一、不同PCR联合用于鼠疫耶尔森菌的检测（论文文献综述）
史艳文,王梅[1]（2021）在《鼠疫核酸诊断技术的应用概述》文中认为鼠疫是鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）借鼠蚤传播为主的烈性传染病,是广泛流行于野生啮齿类动物间的一种人畜共患的自然疫源性疾病,在历史上曾引起三次大流行,也是一种重要的生物恐怖主义病原体。鼠疫核酸诊断技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应、恒温扩增、基因测序和生物芯片技术等,本文就鼠疫核酸诊断的主要技术研究进展及应用现状综述如下。1 聚合酶链反应（PCR）1.1 普通PCR聚合酶链式反应（PCR）技术是利用特定的引物,
史艳文,王梅[2]（2021）在《鼠疫核酸诊断技术的应用概述》文中研究说明鼠疫是鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）借鼠蚤传播为主的烈性传染病,是广泛流行于野生啮齿类动物间的一种人畜共患的自然疫源性疾病,在历史上曾引起三次大流行,也是一种重要的生物恐怖主义病原体。鼠疫核酸诊断技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应、恒温扩增、基因测序和生物芯片技术等,本文就鼠疫核酸诊断的主要技术研究进展及应用现状综述如下。1 聚合酶链反应（PCR）1.1 普通PCR聚合酶链式反应（PCR）技术是利用特定的引物,
聂守民,罗波艳,孙养信,范锁平,常文辉,王宇萌,孙杰,安翠红[3]（2021）在《陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究》文中研究说明目的掌握陕西省鼠疫耶尔森菌分离株的MLVA基因分型特征,阐明不同疫情年份菌株间的遗传进化关系,为今后陕西省鼠疫的监测防治工作提供科学依据。方法采用MLVA（14+12）方法,对分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶尔森菌进行基因分型,利用BioNumerics（Version7.6）软件对分型结果进行聚类分析。结果 66株鼠疫耶尔森菌分为A、B、C群,根据分离时间聚集成为相应群,A群包含42株菌,其中39株菌分离自2000-2001年,B群包含16株菌,其中15株分离自2006年,C群含8株菌,其中6株分离自1987-1988年。基因型分为19种,8个基因型为多菌株基因型,其他型为单菌株基因型。结论陕西省鼠疫菌MLVA基因型具有多态性,不同疫情年份菌株主导的基因型不同,MLVA分型能够很好区分陕西省不同年代鼠疫菌株,可用于鼠疫菌株的溯源分析。
谢辉,周蕾,祁芝珍,邵高祥[4]（2021）在《基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌》文中指出目的实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25℃和37℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。
潘君风[5]（2021）在《假结核耶尔森氏菌T6SS效应蛋白Tce1杀菌机制的研究》文中提出细菌VI型分泌系统（Type VI Secretion System,T6SS）是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的结构复杂的细菌分泌系统。作为一种重要的接触依赖型细菌竞争武器,一般认为,在环境中相邻的细菌间,攻击者（供体菌）利用T6SS直接刺穿相邻的被攻击者（受体菌）的细胞,从而直接将效应蛋白注射到被攻击者细胞的特定位点,发挥杀菌活性,以获得竞争优势。目前,有关T6SS杀菌功能的研究报道都是接触依赖型的,T6SS是否具有非接触依赖型的杀菌方式是该领域一个未解之谜。假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）是一种重要的人畜共患致病菌,其基因组中含有4套完整的T6SS,其中第三套T6SS（T6SS-3）基因簇中包含有多对功能未知的效应物-免疫蛋白基因对（E-I,effector-immunity pair）。T6SS-3是否可以分泌具有杀菌活性的效应蛋白,以及T6SS-3是否在假结核耶尔森氏菌细菌间竞争中发挥功能尚不清楚。本研究以假结核耶尔森氏菌T6SS-3分泌的一对功能未知的候选效应物-免疫蛋白对:YPK＿0954-YPK＿0955（本研究将YPK＿0954命名为:Tce1,T6SS contact-independent antibacterial effector 1,而将YPK＿0955命名为:Tci1,T6SS contact-independent antibacterial immunity 1）作为研究对象,利用生物信息学预测分析Tce1的生化功能,采用原核表达系统纯化获得Tce1重组蛋白对其进行酶学活性分析;构建tce1-tci1突变体进行细菌间竞争试验,揭示tce1参与细菌竞争的作用方式;利用Tce1重组蛋白检测其杀菌活性、以及采用GST pull-down检测与Tce1相互作用的受体菌蛋白,以期揭示Tce1参与T6SS细菌竞争作用的分子机制,试验获得了以下结果:1.确定了tce1-tci1是假结核耶尔森氏菌T6SS-3基因簇中一对具有功能的效应物-免疫蛋白对,并且效应蛋白Tce1具有Ca2+和Mg2+依赖的DNA水解酶活性。分泌检测试验发现Tce1是T6SS-3所特异分泌的效应蛋白,Tce1毒性检测、体外相互作用试验证明tce1-tci1是一对效应物-免疫蛋白基因对。