 oscul3a突变体生长抑制与ROS积累和细胞死亡有关 |
| 2.3.3 oscul3a突变体抗病性的提高与ROS积累和细胞死亡有关 |
| 2.3.4 环境条件对oscul3a突变体类病斑形成的影响 |
| 2.3.5 不同ROS积累和细胞死亡程度对类病斑材料抗病性的影响 |
| 第三章 oscul3a突变体的蛋白质组学分析及其信号网络 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 化学试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 蛋白质组检测样品准备 |
| 3.1.2.2 TMT标记质谱检测 |
| 3.1.2.3 PRM靶向检测 |
| 3.1.2.4 差异表达蛋白功能分析 |
| 3.1.2.5 差异表达蛋白的网络分析 |
| 3.1.2.6 叶片DAB染色 |
| 3.1.2.7 叶片SA含量检测 |
| 3.1.2.8 香豆素的抗病性鉴定 |
| 3.1.2.9 香豆素处理水稻愈伤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 oscul3a突变体差异表达蛋白的功能分析 |
| 3.2.2 oscul3a突变体代谢途径的差异分析 |
| 3.2.3 OsCUL3a互作蛋白与分子开关分析 |
| 3.2.4 OsCUL3a靶标蛋白的定量分析 |
| 3.2.5 香豆素抑制水稻稻瘟病菌的生长 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 oscul3a突变体的类病斑表型与细胞代谢平衡 |
| 3.3.2 OsCUL3a与分子开关蛋白的互作联系 |
| 3.3.3 oscul3a突变体的类病斑与铁死亡(ferroptosis)机制 |
| 3.3.4 oscul3a突变体的类病斑与苯丙烷类(phenyloropanoid)代谢途径 |
| 第四章 OsNPR1/2/3在OsCUL3a介导水稻细胞死亡中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 叶片DAB染色 |
| 4.1.2.2 酵母双杂交验证 |
| 4.1.2.3 CRISPR-Cas9 载体构建 |
| 4.1.2.4 质粒的农杆菌转化 |
| 4.1.2.5 水稻的遗传转化 |
| 4.1.2.6 潮霉素抗性鉴定 |
| 4.1.2.7 敲除材料的测序鉴定 |
| 4.1.2.8 敲除基因的功能分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 OsCUL3a-KO敲除材料具有类病斑表型 |
| 4.2.2 ZH11、oscul3a、p1300-OsCUL3a-1/2和oscul3a/osnpr1 表型观察 |
| 4.2.3 oscul3a/osnpr2和oscul3a/osnpr3 的表型差异 |
| 4.2.4 水稻OsNPR1/2/3的功能分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 4.3.1 OsNPR1/2和OsNPR3 具有相反的细胞死亡作用机制 |
| 4.3.2 水稻OsNPR1/2/3 和拟南芥AtNPR1/3/4 的结构差异 |
| 4.3.3 OsCUL3a协调水稻生长、细胞死亡与抗病性的探讨 |
| 第五章 全文结论和创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）水稻斑点叶突变体spl24基因克隆与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 斑点叶突变体的来源和分类 |
| 1.2 斑点的表型特征 |
| 1.3 斑点叶突变体的抗性鉴别和生理生化指标 |
| 1.4 斑点叶突变体的细胞死亡分析 |
| 1.5 斑点叶突变体的发生机制 |
| 1.5.1 抗病基因突变或表达异常 |
| 1.5.2 蛋白酶活性下降或者功能丧失 |
| 1.5.3 转录因子功能异常 |
| 1.5.4 代谢途径失调 |
| 1.5.5 活性氧物质的积累 |
| 1.5.6 激素的失调 |
| 1.5.7 逆境胁迫 |
| 1.6 斑点叶突变体的遗传特性、基因克隆和功能分析 |
| 1.7 斑点叶突变体的研究意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 农艺性状和生理生化指标检测 |
| 2.1.1 突变体的农艺性状调查 |
| 2.1.2 突变体斑点的光照诱导观察 |
| 2.1.3 突变体光合作用指标检测 |
| 2.1.4 突变体光合色素含量测定 |
| 2.1.5 突变体可溶性蛋白含量测定 |
| 2.1.6 spl24 突变体酶活测定和相关指标检测 |
| 2.1.7 spl24 突变体程序性细胞死亡检测 |
