一、水母雪莲愈伤组织超低温保存条件的初探（论文文献综述）
李纯[1]（2016）在《东北红豆杉细胞高效诱导紫杉醇工艺优化研究》文中研究指明东北红豆杉细胞中含有一种萜类化合物为紫杉醇,对多种肿瘤疾病具有显着的疗效,是当今市场上价格昂贵且应用最广泛的一种天然抗癌药物。但野生红豆杉是国家的重点保护资源,用直接提取法高效获取紫杉醇比较困难。所以,我们有必要利用生物技术—细胞高效诱导法提取紫杉醇,才能从根本上解决红豆杉原料不足的问题,来满足人类不断增长的需求。因此,本论文主要以东北红豆杉幼茎为材料,在适宜的（补光）环境条件下,对东北红豆杉愈伤组织诱导,然后不断地进行继代培养,选择紫杉醇含量高且稳定的愈伤组织,进行高产细胞株系的筛选,并对细胞悬浮培养条件进行优化,得到东北红豆杉细胞悬浮培养高效获取紫杉醇的一套优化工艺。同时提出了一种东北红豆杉愈伤组织的保存方法—超低温法,有利于缩短试验周期,加快试验进程。此优化工艺对东北红豆杉细胞高效诱导紫杉醇具有重要的指导意义,为红豆杉细胞生产紫杉醇走向产业化奠定了坚实的前期工作基础,有利于药用植物资源的高效开发利用,具有重要的现实意义与深远的社会影响。通过试验研究获得的创新性结论如下:（1）本试验选择东北红豆杉幼茎为外植体,采用改良后的B5培养基,在一定的环境条件下进行诱导,1Od-11d获得生长状况良好的愈伤组织,通过光环境的单因素试验,得到最优光环境为:（以LED为光源）光质为红光（λ=660nm）,光周期为12h/d,光强为10μmol·m-2·s-1。以光周期、光强、温度、湿度为自变量,进行Box-Behnken复因素试验结果表明,东北红豆杉愈伤组织诱导的最佳（光）环境条件为:光周期为11.82h/d,光强为9.77μmol·m-2·s-1,温度为24.83℃,湿度为85.00%,此时愈伤组织的诱导率为95.61%。（2）通过超低温保存东北红豆杉愈伤组织预培养条件的单因素试验,得到的最佳预培养条件为:温度为5℃,培养基中蔗糖浓度为6%,时间为10d。以时间（X1）、蔗糖浓度（X2）、温度（X3）为自变量,通过Box-Behnken复因素试验结果表明,最佳的预培养条件为:预培养时间为10.47d,预培养蔗糖浓度为5.50%,预培养温度为3.37℃,此时东北红豆杉愈伤组织细胞相对存活率达到最大值,为62.30%。超低温法保存东北红豆杉愈伤组织的冷冻保护剂试验,以10%山梨醇与10%DMSO共同作为保护剂,其细胞相对存活率最高,为65.73%;超低温液氮法保存愈伤组织的冷冻方法试验表明:以慢冻和分步冷冻的方法处理愈伤组织,解冻后对愈伤组织细胞的影响小,其愈伤组织细胞相对存活率高,分别为67.23%和 65.12%。（3）东北红豆杉愈伤组织经过11次继代培养试验分析表明:继代培养9次后紫杉醇含量和鲜重趋于稳定;当继代到第9代时,紫杉醇含量为259.14μg/g,是直接从植物中提取的2.1倍。因此,可以第9代的愈伤组织为材料进行筛选高产细胞株系的试验。在多株克隆细胞中筛选出10株高产细胞株系,通过进行稳定性筛选,（与固体培养基相比）发现细胞克隆在液体培养基上的鲜重增长率更高,但在两种培养基上5号、12号和21号细胞的紫杉醇含量相对稳定。（4）通过试验分析发现悬浮培养基中高浓度蔗糖有利于细胞紫杉醇含量,但会使细胞生长受到抑制,因此,悬浮初期添加30g/L的蔗糖较合适。以悬浮培养中期未补加糖分为对照组,补加糖分时使得细胞鲜重由高到低的糖分依次为蔗糖、葡萄糖、果糖,使得紫杉醇含量由高到低的糖分依次为蔗糖、果糖、葡萄糖。通过悬浮培养过程中温度和摇床转速单因素试验果表明:温度为24℃和转速为120r/min时,有利于紫杉醇的积累。对悬浮培养条件中培养基中蔗糖浓度、培养温度、摇床转速三因素进行正交试验设计及分析,并综合考虑细胞生长和紫杉醇含量,得到悬浮培养最优条件为:初期添加30g/L蔗糖,中期补加10g/L蔗糖,温度24℃,转速120r/min。当向悬浮培养基中添加诱导物质并补加蔗糖时,其细胞鲜重和紫杉醇含量均最高,分别达到72.025g/L和5.652mg/L,比只添加诱导物质组分别提高8.23%和25.96%。
马晓菲[2]（2014）在《防风愈伤组织超低温保存及其玻璃化现象研究》文中认为以防风（Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.）为材料，建立了组织培养再生体系，对防风试管苗玻璃化现象进行了研究。为避免连续继代造成的愈伤组织变异,探索新的种质资源保存方法,对防风愈伤组织进行了超低温冷冻保存及植株再生研究。以3周龄的愈伤组织为材料,单一变量法研究适宜的玻璃化法超低温保存程序。结果表明,1．茎段是诱导愈伤组织的最佳外植体,最佳诱导培养基为MS+1.5mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT+1.0mg·L-16-BA。MS培养基中附加1.0mg·L-16-BA和1.0mg·L-1NAA时，愈伤组织质地紧密，呈黄绿色，后期出芽率较高，最适合防风愈伤组织的继代培养。2．MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA为诱导不定芽的最佳培养基。最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1。