通过对原核表达纯化获得的Tce1重组蛋白进行体外酶活检测,发现效应蛋白Tce1具有Ca2+和Mg2+依赖的DNA水解酶活性,但不具有RNA水解酶活性。Tce1不仅能够水解线性Lambda DNA分子,而且还可以水解环状质粒DNA分子。异源表达效应蛋白Tce1发现其对大肠杆菌具有毒性,流式细胞术检测及激光共聚焦显微观察发现Tce1在细菌胞内能破坏其DNA的完整性,导致细菌死亡。生物信息学分析、毒性及酶活检测结果说明,Tce1是一个全新的小分子量（67个氨基酸残基组成）DNA水解酶类效应蛋白,Tci1是其特异的免疫蛋白。2.首次发现假结核耶尔森氏菌T6SS-3借助效应蛋白Tce1发挥非接触依赖型的杀菌功能。通过对供体菌（假结核耶尔森氏菌野生型、T6SS-3的功能性突变体Δclp V3及其功能回补菌株、Δtce1菌株）与受体菌（WT野生型菌株、Δtce1Δtci1突变体及其tci1回补菌株）间,在固体培养基表面进行细菌-细菌间紧密接触的生长竞争试验、以及在液体培养基中供体菌与受体菌无紧密接触时的竞争试验结果分析发现,Tce1不但在细菌间紧密接触时发挥了杀菌功能,使得供体菌获得了竞争优势,而且在细菌间无紧密接触时也能发挥杀菌功能;Tce1参与的这种细菌间接触与非接触的生长竞争作用,依赖于T6SS功能的发挥。进一步,在固体培养基表面利用0.22μm滤膜将供体菌与受体菌物理性隔离开进行细菌间竞争试验,结果显示,Tce1仍可借助T6SS的分泌发挥杀菌功能,使得供体菌获得竞争优势。以上结果表明假结核耶尔森氏菌T6SS-3能够利用效应蛋白Tce1发挥接触依赖型与非接触依赖型双模式杀菌功能。重组效应蛋白杀菌试验以及AF-488荧光标记蛋白对靶细胞的结合试验结果均表明,Tce1能够识别并进入到靶细胞内发挥杀菌功能。3.初步揭示了效应蛋白Tce1通过识别并结合受体菌外膜上的受体蛋白Btu B和Omp F进入受体菌细胞的分子进入途径。为了研究Tce1是如何识别并进入到靶细胞内发挥杀菌功能,本研究通过GST-Tce1与假结核耶尔森野生型全细胞裂解液进行pull-down,经质谱检测、体外蛋白互作及细菌双杂交试验,发现了与Tce1相互作用的靶细胞外膜受体分子Btu B和Omp F,以及细胞周质空间蛋白Tol B。通过Tce1的荧光标记蛋白对假结核耶尔森氏菌WT菌株、Δbtu B、Δomp F、Δbtu BΔomp F等细菌突变体及其回补菌株的细胞结合试验,以及重组蛋白对受体突变体的杀菌试验表明,Tce1通过识别并结合受体菌外膜受体Btu B和Omp F,进入胞内发挥杀菌功能。4.靶细胞外膜受体蛋白Btu B和Omp F介导了Tce1非接触依赖的杀菌作用,在T6SS接触依赖型的杀菌作用中Btu B和Omp F不发挥作用。通过对供体菌（假结核耶尔森氏菌WT菌株和Δtce1突变体菌株）与外膜受体btu B和omp F的受体突变体及其基因回补菌株间进行液体培养条件下与固体培养基表面进行细菌竞争试验发现,细菌间非接触竞争作用依赖于靶细胞外膜受体分子Btu B和Omp F发挥作用,而在细菌间紧密接触竞争中则不依赖此类受体分子的参与。本研究首次发现了假结核耶尔森氏菌T6SS-3通过分泌一个新型Ca2+和Mg2+依赖性的DNA水解酶类效应蛋白Tce1,发挥非接触依赖型杀菌功能的分子机制,拓展了当前对于T6SS杀菌功能的认识,初步揭示了T6SS非接触依赖型杀菌作用中Tce1靶向并进入受体细胞依赖于外膜受体Btu B和Omp F进入细胞的途径,完善了对于效应蛋白靶向受体细胞的机制,为此类效应蛋白在临床耐药菌生物防控、农业病原菌的防治与环境生态治理中的发挥重要作用奠定了理论基础。
勾德才[6]（2021）在《2019年内蒙古自治区长爪沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌基因组SNP种群关系研究》文中研究指明目的2019年内蒙古自治区动物间鼠疫频发,同时伴随人间鼠疫发生,这对内蒙古鼠疫的控制是一个严峻的考验。本研究分析了2019年内蒙古自治区长爪沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌单核苷酸多态性（SNP）特征,同时对2019年该疫源地鼠疫病人分离的菌株开展基因组溯源工作,了解2019年动物鼠疫流行的种群关系和系统发生关系,分析导致2019年动物间鼠疫活跃的原因。方法提取2018及2019年内蒙古自治区长爪鼠鼠疫疫源地共计136株鼠疫菌核酸,这些菌株包括:2018年分离的18株,2019年分离的117株,中国疾病预防控制中心国家传染病预防控制研究所（ICDC）从患者C中分离到的鼠疫菌。通过商业测序获得136株鼠疫菌的基因组序列。利用种群单核苷酸多态性（SNP）分析确定2019年动物和人间鼠疫感染菌株的种群定位,了解内蒙古不同流行县或地域的鼠疫菌多态性和系统发生关系,利用更深程度的差异can SNP方法鉴定没有获得菌株的鼠疫病人的溯源。结果在系统发育树上,2018年和2019年从内蒙古自治区长爪鼠鼠疫疫源地分离的所有菌株在系统发育树上被聚为2.MED3谱系,这些菌株在2.MED3谱系中可以进一步划分为四个分支。2019年发生的3起4例鼠疫患者A/B、C、D分别定位于分支II、I、III。2.MED3谱系菌株在宿主动物体内持续存在,并在内蒙古不同地区、不同年份引起了不同的流行事件。结论全基因组SNP的系统发育关系表明,内蒙古自治区长爪鼠鼠疫疫源地2018年分离的一些菌株与2019年的菌株表现出同源的系统发生特征。2019年,内蒙古高原降雨较多,草长势良好,使得鼠类（尤其是主要宿主长爪沙鼠）数量大幅增加,使得长爪沙鼠疫源地的鼠疫再次猛烈活跃。在流行病学调查中,使用可靠的分型方法是鉴定分离株之间联系和了解病原体传播动力学的先决条件。当临床标本培养失败或这些病原体序列不足以通过SNP建立系统发育树时,可以使用基于PCR的分子方法,如MLVA或节点简洁can SNP分析,可以对没有分离到菌株的病人开展溯源。在疫情暴发时采取全基因组SNP进行溯源分析是最佳选择。