| 2.1.8 spl24 突变体抗性鉴定 |
| 2.2 基因定位与候选基因克隆 |
| 2.2.1 斑点叶突变体spl24 的遗传分析 |
| 2.2.2 spl24 斑点叶基因的初定位 |
| 2.2.3 spl24 斑点叶基因的精细定位 |
| 2.2.4 候选基因的预测 |
| 2.3 水稻斑点叶基因OsSPL24 定位与克隆与功能分析 |
| 2.3.1 DNA和 RNA的提取 |
| 2.3.2 qRT-PCR实验 |
| 2.3.3 质粒的提取 |
| 2.3.4 互补质粒构建 |
| 2.3.5 RNAi质粒构建 |
| 2.3.6 GUS质粒构建 |
| 2.3.7 亚细胞质粒构建 |
| 2.3.8 酵母双杂质粒构建 |
| 2.3.9 土壤农杆菌EH105 电击转化实验方法 |
| 2.3.10 原生质体提取和质粒转化方法 |
| 2.3.11 GUS染色方法 |
| 2.3.12 酵母双杂实验方法 |
| 2.3.13 愈伤组织的诱导、杆菌转化和转基因植株再生 |
| 2.3.14 TUNEL实验方法 |
| 2.4 回交后代转录组测序分析 |
| 2.4.1 转录组测序实验材料 |
| 2.4.2 转录组测序 |
| 2.4.3 转录组数据分析 |
| 2.4.4 植物激素含量测定 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 突变体农艺性状和生理生化分析 |
| 3.1.1 突变体spl24 的表型特征 |
| 3.1.2 光对斑点叶突变体的影响分析 |
| 3.1.3 叶绿素含量和可溶性蛋白含量的分析 |
| 3.1.4 斑点叶突变体spl24的ROS异常 |
| 3.1.5 spl24 突变体程序性细胞死亡 |
| 3.1.6 斑点叶突变体spl24 的抗性增强 |
| 3.2 突变体spl24 遗传分析和基因定位 |
| 3.2.1 突变体spl24 的遗传分析 |
| 3.2.2 spl24 基因的定位 |
| 3.2.3 候选基因的预测与测序验证 |
| 3.3 OsSPL24 基因的克隆和功能验证 |
| 3.3.1 互补实验 |
| 3.3.2 RNAi实验 |
| 3.3.3 OsSPL24 基因组成型表达 |
| 3.3.4 OsSPL24 蛋白主要定位于内质网 |
| 3.3.5 OsSPL24 互作蛋白的筛选 |
| 3.3.6 OsSPL24 基因的生物信息学分析 |
| 3.4 突变体spl24 与结果与分析IR64 回交后代转录组分析 |
| 3.4.1 回交植株表型和测序结果 |
| 3.4.2 回交群体存在程序性细胞死亡 |
| 3.4.3 转录组测序质量评估 |
| 3.4.4 差异基因分析 |
| 3.4.5 GO富集 |
| 3.4.6 KEGG通路分析 |
| 3.4.7 参与抗病调控的DEGs |
| 3.4.8 转录组测序对OsSPL24 基因的表达量分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 斑点的产生影响了spl24 的农艺性状 |
| 4.2 斑点的产生影响了spl24 的生化生理特性 |
| 4.3 ROS活性氧清除系统平衡遭破坏 |
| 4.4 spl24 突变体中存在细胞程序性死亡 |
| 4.5 斑点叶突变体spl24 对白叶枯病菌抗性增强 |
| 4.6 OsSPL24 为一个新的斑点叶基因 |
| 4.7 OsSPL24 基因属于Lys M-RLKs基因家族 |
| 4.8 OsSPL24 蛋白定位于内质网并且该基因属于组成型表达 |
| 4.9 突变体spl24 互补和干涉具有斑点表型 |
| 4.10 OsSPL24 基因可能具有累积效应 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:本研究中所用引物 |
| 附录Ⅱ:本研究中所用的培养基 |
| 附录Ⅲ:在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）水稻OsWRKY28基因表达调控途径分析及其抗白叶枯病机理的探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻白叶枯病 |
| 1.2 褐飞虱的发生与危害 |
| 1.3 水稻抗病机制 |
| 1.4 WRKY转录调控因子 |
| 1.4.1 WRKY转录调控因子的生物学功能 |
| 1.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展 |
| 1.5.1 基因编辑技术简介 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9技术 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9技术在农业上的应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 CRISPR/Cas9材料的获取与初步分析 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 材料与菌株 |