试管苗在腐殖土：蛭石：河沙（1:1:1）的基质中移栽成活率最高，达92%，是最理想的移栽基质。3．与正常试管苗相比，玻璃化苗形态异常，防风玻璃苗的组织含水量比正常苗增加了6.64%；叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量出现显着下降，较正常苗分别降低了62.88%、59.74%和63.98%，可溶性蛋白含量降低，过氧化物酶活性升高。4．正常苗和玻璃苗的过氧化物酶同工酶谱存在明显的差别，正常苗有5条带，其Rf值分别为0.150、0.179、0.300、0.372、0.688；玻璃苗与正常苗相比有较多次生带，其中Rf值在0.300和0.372的两条酸性区带明显减弱。5．培养基内6-BA浓度大于2.0mg·L-1、光照强度低于2000lx、培养瓶内湿度大都极易导致防风试管苗的玻璃化，减少愈伤继代次数,增加培养基内琼脂和蔗糖浓度，可以降低玻璃化率。6．通过改变培养环境可以使轻中度的玻璃化苗恢复正常。优化的再生培养体系为:嫩茎段做外植体，继代3次左右的愈伤组织用于分化出芽，芽继代增殖时，6-BA浓度在1.0mg·L-1和0.5mg·L-1间交替使用，培养光照30004000lx。7.超低温保存的最佳方案为：4℃条件下于MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA+5%DMSO的继代培养基中预培养3d,60%PVS2常温装载20min,2℃100%PVS2脱水45min后直接投入液氮；1.0mol·L-1蔗糖的MS溶液洗涤、暗培养14d以上有助于冻后愈伤组织恢复生长。8.玻璃化超低温冻存可以作为防风愈伤组织的保存方法，在最佳培养方案下，防风愈伤组织经超低温冻存后的相对存活率达到了79.24%,其中预培养和脱水是实现超低温冻存的关键环节，冻后愈伤可以恢复生长并再生成完整植株。
王亚杰[3]（2014）在《水母雪莲黄酮合成酶FNSⅡ基因克隆和功能分析》文中认为水母雪莲为菊科凤毛菊属多年生草本植物，为中国传统名贵中药材，其含有的药用活性成分具有消炎镇痛、抗辐射、抗癌、抗疲劳、清除自由基、延缓衰老、增强机体免疫和降血压血脂等诸多功效。植化分析显示类黄酮是雪莲中一类重要的活性成分。水母雪莲品质优良，是用药广泛的雪莲原植物，但其野生资源远远不能满足市场需求，因此人工种植被寄予厚望。为了提供可人工种植的高产活性成分的雪莲种质，开展天山雪莲的代谢基因工程研究势在必行。在水母雪莲中，黄酮成分主要为木犀草素，而在《中国药典》中木犀草素是雪莲生药材质量的重要鉴定标准。因此克隆并鉴定黄酮合成酶SmFNS II基因，不仅有助于了解木犀草素生物合成与积累的调控机理，而且为通过基因工程手段调节代谢途径，从而使雪莲高水平积累这一有价值的代谢产物的遗传工程提供理论基础。本研究利用水母雪莲绿色愈伤组织作为材料，进行SmFNS II基因克隆及功能分析，研究结果发现：1.利用特异引物进行RACE PCR,克隆水母雪莲SmFNS II基因的全长序列，获得1个1733bp的cDNA片段（GenBank：KF170286），其中含有一个1551bp的开放阅读框（ORF）。2.对水母雪莲FNSII和其他8种植物的FNSII的氨基酸序列构建系统进化树，分析发现水母雪莲FNSII与菊科植物毛山柳菊、翠菊、非洲菊、大丽花的FNSII归为一大类，同源关系较近，其次是截形苜蓿、茶的FNSII，而与金鱼草和三花龙胆FNSII的同源关系较远。3.生物信息学分析克隆得到的SmFNS II基因，SmFNS II编码一个含516个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量58.88731kDa，理论等电点（pI）为6.67，属于细胞色素P450CYP93B亚家族中单氧化酶，在7-26位氨基酸中间有1个跨膜区，二级结构主要由α螺旋、随机卷曲以及少量延伸链组成；此蛋白可能有7个蛋白磷酸化位点，其中5处丝氨酸磷酸化位点，2处有苏氨酸磷酸化位点。4.使用特异性引物，通过荧光实时定量PCR对水母雪莲三个颜色细胞系中SmFNS II基因的表达量进行分析。结果显示，水母雪莲白色细胞系中FNS II基因表达量最低，而绿色系中表达量较高，为白色系的2.15倍，红色系中的表达量最高，分别为白色系的7.78倍和绿色系的3.62倍。5.构建了pET-SmFNSII原核表达载体，表达出62kDa目的蛋白条带，与预测蛋白大小一致。6.构建了pBI121-SmFNSII的植物过表达载体，采用农杆菌介导的叶盘侵染法对夏堇进行了遗传转化。