邴琪,李立东,赵斌,王铁峰[7]（2021）在《PCR技术在鼠疫检测中的应用现状》文中研究指明鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的一种自然疫源性人兽共患病,被我国列为法定甲类传染病之首。20世纪中叶后,鼠疫疫情在世界范围内主要表现为散发或小范围的爆发,80年后开始逐步活跃,90年代开始明显回升,被WHO列为20种重新流行的传染病之一[1]。
穆慧[8]（2021）在《中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究》文中提出第一部分 中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征目的通过对中国1980-2019年不同地区小肠结肠炎耶尔森菌的病原学与PFGE型别特征分析,为小肠结肠炎耶尔森菌病的防控提供依据。方法对中国不同区域、不同来源标本分离到的6847株小肠结肠炎耶尔森菌,进行血清型别、生化表型、毒力基因分布研究,对致病性菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）型别聚类分析。结果1.本研究中分离到的6847株小肠结肠炎耶尔森菌主要来源于动物（88.36%,6050/6847）,其次是腹泻病人（6.44%,441/6847）、食品（4.76%,326/6847）及外环境（0.44%,30/6847）。在动物源菌株中,以猪源株占比最高（43.24%%,2616/6050）,其次为啮齿类（27.69%,1675/6050）。2.小肠结肠炎耶尔森菌中致病性菌株2047株、非致病菌4800株。致病性菌株仅存在O:3和O:9两种血清型,O:3占比88.96%（1821/2047）、O:9占比11.04%（226/2047）。18个省市自治区的致病株以O:3血清型为主,宁夏回族自治区以O:9血清型为主。非致病菌在调查的22个省份均有分布,血清型众多,普遍比致病株具有更多的阳性生化反应。3.致病株共有两种组合,其中Ⅰ型占92.67%（1897/2047）,携带ail、ystA、yadA和virF基因,Ⅱ型占7.33%（150/2047）,为丢失毒力质粒的致病菌。非致病株以携带ystB基因的Ⅲ型和所有毒力基因均不携带的Ⅳ型占比较高,分别占62.83%（3016/4800）、36.19%（1737/4800）。上述四种典型的基因型别（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）在所有调查的22个省份大多数省份有分布。此外,非致病株还存在仅携带ail基因（Ⅵ型）或同时携带ail和ystB基因（V型）的菌株分布于个别省份。4.1821株O:3致病株分为93个PFGE型别,分布19个省市自治区,其中K6GN11C30021、K6GN11C30012为优势带型分别占比46.35%、22.5%,75.38%的人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致;226株O:9致病株共分为14个PFGE型别,分布于8个省市自治区,77.78%人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致。结论1.我国小肠结肠炎耶尔森菌分布广泛、宿主众多,致病株仅有两个血清型,非致病株血清型众多,可能比致病株具有更强的生化代谢能力与环境适应力。2.非致病菌株普遍比致病性菌株具有更多的阳性生化反应,表明其可能具有更强的生化代谢能力与环境适应力。致病株中,O:3血清型与O:9血清型的主要生化编码亦不存在交叉,表明二者可能具有不同的生化分解能力与生态位。3.致病性菌株PFGE优势带型相对集中,地域分布广泛,多数人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致,应警惕通过家畜家禽、食品及外环境等多种来源感染人的风险。第二部分 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究目的了解鼠疫自然疫源地中旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的情况,为无形体病与鼠疫的防控提供科学依据。方法1.对采集到的旱獭标本检测嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因与groESL基因,对巢式序列进行测序比对;2.以嗜吞噬细胞无形体阳性的旱獭组织研磨液感染BALB/c小鼠及L929细胞,检测嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因与groESL基因并测序。结果1.从2019年至2020年在中国甘肃省肃北县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地共采集到212只旱獭,总阳性率为20.75%（44/212）,其中被捕获的活体旱獭的嗜吞噬细胞无形体阳性检出率为19.21%（29/151）,自毙旱獭检出率为24.59%（15/61）。分布于旱獭的心、肝、脾、肺、骨髓中。2.旱獭来源的嗜吞噬细胞无形体的16S rRNA基因序列、groEL核苷酸序列,GroEL氨基酸序列与嗜吞噬细胞无形体参考菌株HZ（CP000235.1）的同源性分别为99.52%（1463/1470）,94.07%（1173/1247）和99.52%（413/415）。3.旱獭组织中的嗜吞噬细胞无形体成功感染BALB/c小鼠及L929细胞,可从小鼠中及L929细胞再次检测到嗜吞噬细胞无形体。结论1.本研究首次发现旱獭携带嗜吞噬细胞无形体,具有较高的携带率,并分布于全身多个脏器。2.旱獭可能是嗜吞噬细胞无形体的储存宿主。