| 2.1.2 载体与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌热激感受态细胞DH5α的制备 |
| 2.2.2 根癌农杆菌电击感受态细胞EHA105的制备 |
| 2.2.3 靶位点的选择与引物设计 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 2.2.5 农杆菌的转化及其介导的水稻日本晴和折粳70遗传转化 |
| 2.2.6 转基因水稻植株突变体检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 OsWRKY28转录因子的启动子元件分析及激素响应分析 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 OsWRKY28启动子序列分析 |
| 3.2.2 水稻总RNA的提取 |
| 3.2.3 cDNA的合成 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 OSWRKY28的启动子元件分析 |
| 3.3.2 OsWRKY28对不同激素的响应分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 OsWRKY28转基因材料的转录组分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RNA提取 |
| 4.2.2 功能注释和顺式调控元件分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 转录组分析 |
| 4.3.2 RT分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 OsWRKY28基因的白叶枯病抗性鉴定 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 材料与菌株 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 水稻接种 |
| 5.2.3 转基因植株抗病性分析 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 对IR24和Y73的接菌实验 |
| 5.3.2 对DJ为背景的T-DNA插入纯合突变体进行接菌实验 |
| 5.3.3 对Nip背景的过表达和敲除转基因材料进行接菌实验 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 OsWRKY28基因对褐飞虱的抗性研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 褐飞虱 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论与分析 |
| 第七章 总结 |
| 7.1 主要结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
四、水稻体细胞突变体HX-3在细胞水平上对白叶枯病的抗性（论文参考文献）
- [1]水稻类病斑基因LML11的图位克隆与功能分析[D]. 徐乾坤. 西南大学, 2021(01)
- [2]OsWRKY28转录因子在水稻抗病信号转导中的作用[D]. 徐如梦. 浙江师范大学, 2021(02)
- [3]水稻抗白叶枯病主效基因Xa14的克隆与功能分析[D]. 张标明. 华中农业大学, 2020(01)
- [4]Cdr4介导水稻类病变及抗病性的分子机理研究[D]. 宗超峰. 浙江师范大学, 2020(01)
- [5]OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机理初探[D]. 于玉凤. 浙江师范大学, 2020(01)
- [6]水稻CC-NB-LRR抗病基因OsRLR1的图位克隆与功能分析[D]. 杜丹. 西南大学, 2020
- [7]高抗水稻白叶枯病相关新基因的克隆及抗病机制研究[D]. 梅琼. 沈阳农业大学, 2019(08)
- [8]OsCUL3a介导的水稻细胞死亡和广谱抗病性研究[D]. 高志强. 中国农业科学院, 2019(01)
- [9]水稻斑点叶突变体spl24基因克隆与功能验证[D]. 陈征. 华中农业大学, 2019(01)
- [10]水稻OsWRKY28基因表达调控途径分析及其抗白叶枯病机理的探索[D]. 何利娟. 浙江师范大学, 2019(02)