殷振芳[4]（2014）在《百合（Lilium）离体植株再生及超低温保存研究》文中研究表明百合是单子叶植物纲百合科（Liliaccae）百合属（Lilium）的多年生球根草本植物的总称。中国是全球百合资源最丰富的国家，特有种占全球百合资源的一半以上。百合不仅具有较高的观赏价值和经济价值，还具有食用和药用价值。植物种质资源的收集与保存是传统育种和生物技术育种的前提条件。工业化、城市化、全球气候变暖正导致全球约1/3的物种濒临灭绝。传统的种质资源保存的方法成本较高，占地面积大，易受病虫害和自然灾害的威胁。超低温保存被视为植物种质资源长期保存最理想、最有效的方法。微型繁殖、转基因、种质资源保存及人工种子（Articifcial seeds）生产等依赖于高效、广谱的离体植株再生体系，包括器官发生（Organogenesis）和体细胞胚发生（Somaticembryogenesis）。本研究通过器官发生和体细胞胚发生，分别建立了高效、广谱的的百合器官发生和体细胞胚发生再生体系；建立了高效、广谱的百合茎尖超低温保存体系；建立了百合胚性愈伤超低温保存技术，为百合转基因研究提供更为理想的受体材料；为百合种质资源超低温库的建立提供了技术支撑。本研究取得的主要结果如下：1.通过优化影响百合叶片不定芽再生的关键因素，建立了6个百合品种的高效、广谱叶片不定芽再生体系。供试的6个百合品种叶片不定芽分化率均较高（91.6%-100.0%），平均分化率为95.8%，单个外植体不定芽数最高为西伯利亚百合（7.0），最低为双色百合（4.7），平均值为5.5。组织学研究表明，叶片近轴端表皮下的单个或几个细胞最先开始脱分化，之后经过细胞分裂直接形成不定芽，没有愈伤组织的形成。ISSR分子标记研究结果表明，再生植株没有变异条带的出现；AFLP分子标记研究结果表明，再生植株仅有0.73%的变异率；形态学观察表明再生植株与母本材料外形一致。2.通过优化百合鳞茎薄层细胞诱导胚性愈伤组织的关键因素，建立了5个百合品种的高效、广谱的体细胞胚再生体系。胚性愈伤组织的诱导率最高为新铁炮百合（85.0%），最低为兰州百合（25.0%），平均值为56.1%。组织学研究表明，鳞茎表皮的单个细胞最先开始脱分化，之后经过细胞分裂形成胚性细胞团，胚性细胞团进一步发育形成无性胚，进而萌发成完整植株。ISSR分子标记研究表明，再生植株没有变异条带的出现。3.通过优化小滴玻璃化法超低温保存的关键步骤，建立了6个百合品种的简易、高效、广谱的茎尖超低温保存体系。供试的6个百合品种中，茎尖超低温保存后的植株再生率最高为西伯利亚百合（87.5%）、最低为双色百合（42.5%），平均再生率为67.1%。组织学研究表明，茎尖经过超低温冷冻后，仅生长点顶部的几层细胞和幼嫩叶原基（第一到第三）中的部分细胞可以存活，其余细胞均不能成活。西伯利亚百合和双色百合茎尖超低温保存后细胞的成活模式和数目相似，表明不同百合品种再生率的差异可能与再生培养基有关。ISSR分子标记研究结果表明，西伯利亚百合和双色百合茎尖超低温保存后的再生植株均未没有变异条带的出现。4.建立了百合小滴玻璃化法超低温保存后茎尖体细胞胚再生技术。将超低温保存后的茎尖培养在0.1mg L-1NAA+0.1-0.2mg L-1KT后培养基上，在黑暗条件下培养6周后，超低温保存后的茎尖形成三种再生物：胚性愈伤组织、茎和胚性愈伤组织、茎。胚性愈伤组织发生率最高的是西伯利亚百合（90.0%），最低的是亚洲百合‘精粹’（45.0%），茎的再生率最高的为亚洲百合‘波利安娜’（52.5%），最低的为新铁炮百合（25.0%）；6个百合品种的平均胚性愈伤组织发生率为60.0%，平均茎再生率为39.6%。5.通过优化玻璃化法超低温保存的关键步骤，初步筛选出西伯利亚百合胚性愈伤组织超低温保存的最适预培养蔗糖浓度为0.5M，最适PVS2脱水时间为4h，获得的胚性愈伤组织成活率为50.0%。
程利红[5]（2012）在《超低温保存秦巴山区三种濒危植物组织细胞技术研究》文中研究表明本研究以秦巴山区三种濒危植物秦岭冷杉（Abies chensiensis）、连香树（Cercidiphyllum japonicum）、中国红豆杉（Taxus chinensis）的种子胚、定芽或种子为试验材料，采用单因素试验和正交试验研究了冷冻保护剂类型、冷冻保护剂处理方式、冷冻方式、保存温度和解冻方式以及保存时间等因素对三种试验材料超低温保存后细胞活力的影响，进而确立了三种濒危植物种质资源的最佳超低温保存技术条件；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法和细胞微结构分析法对保存效果进行了评价，分析了超低温保存对细胞超微结构的影响及其与细胞活力的关系，初步揭示了超低温冷冻保存对植物组织细胞活力的影响机理。研究结果表明：（1）秦岭冷杉种子胚最佳超低温保存条件是：秦岭冷杉种子胚消毒后用PVS（435%甘油+20%乙二醇+0.6mol/L蔗糖的脱氨MS液体培养基）玻璃化保护剂经250W超声冰浴处理30min，在﹣20℃条件下预冻2h，投入液氮中保存7d，37℃恒温水浴解冻30min，秦岭冷杉种子胚冻存后细胞存活率最高，达到91.73%。（2）连香树定芽细胞最优超低温保存条件是：连香树定芽消毒后，用含35%甘油、20%单乙烯乙二醇、15.0%二甲基亚砜（DMSO）和1%甘氨酸的3%蔗糖脱氨MS液体培养基作为冷冻保护剂装载于冷冻管中，于400mmHg真空常温下处理30min，再经﹣20℃预冻6h，投入液氮保存60d后，40℃恒温水浴解冻30min，连香树定芽细胞相对存活率最高达95%以上。（3）中国红豆杉种子最优超低温保存条件是：经机械去壳的中国红豆杉种子加入8%DMSO，0℃超声（250W）浸泡处理10min，于﹣20℃预冻1h后投入液氮中冷冻保存72h，37℃恒温水浴中快速解冻1h，红豆杉种子的超低温保存活力最高，TTC还原量可达为2.4697±0.0221mg/g；而PVS4更有利于红豆杉种子的超低温长期保存。（4）影响超低温保存后细胞活力的主要因素：冷冻保护剂类型、冷冻方式和保存温度，都直接影响着细胞内冰晶的形成状态，从而引起对细胞超微结构的损伤。在不同的超低温冷冻保存条件下，细胞的活力和细胞超微结构的损伤程度不同，细胞超微结构损伤程度越大，细胞活力越弱，影响细胞活力主要由冷冻过程内细胞中形成的冰晶体数目、体积和形状。