张爱萍,赵小龙,唐新元,田富彰,李君,于守鸿,游培松,杨汉青,杨永海,王梅[9]（2021）在《SYBR GreenⅠ荧光定量PCR定性检验鼠疫样本材料的结果分析》文中进行了进一步梳理目的利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR定性检验鼠疫样本材料,分析实验结果的差异。方法选取鼠疫菌质粒上的毒力基因caf1及染色体上的标识序列YP-LC为靶序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术定性检测鼠疫样本,通过统计软件SPSS 21.0分析不同引物、不同浓度的模板DNA,Ct值的差异。结果 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR定性检测感染不同浓度的鼠疫耶尔森菌的脏器材料,感染浓度越大,Ct值越小（t=26.817、27.782,P=0.003、0.005,均<0.05）,不同引物、不同脏器组织之间Ct值差异无统计学意义（t=28.828、25.242,P=0.714、0.132,均>0.05）,但以caf1为引物对应的Ct值较以YP-LC为引物对应的Ct值重现性好,数据稳定。结论不同脏器之间,肝脏的Ct值较脾脏的Ct值数据稳定,重现性好。不同引物之间,以fra为引物的Ct值较以YP-LC为引物的Ct值重现性好,数据稳定。
程鹏博[10]（2020）在《鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学及小鼠肺递送感染特性研究》文中进行了进一步梳理鼠疫作为一种古老的烈性传染病,现在仍然在世界上的某些地区悄然流行。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌,其自然宿主是野生啮齿动物,可通过染病蚤类在不同的动物和人之间进行传播。目前在人类感染上鼠疫耶尔森菌后可表现出腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫三种临床表征,其中肺鼠疫的死亡率最高,如不进行及时治疗,可导致较高的死亡率。虽然对于鼠疫耶尔森菌的研究开展了很多,但是目前对于致死率最高的临床类型——肺鼠疫的空气传播与感染致病过程知之甚少。鼠疫耶尔森菌通过气溶胶形式在空气中传播,被机体吸入后从而引发肺鼠疫,因此研究鼠疫耶尔森菌气溶胶的特性对于肺鼠疫的防控至关重要。本研究通过鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的人工发生与小鼠肺递送感染模型的建立,系统研究了鼠疫耶尔森菌201株及其caf1基因缺失株液体气溶胶的体外生物学特性、空气生物学特性及动物致病性,为深入了解鼠疫耶尔森菌气溶胶空气传播与感染致病机制奠定了基础。首先我们在优选合适的发生器、发生液和采样液的基础上研究了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的空气生物学特性。本研究总共比较了六种采样液（生理盐水、PBS、BHI培养液、上述三种采样液分别添加0.01%Tween80+0.005%橄榄油）、四种发生液（生理盐水、PBS、上述两种发生液分别加入0.05%泊洛沙姆）、以及两种采样器（Collison 6孔发生器和筛板振动发生器）对鼠疫耶尔森菌进行发生或采样的差异。结果发现PBS更适合作为短时间（5min）内的采样液,0.01%Tween80+0.005%橄榄油在长时间的（30min）的采样过程中对细菌活性有保护作用;生理盐水更适合做喷雾液;Collison 6孔发生器与筛板振动气溶胶发生器均适用于该菌的气溶胶发生,但后者发生时间不能超过15min。随后使用上述优化条件,在气溶胶微环境密闭舱内人工发生了鼠疫耶尔森菌201株气溶胶,某些组别发生液内填加荧光素钠指示剂,通过空气动力学粒径谱仪、安德森六级采样器、Biosampler采样器对舱内不同时间点气溶胶进行实时监测或采样,随后对采样皿进行鼠疫耶尔森菌活菌培养计数,对采样液进行鼠疫耶尔森菌基因拷贝数qPCR检测以及荧光素钠浓度分光光度法检测,综合分析鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气动力学粒径谱及其沉降规律与衰亡规律。结果发现,鼠疫耶尔森菌气溶胶总粒子空气动力学质量中值直径（MMAD）为2.35μm,空气动力学数量中值直径（CMAD）为2.8μm,90%总粒子沉降时间T90为607 min,90%生物粒子衰亡时间T90为2.5 min。上述结果表明,鼠疫耶尔森菌液体气溶胶可被人体吸入至下呼吸道或肺泡,可稳定存在于密闭空间内数小时,但会在几分钟内失去活性。随后在鼠疫耶尔森菌液体气溶胶肺递送感染特性研究中,我们以100倍LD50的攻毒剂量通过肺递送途径感染BALB/c小鼠,观察其临床症状、器官内菌载量、急性反映期蛋白、细胞因子和组织病理变化。小鼠生存率结果显示,在肺递送途径感染后的3到6天内,小鼠全部死亡。菌载量检测结果显示,肺、脾和血中的鼠疫菌分别在攻毒后的1h、24h和48h小时被检测到。小鼠脏器病理检测结果显示,小鼠在攻毒后72h时间点肺、脾病理改变明显,表现为肺水肿、肺出血、脾炎性坏死等。免疫因子检测结果显示,肺递送实验组中小鼠的肺匀浆和血清中C反应蛋白和穿透素的水平菌有所升高。上述结果提示,鼠疫耶尔森菌感染小鼠后,在小鼠体内不断增殖扩散,引起小鼠肺和脾病理改变。另一方面,在鼠疫耶尔森菌感染后72h内,机体会系统性地招募炎症细胞,释放炎性因子,刺激机体产生体液免疫和细胞免疫共同作用来抵抗细菌感染。最后,我们探索了caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌自凝聚、空气衰亡及小鼠毒力的影响。利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。然后比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在体外生物学特性、空气生物学特性及动物致病性方面的差异。PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD50分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显着降低。不同途径攻毒结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因缺失株相较于野生株,在液体气溶胶内的衰亡没有明显变化。结果表明,caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降,空气衰亡无明显变化。综上所述,本研究探究了鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的空气生物学特性、小鼠肺递送感染特性,并比较了鼠疫耶尔森菌201株及其caf1基因缺失株液体气溶胶的体外生物学特性、空气生物学特性及动物致病性,为鼠疫疫情的防控工作提供理论和实验基础。
二、不同PCR联合用于鼠疫耶尔森菌的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同PCR联合用于鼠疫耶尔森菌的检测（论文提纲范文）
（1）鼠疫核酸诊断技术的应用概述（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链反应(PCR) |
| 1.1 普通PCR |
| 1.2 多重PCR |
| 1.3 实时荧光定量PCR |
| 1.4 数字PCR |
| 2 恒温核酸扩增技术 |
| 2.1 环介导等温扩增(LAMP) |
| 2.2 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) |
| 2.3 聚合酶螺旋反应(PSR) |
| 3 液相芯片(Luminex xMAP) |
| 4 原位荧光杂交(FISH) |
| 5 DNA条形码 |
| 6 结 语 |
（2）鼠疫核酸诊断技术的应用概述（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链反应(PCR) |
| 1.1 普通PCR |
| 1.2 多重PCR |
| 1.3 实时荧光定量PCR |
| 1.4 数字PCR |
| 2 恒温核酸扩增技术 |
| 2.1 环介导等温扩增(LAMP) |
| 2.2 重组酶聚合酶等温扩增(RPA) |
| 2.3 聚合酶螺旋反应(PSR) |
| 3 液相芯片(Luminex xMAP) |
| 4 原位荧光杂交(FISH) |
| 5 DNA条形码 |
| 6 结 语 |
（3）陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株信息 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 试剂耗材 |
| 1.4 合成引物 |
| 1.5 核酸提取 |
| 1.6 扩增体系及参数 |
| 1.7 PCR结果分析 |
| 1.8 聚类分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 26位点VNTR重复数 |
| 2.2 MLVA分群结果 |
| 2.3 MLVA种内分型结果 |
| 3 讨 论 |
（4）基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 试剂及仪器 |
| 1.1.2 实验菌株 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 菌株培养及模板制备 |
| 1.2.2 荧光定量PCR检测法 |
| 1.2.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2.2 鼠疫菌模板的制备 |
| 1.2.2.3 基于核酸预混室温储运技术荧光定量扩增反应的优化 |
| 1.2.2.4 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR检测方法 |
| 2 结 果 |
| 2.1 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR退火温度的优化结果 |
| 2.2 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 2.3 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR敏感性检测 |
| 2.4 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR特异性检测 |
| 2.5 基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR检测冻干试剂的保存期试验 |
| 3 讨 论 |
（5）假结核耶尔森氏菌T6SS效应蛋白Tce1杀菌机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 假结核耶尔森氏菌与细菌六型分泌系统 |