石茹,王芳,王舰[6]（2011）在《玻璃化法超低温保存技术及其研究进展》文中进行了进一步梳理玻璃化法超低温保存技术是一门新兴的生物技术,是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法。现对玻璃化法超低温保存的原理、优点,对玻璃化法保存的程序、影响因素、关键技术的最新成果和研究进展进行综述,并对其今后的发展进行了展望。
徐飞[7]（2011）在《白首乌的组织培养及其生理生化分析》文中指出分别以白首乌的叶片、茎段、种子和根为外植体,通过愈伤诱导途径和直接诱导丛生芽途径建立了再生体系,获得的主要结果如下:1.愈伤组织诱导:不同培养基及激素组合对愈伤组织的形成影响很大,白首乌愈伤组织诱导阶段宜选用MS作基本培养基,而生长素2,4-D是愈伤组织形成的关键因素。以种子、茎段、叶片为外植体均诱导出愈伤组织,但是不同外植体在出愈率和愈伤生长方面差异较大,其中茎段是最理想的外植体;筛选出最佳诱导培养基为:2,4-D1.0 mg.L-1+6-BA1.5 mg.L-1 +NAA1.0 mg.L-1。2.愈伤组织分化成苗:将生长较好的愈伤组织转接到分化培养基上,愈伤组织逐渐变绿,并形成很多突起,进而形成多芽体。筛选出最佳分化培养基为KT2.0 mg·L-1+ NAA0.1 mg·L-1,分化率高达74.3%。再生苗接种到生根培养基上, 8号培养基生根效果最好,生根率高达89.5%,且根的长势强。最佳生根培养基为1/2MS+IAA0.2mg.L-1+ NAA 0.5mg.L-1。其中NAA是影响根的形态分化的关键因子。3.诱导丛生芽建立再生体系:以根、茎尖和带腋芽茎段为外植体都可以诱导出芽苗,诱导芽苗的最佳培养基为MS+KT1.0mg.L-1+NAA 0.1mg.L-1,诱导率最高为100.0%; MS+KT1.5 mg.L-1 +NAA0.05 mg.L-1是芽苗继代的最佳培养基,增殖系数最高,达到5.6。4.琼脂浓度对愈伤组织褐化和玻璃化的影响:琼脂浓度为8 g/L时,愈伤组织的增殖系数最高,可达4.9,愈伤组织生长最好。愈伤褐化率随着琼脂浓度的增加而增大,琼脂浓度超过8.5g/L,培养基较硬,不适合愈伤的生长,褐化率超过11.4%。琼脂浓度太低（7.5g/L）时愈伤组织容易玻璃化,玻璃化率可达24.5%。
李秉玲[8]（2010）在《芍药属植物超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究及花粉库的建立》文中研究表明超低温保存是一门应用于动植物种质保存及低温医学领域的新生物技术,是低温生物学的研究热点之一,但目前关于其保存机理尚不完全清楚,也限制了该技术的发展。芍药属植物是我国的传统花卉,资源丰富,但保存技术单一。本研究以牡丹花粉为材料,对花粉超低温保存前后的差异表达蛋白质进行了研究,以探索超低温保存分子作用机制；同时研究了芍药属植物超低温保存技术,为补充和完善该属资源保存提供新技术。具体结果如下：1.建立了花粉蛋白质双向电泳技术平台。采用TCA/丙酮沉淀法提取牡丹花粉可溶性蛋白质,80000Vhs进行第一向等电聚焦可以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。该蛋白质提取方法也适用于芍药、百合、玉兰以及梅花花粉可溶性蛋白质提取。2.获得了81个超低温保存差异表达的蛋白质。不同品种超低温保存、以及同一品种保存不同时间有共同的差异表达蛋白质,认为它们可能与花粉在超低温逆境下的应激反应和保护机制有关。3.对其中27个差异蛋白质进行质谱鉴定分析,有18个蛋白质得到有效鉴定。分属14种不同的蛋白质,其功能分别涉及能量代谢、渗透胁迫、细胞骨架、蛋白质加工等方面。4.建立了芍药属植物超低温保存花粉库。保存牡丹、芍药野生种／亚种8个,牡丹栽培品种76个,芍药栽培品种53个,花粉保存时间从1-6年不等。从2007-2009年,超低温花粉库中有22个芍药种／品种花粉应用于杂交育种工作,授粉花朵数超过1000朵,获得杂种苗500余株,为后期的研究奠定了基础。5.建立了牡丹胚的玻璃化超低温保存技术程序,采用该程序保存‘凤丹白’和‘大藤锦’胚,其再生成活率分别为92.3±2.6%和90.7+3.9%。牡丹胚超低温保存程序为：分离的成熟胚装入冻存管中,加入loading溶液室温装载40min,0℃低温下用PVS2溶液处理40min后,更换新鲜PVS2并迅速投入液氮保存,从液氮中取出后用30℃水浴化冻60s,unloading溶液重复洗涤两次,每次10min,然后接种到再生培养基上暗培养1周后进行正常培养。6.建立了芍药胚的玻璃化超低温保存技术程序,采用该程序保存‘红盘托金’,其再生成活率为96.2±3.1%；保存芍药、新疆芍药、块根芍药和川赤芍,其再生成活率分别为94.9±4.6%,88.8±4.5%,85.4±5.4%,82.0±5.0%。