| 1.1.1 三种耶尔森氏菌病原菌中T6SS基因簇的比较分析 |
| 1.1.2 耶尔森菌中不同系列的T6SS的功能 |
| 1.2 T6SS效应物-免疫蛋白对(Effector-Immunity Pairs,E–I) |
| 1.2.1 靶向细胞壁的效应蛋白 |
| 1.2.2 靶向细胞膜的效应蛋白 |
| 1.2.3 靶向核酸的效应物 |
| 1.2.4 其他效应蛋白及其伴侣 |
| 1.2.5 鉴定T6SS效应物-免疫蛋白对的技术方法 |
| 1.2.6 验证T6SS E-I对的方法 |
| 1.3 耶尔森氏菌中T6SS分泌的效应物 |
| 1.4 论文选题依据 |
| 1.5 本研究的主要内容、目的和意义 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 第二章 假结核耶尔森氏菌T6SS-3 效应蛋白Tce1 的生化生理功能鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.1 常规生化试剂 |
| 2.2.2 分子生物学试剂 |
| 2.2.3 培养基、缓冲液及抗生素配制 |
| 2.2.4 菌株、相关载体及PCR引物 |
| 2.2.5 主要仪器 |
| 2.2.6 主要试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Tce1 是假结核耶尔森氏菌T6SS-3 所分泌的效应蛋白 |
| 2.3.2 Tce1-Tci1 是一组效应物-免疫蛋白对 |
| 2.3.3 Tce1 是一种依赖于Ca~(2+)和Mg~(2+)的DNA水解酶 |
| 2.3.4 Tce1 不具有RNase活性 |
| 2.3.5 Tce1 在体内发挥着DNA水解酶活性破坏细菌DNA完整性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 效应蛋白Tce1 参与细菌竞争作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 试验试剂 |
| 3.2.2 菌株、相关载体及PCR引物 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 YPK_2801-YPK_2802是Tce1-Tci1 的同源基因对 |
| 3.3.2 Tce1 参与假结核耶尔森氏菌接触依赖和非接触的种内竞争作用 |
| 3.3.3 重组效应蛋白Tce1 可识别进入受体菌细胞内发挥杀菌功能 |
| 3.4 .讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Tce1 非接触依赖型杀菌作用中相关受体蛋白的鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 试验试剂 |
| 4.2.2 菌株、相关载体及PCR引物 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 GST pull-down筛选Tce1 互作的蛋白分子Btu B、Omp F和 Tol B |
| 4.3.2 Tce1与Btu B、Omp F和 Tol B体外存在蛋白质相互作用 |
| 4.3.3 效应蛋白Tce1 与受体分子Btu B和 Omp F体外结合具有高亲和性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 外膜受体介导的Tce1 非接触依赖型杀菌机制的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料与方法 |
| 5.2.1 试验试剂、培养基、缓冲液及抗生素配制 |
| 5.2.2 菌株、相关载体及PCR引物 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 效应蛋白 Tce1 通过外膜蛋白 Btu B和 Omp F进入靶细胞 |
| 5.3.2 Tce1 的杀菌活性依赖于靶细胞外膜受体分子Btu B或 Omp F |
| 5.3.3 Tce1 进入靶细胞胞内需要周质蛋白Tol B的参与 |
| 5.3.4 Tce1 参与细菌种内的非接触竞争依赖于受体菌外膜Btu B和 Omp F |
| 5.3.5 Tce1 参与细菌种间的非接触竞争也依赖于Btu B和 Omp F |
| 5.3.6 Tce1 参与接触依赖型细菌竞争作用不依赖Btu B和 Omp F |
| 5.4 .讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与创新 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 实验中相关的常规培养基、缓冲液及抗生素配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）2019年内蒙古自治区长爪沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌基因组SNP种群关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.鼠疫 |
| 1.1 鼠疫概述 |
| 1.2 世界鼠疫 |
| 1.3 中国鼠疫 |
| 1.4 内蒙古鼠疫 |
| 2.鼠疫菌 |
| 3.鼠疫自然疫源地 |
| 3.1 鼠疫自然疫源地概述 |
| 3.2 世界鼠疫自然疫源地 |
| 3.3 中国鼠疫自然疫源地 |
| 3.4 内蒙古长爪沙鼠鼠疫自然疫源地 |
| 4.鼠疫单核苷酸多态性分析(SNP) |
| 4.1 SNP概述 |
| 4.2 鼠疫菌常用的分型方法 |
| 4.3 鼠疫基因组SNP种系发生分析 |
| 4.4 中国鼠疫菌SNP分析现状 |
| 材料及方法 |
| 1.菌株来源 |
| 2.仪器 |
| 3.材料 |
| 4.研究方法 |
| 4.1 菌株DNA提取 |
| 4.2 鼠疫菌测序 |
| 4.3 基于全基因组SNPs的系统发育分析 |
| 4.4 MLVA和典型SNP(CanSNP)分析在患者系统发育定位中的使用 |
| 4.5 核苷酸序列登录号 |
| 结果 |
| 1.内蒙古长爪沙鼠鼠疫菌的系统发育和定位 |
| 2.内蒙古人间鼠疫患者的流行病调查及溯源研究 |
| 3.2019年内蒙古传入北京人间鼠疫毒力分析 |
| 4.内蒙古2018年和2019年动物鼠疫疫情的生态地理分析 |
| 讨论 |
| 1.2019年内蒙古鼠疫爆发的回顾 |
| 2.气候变化对内蒙古鼠疫的影响 |
| 3.2019年人间鼠疫疫情基于分子分型和基因组SNP方法的溯源分析 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 中国鼠疫疫源地鼠疫菌种群关系 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）PCR技术在鼠疫检测中的应用现状（论文提纲范文）
| 1 PCR技术概述 |
| 2 PCR技术在鼠疫检测中的应用 |
| 2.1 传统PCR技术 |
| 2.1.1 常规PCR |
| 2.1.2 多重PCR |
| 2.1.3 巢式PCR |
| 2.1.4 竞争性PCR |
| 2.2 荧光定量PCR技术 |
| 3 相关核酸扩增检测技术的研究 |
| 4 小 结 |
（8）中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 生化鉴定 |
| 2.2 生物分型 |
| 2.3 血清分型 |
| 2.4 毒力基因检测 |
| 2.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 |
| 结果 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 实验菌株分布情况 |
| 3.1.1 实验菌株宿主来源分布 |
| 3.1.2 菌株分离年代情况 |
| 3.1.3 地域分布特征 |
| 3.2 生物血清型分布 |
| 3.3 毒力基因分布 |
| 3.4 基因序列分析 |
| 3.5 生化反应 |
| 3.6 PFGE分型结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 鼠疫耶尔森菌分离与鉴定、通用16S rRNA基因克隆与测序 |
| 2.2 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的筛选 |
| 2.3 BALB/c小鼠再感染及克隆测序 |
| 2.4 细胞培养与测序 |
| 结果 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 嗜吞噬细胞无形体在旱獭中的发现 |
| 3.2 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的检出情况 |
| 3.3 嗜吞噬细胞无形体感染BALB/c小鼠 |
| 3.4 嗜吞噬细胞无形体感染L929 细胞 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 小肠结肠炎耶尔森菌致病机制研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员会组成 |
（9）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR定性检验鼠疫样本材料的结果分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鼠疫感染样本的制备 |
| 1.2.2 非鼠疫菌对照菌株 |
| 1.2.3 基因组DNA提取 |
| 1.2.4 引物 |
| 1.2.5 反应体系及扩增条件 |
| 2 结 果 |
| 2.1 阳性样本的筛选结果 |
| 2.2 数据分析 |
| 3 讨 论 |
（10）鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学及小鼠肺递送感染特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1.前言 |
| 1.1 鼠疫耶尔森菌 |
| 1.2 微生物气溶胶 |
| 1.3 本研究目的及意义 |
| 第一部分 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鼠疫耶尔森菌的培养及发生液的制备 |
| 2.2.2 鼠疫耶尔森菌载量实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.3 不同采样液对鼠疫耶尔森菌采样的校正存活率测试 |
| 2.2.4 不同发生液介质发生鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的比较 |
| 2.2.5 不同发生器发生鼠疫耶尔森菌液体气溶胶的比较 |
| 2.2.6 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学特性研究 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鼠疫耶尔森菌实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.3.2 不同采样液对鼠疫耶尔森菌采样的冲击损伤保护效果比较 |