芍药胚的超低温保存程序为：分离的成熟直接采用loading溶液室温装载20min, 0℃低温下用PVS2溶液处理60min后,更换新鲜PVS2并迅速投入液氮保存,液氮取出后用40℃水浴化冻60s,unloading溶液重复洗涤两次,每次1 Omin,然后接种到再生培养基上进行培养。暗培养1周后转入正常培养程序。7.探索了牡丹、芍药休眠芽茎尖超低温保存技术。超低温保存后暗培养1-2周,‘凤丹白’茎尖成活率最高仅有9.5±1.2%,‘粉玉奴’茎尖最高成活率为20.4±7.7%。茎尖转入正常光照下培养,由于冻存后恢复生长慢,褐化严重,约20d后茎尖褐变或漂白死亡,没有再生成苗。有待进一步改进技术程序。本研究的新颖性在于1)首次大规模研究了超低温保存花粉的差异表达蛋白质,鉴定了14类18个超低温保存差异表达蛋白质；2)建立了芍药属植物超低温保存花粉库；超低温保存花粉应用于杂交育种获得500余株杂种苗；3)建立了芍药属植物胚的超低温保存技术程序。
李红民[9]（2009）在《匍匐翦股颖离体再生体系的建立及玻璃化超低温保存技术研究》文中研究表明匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）是一种很重要的多年生冷地型草坪草,具有耐修剪、观赏性高等优点,常用于高尔夫球场果岭及高档草坪中。本研究探究了诱导匍匐翦股颖愈伤组织的最佳条件,建立了高频再生体系。并对匍匐翦股颖愈伤组织进行了玻璃化超低温保存,为匍匐翦股颖细胞工程和基因工程奠定了理论和实践基础,同时对匍匐翦股颖属种质资源长期保存提供了依据。主要研究结果如下:1.建立了匍匐翦剪股颖再生体系:分别以A-4、A-1、帕特三个品种成熟种子为外植体进行愈伤组织诱导,其中品种A-4的愈伤组织诱导率最高,可达74.7%;2,4-D是影响愈伤组织诱导的最重要激素,以4 mg/L为宜,愈伤组织诱导率为73.2%;在MS+4mg/L2,4-D+0.3mg/L6-BA+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中可显着提高愈伤组织诱导率,愈伤组织诱导率可达78.6%;继代培养条件:MS+2mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA +0.3mg/LABA+ 500 mg/L水解酪蛋白中对愈伤组织进行继代培养,胚性愈伤组织发生率可达36.8%;芽分化:在基本培养基中添加2mg/L 6-BA,芽的分化率在80%以上;根的诱导:在1/2MS培养基中添加0.5 mg/LNAA;2.探索了玻璃化超低温保存体系:将继代两次的愈伤组织在4℃低温度下预培养5天,常温下用装载液（2mol/l甘油+0.4 mol/l蔗糖）过渡10min,再于0℃下用玻璃化溶液PVS2处理50min,换成新鲜的PVS2迅速投入液氮中保存一小时以上,取出后在30℃水浴中化冻,用MS+1.0mol/l蔗糖溶液洗涤3次,每次10min,细胞存活率可达85.6%。3.超低温前后愈伤组织,过氧化物酶同工酶酶谱没有发生变化,染色体数目没有改变。该研究结果为匍匐翦股颖属植物种质资源的长期保存提供了基础数据。
程斐[10]（2009）在《二乔刺槐愈伤组织超低温保存及植株再生》文中认为植物材料在超低温保存过程中,其物质代谢、能量代谢及其它生命活动降至最低限度,从而避免了因长时间保存而带来的变异可能性。因此,超低温保存成为长期和稳定保存植物种质的有效方法之一。试验以木本植物二乔刺槐离体培养的愈伤组织作为材料,对其超低温保存方法进行研究,筛选出了适合的冻存程序,得到了50%以上的二乔刺槐愈伤组织成活率,并成功利用化冻后的二乔刺槐愈伤组织进行了体外植株再生。主要实验结果如下:1.利用程序降温仪对二乔刺槐愈伤组织进行冻存时发现样品降温速率和冷槽降温速率之间存在一定偏差,采用较慢的降温速率和适当时间的低温停留可以缩小这一偏差,偏差的缩小有利于样品成活率的提高。2.采用4种冰冻保护剂对二乔刺槐愈伤组织进行超低温保存,结果发现以冰冻保护剂(MS+10%DMSO+0.5mol·L-1蔗糖)处理下的愈伤组织冻后活力最高,相对成活率可达91.81%。冰冻保护剂(MS+10%DMSO+0.5mol-1蔗糖)可以作为二乔刺槐愈伤组织超低温保存较适宜的冰冻保护剂。3.降温过程中降温速率和低温停留时间会显着影响二乔刺槐愈伤组织活力,某一温度段的降温方式如果不适宜将会显着影响后续结果。适宜于二乔刺槐愈伤组织的控速降温超低温保存程序为:冷槽以1℃·min-1的速率降温至-7℃停留1h后,再以0.1℃·min-1的冷却速率将样品冷却至-20℃,然后平衡1h。接下来以0.3℃·min-1的冷却速率将样品冷却至-40℃再投入液氮。4.化冻后的愈伤组织用液体培养基(MS+5.0 mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖)洗涤2次,暗培养2周后转于光下。冻存后的愈伤组织以旧有愈伤组织表面长出活力旺盛的新生愈伤组织颗粒继而生长的方式恢复生长,新生的愈伤组织可以顺利出芽并进行体外植株再生,再生的植株与正常植株形态上无明显差异。取出生根培养30d的健壮苗进行炼苗,其成活率可达90%以上。