| 2.3.3 不同发生液介质对鼠疫耶尔森菌液体气溶胶发生效果的影响 |
| 2.3.4 筛板振动发生器和Collison6 孔发生器对鼠疫耶尔森菌发生效果的比较 |
| 2.3.5 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学特性测试结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第二部分 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶肺递送感染特性研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鼠疫耶尔森菌的培养及菌液的制备 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 生存曲线绘制 |
| 2.2.4 临床症状观察 |
| 2.2.5 样品处理 |
| 2.2.6 载菌量检测 |
| 2.2.7 急性期反应蛋白检测 |
| 2.2.8 细胞因子检测 |
| 2.2.9 组织病理分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒生存曲线 |
| 2.3.2 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒后临床症状观察 |
| 2.3.3 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒后脏器和血中载菌量检测 |
| 2.3.4 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒后急性期反应蛋白检测 |
| 2.3.5 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒后细胞因子检测 |
| 2.3.6 鼠疫耶尔森菌液体气溶胶小鼠肺递送攻毒后组织病理分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 鼠疫耶尔森菌野生株及caf1基因缺失株的自凝聚、空气衰亡及小鼠毒力比较研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鼠疫耶尔森菌的培养及菌液的制备 |
| 2.2.2 鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株的构建 |
| 2.2.3 生长曲线测定 |
| 2.2.4 菌株自凝聚率测定 |
| 2.2.5 气溶胶肺递送途径感染小鼠LD50测定 |
| 2.2.6 不同途径攻毒小鼠试验 |
| 2.2.7 液体气溶胶的衰亡特性比较 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 caf1基因缺失株的鉴定 |
| 2.3.2 菌株生长曲线分析 |
| 2.3.3 菌株自凝聚率比较 |
| 2.3.4 气溶胶肺递送途径攻毒小鼠LD50比较 |
| 2.3.5 不同途径感染小鼠的生存曲线比较 |
| 2.3.6 液体气溶胶的衰亡特性比较 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 在学期间的研究成果目录 |
| 致谢 |
| 综述 微生物气溶胶的相关进展研究 |
| 参考文献 |
四、不同PCR联合用于鼠疫耶尔森菌的检测（论文参考文献）
- [1]鼠疫核酸诊断技术的应用概述[J]. 史艳文,王梅. 中国地方病防治, 2021(06)
- [2]鼠疫核酸诊断技术的应用概述[J]. 史艳文,王梅. 中国地方病防治, 2021(06)
- [3]陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究[J]. 聂守民,罗波艳,孙养信,范锁平,常文辉,王宇萌,孙杰,安翠红. 中国人兽共患病学报, 2021(10)
- [4]基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌[J]. 谢辉,周蕾,祁芝珍,邵高祥. 中国人兽共患病学报, 2021(09)
- [5]假结核耶尔森氏菌T6SS效应蛋白Tce1杀菌机制的研究[D]. 潘君风. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]2019年内蒙古自治区长爪沙鼠鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌基因组SNP种群关系研究[D]. 勾德才. 内蒙古医科大学, 2021(02)
- [7]PCR技术在鼠疫检测中的应用现状[J]. 邴琪,李立东,赵斌,王铁峰. 中国地方病防治, 2021(02)
- [8]中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究[D]. 穆慧. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [9]SYBR GreenⅠ荧光定量PCR定性检验鼠疫样本材料的结果分析[J]. 张爱萍,赵小龙,唐新元,田富彰,李君,于守鸿,游培松,杨汉青,杨永海,王梅. 医学动物防制, 2021(01)
- [10]鼠疫耶尔森菌液体气溶胶空气生物学及小鼠肺递送感染特性研究[D]. 程鹏博. 安徽医科大学, 2020(02)