二、水母雪莲愈伤组织超低温保存条件的初探（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水母雪莲愈伤组织超低温保存条件的初探（论文提纲范文）
（1）东北红豆杉细胞高效诱导紫杉醇工艺优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究的目的与意义 |
| 1.2 获取紫杉醇方法的研究进展 |
| 1.2.1 直接提取法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 真菌发酵法 |
| 1.2.4 细胞培养法 |
| 1.3 光环境对愈伤组织诱导影响的研究现状 |
| 1.3.1 红豆杉愈伤组织的诱导 |
| 1.3.2 光环境对植物愈伤组织诱导的影响 |
| 1.4 植物种质资源离体保存方法的研究现状 |
| 1.4.1 常温保存法 |
| 1.4.2 缓慢生长保存法 |
| 1.4.3 超低温保存法 |
| 1.5 红豆杉高产细胞株系的筛选 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 1.6.1 主要内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 光环境对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 光质对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.2 光强对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.3 光周期对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.4 东北红豆杉愈伤组织诱导的环境条件优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 东北红豆杉愈伤组织超低温保存试验 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 预培养条件对愈伤组织细胞相对存活率的影响 |
| 3.3.2 影响愈伤组织细胞相对存活率的预培养条件优化 |
| 3.3.3 冷冻保护剂对愈伤细胞相对存活率的影响 |
| 3.3.4 冷冻方法对愈伤组织细胞相对存活率的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 东北红豆杉愈伤组织继代培养及高产细胞株系筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 紫杉醇的标准曲线绘制 |
| 4.3.2 愈伤组织在继代过程中的性状描述 |
| 4.3.3 愈伤组织鲜重及紫杉醇含量受继代数的影响 |
| 4.3.4 不同克隆细胞的生长状况 |
| 4.3.5 克隆细胞筛选情况分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 东北红豆杉细胞悬浮培养条件的优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料与试剂 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蔗糖浓度对细胞生长及紫杉醇含量的影响 |
| 5.3.2 中期补加糖分对细胞生长及紫杉醇含量的影响 |
| 5.3.3 悬浮培养温度对细胞紫杉醇含量的影响 |
| 5.3.4 摇床转速对细胞紫杉醇含量的影响 |
| 5.3.5 悬浮培养条件的优化 |
| 5.3.6 诱导物质对细胞生长和紫杉醇含量的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间学术成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（2）防风愈伤组织超低温保存及其玻璃化现象研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 试管苗玻璃化的定义 |
| 1.2 试管苗玻璃化现象发生的普遍性 |
| 1.3 玻璃化苗的一般特征 |
| 1.3.1 玻璃苗的形态变化 |
| 1.3.2 玻璃苗的生理生化变化 |
| 1.3.2.1 基本成分含量变化 |
| 1.3.2.2 酶与激素含量变化 |
| 1.3.2.3 各元素含量变化 |
| 1.4 影响玻璃化发生的因素 |
| 1.4.1 材料 |
| 1.4.2 琼脂 |
| 1.4.3 碳源 |
| 1.4.4 激素 |
| 1.4.5 封口材料 |
| 1.4.6 培养条件 |
| 1.4.7 培养基 |
| 1.5 玻璃化苗的发生机制 |
| 1.6 防治玻璃化的综合措施 |
| 1.7 植物愈伤组织的超低温保存概述 |
| 1.7.1 愈伤组织概念 |
| 1.7.2 愈伤组织形成的因素 |
| 1.7.2.1 培养基 |
| 1.7.2.2 PH |
| 1.7.2.3 植物激素 |
| 1.7.2.4 温度 |
| 1.7.2.5 碳源 |
| 1.7.3 愈伤组织的培养 |
| 1.7.3.1 继代培养 |
| 1.7.3.2 分化培养 |
| 1.7.4 超低温保存概念 |
| 1.7.5 愈伤组织超低温保存研究进展 |
| 1.7.6 愈伤组织超低温保存的基本程序 |
| 1.7.6.1 材料的选择 |
| 1.7.6.2 预处理 |
| 1.7.6.3 冻前处理 |
| 1.7.6.4 化冻及洗涤 |
| 1.8 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 试验设计 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.4.1 愈伤组织的诱导 |
| 2.4.2 愈伤组织的继代培养 |
| 2.4.3 不定芽的诱导 |
| 2.4.4 再生苗的生根培养 |
| 2.4.5 试管苗的驯化移栽 |
| 2.4.6 试管苗生理生化指标测定 |
| 2.4.7 环境因子对试管苗玻璃化的影响 |
| 2.5 防风愈伤组织的玻璃化法超低温保存 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 防风再生体系的建立 |
| 3.1.1 不同外植体愈伤组织的生长速度及形态 |
| 3.1.2 激素组合对愈伤继代的影响 |
| 3.1.3 激素组合对不定芽诱导的影响 |
| 3.1.4 激素组合对生根的影响 |
| 3.1.5 移栽基质对试管苗成活率的影响 |
| 3.2 防风试管苗玻璃化成因研究 |
| 3.2.1 玻璃苗与正常苗在形态特征上的差异 |
| 3.2.2 玻璃苗与正常苗在生理指标上的差异 |
| 3.2.3 玻璃苗与正常苗的过氧化物酶电泳分析 |
| 3.2.4 环境因子对试管苗玻璃化率的影响 |
| 3.2.4.16 -BA 浓度 |
| 3.2.4.2 琼脂浓度 |
| 3.2.4.3 蔗糖浓度 |
| 3.2.4.4 光照 |
| 3.2.4.5 愈伤继代次数 |
| 3.2.5 防风试管苗玻璃化的逆转与培养条件优化 |
| 3.2.5.1 逆转措施对不同程度玻璃化苗的影响 |
| 3.2.5.2 培养条件的优化 |
| 3.3 愈伤组织玻璃化法超低温保存 |
| 3.3.1 预培养不同时间及组合对愈伤存活率的影响 |
| 3.3.2 装载时间对愈伤存活率的影响 |
| 3.3.3 脱水时间对愈伤存活率的影响 |
| 3.3.4 洗涤剂对愈伤存活率的影响 |
| 3.3.5 暗培养时间对愈伤再培养成活率的影响 |
| 3.3.6 愈伤组织冻后恢复及植株再生 |
| 4 讨论 |
| 4.1 培养基和外植体对组培的影响 |
| 4.2 生长调节剂的影响 |
| 4.3 试管苗玻璃化 |
| 4.4 玻璃化法超低温保存 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 图版说明 |
| Explanation of plates |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）水母雪莲黄酮合成酶FNSⅡ基因克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 雪莲概述 |
| 1.1.1 雪莲的种类及形态特征 |
| 1.1.2 雪莲的药用成分 |
| 1.1.3 雪莲的药用价值 |
| 1.1.4 野生雪莲资源匮乏 |
| 1.1.5 雪莲生物学研究 |
| 1.2 类黄酮次生代谢研究 |
| 1.2.1 类黄酮的种类 |
| 1.2.2 植物类黄酮生物合成途径研究进展 |
| 1.2.3 水母雪莲类黄酮途径及代谢研究 |
| 1.2.4 黄酮合成酶 FNS 基因生物学研究进展 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 第二章 水母雪莲 SMFNS II 基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 水母雪莲 Total RNA 提取与检测 |
| 2.2.3 cDNA 第一链的合成 |
| 2.2.4 保守序列片段克隆 |
| 2.2.5 5’- & 3’- RACE 反应 |
| 2.2.6 SmFNS II 基因全长扩增 |
| 2.2.7 T 载体连接及测序 |
| 2.2.8 基因序列的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SmFNS II 基因全长克隆 |
| 2.3.2 SmFNS II 基因序列分析 |
| 2.3.3 水母雪莲 SmFNS II 氨基酸序列比对 |
| 2.3.4 SmFNS II 基因的生物信息学分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水母雪莲 SMFNS II 基因表达分析 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 Total RNA 提取 |
| 3.2.2 cDNA 合成 |
| 3.2.3 荧光实时定量 PCR 分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 第四章 水母雪莲 SMFNS II 基因原核表达 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 载体与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 水母雪莲 SmFNS II 基因原核表达载体构建 |
| 4.2.3 E. coli BL21(DE3)原核表达的诱导 |
| 4.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pET-SmFNSII 载体构建 |
| 4.3.2 原核表达结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 水母雪莲 SMFNS II 基因遗传转化 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 材料与菌株 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 水母雪莲 SmFNS II 基因植物表达载体的构建 |
| 5.2.3 遗传转化夏堇 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 pBI121-SmFNSII 载体构建 |
| 5.3.2 夏堇遗传转化 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）百合（Lilium）离体植株再生及超低温保存研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 百合组织培养研究进展 |
| 1.1.1 百合的再生途径 |
| 1.1.2 百合器官发生途径再生体系的研究进展 |
| 1.1.3 百合体细胞胚发生途径再生体系的研究进展 |
| 1.1.4 百合离体再生植株的遗传稳定性鉴定 |
| 1.2 植物超低温保存的研究概况 |
| 1.2.1 超低温保存的主要方法 |
| 1.2.2 基于玻璃化的超低温保存方法 |
| 1.2.3 超低温保存后再生植株遗传稳定性鉴定 |
| 1.3 百合超低温保存研究进展 |
| 1.3.1 百合茎尖超低温保存 |
| 1.3.2 百合胚性愈伤组织超低温保存 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 第二章 百合叶片不定芽再生体系的建立 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试管材料的建立 |
| 2.2.2 百合叶片不定芽的诱导 |
| 2.2.3 叶片不定芽诱导的组织学观察 |
| 2.2.4 叶片不定芽再生植株的遗传稳定性鉴定 |
| 2.2.5 试验设计与数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 影响叶片不定芽分化的因素 |
| 2.3.2 组织学观察 |
| 2.3.3 叶片不定芽再生植株遗传稳定性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 百合鳞茎薄层体细胞胚再生体系的建立 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试管材料的建立 |
| 3.2.2 鳞茎薄层组织的切取以及胚性愈伤组织的诱导 |
| 3.2.3 胚性愈伤组织的增殖 |
| 3.2.4 体细胞胚植株再生 |
| 3.2.5 应用于其他多个百合品种 |
| 3.2.6 鳞茎薄层胚性愈伤组织诱导的组织学观察 |
| 3.2.7 体细胞胚再生植株的遗传稳定性鉴定 |
| 3.2.8 试验设计与数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NAA 和 KT 对于胚性愈伤诱导的影响 |
| 3.3.2 不同激素的诱导培养基形成胚性愈伤组织的比较 |
| 3.3.3 TDZ 浓度对胚性愈伤组织继代的影响 |
| 3.3.4 其他 4 个百合品种上的应用 |
| 3.3.5 鳞茎薄层诱导胚性愈伤组织的组织学观察 |
| 3.3.6 体细胞胚再生植株遗传稳定性的 ISSR 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 百合茎尖超低温保存体系的建立 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要药品及试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 小滴玻璃化法茎尖超低温保存体系的建立 |
| 4.2.2 超低温保存后成活细胞的定位 |
| 4.2.3 超低温保存后再生植株的遗传稳定性鉴定 |
| 4.2.4 试验设计与数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 预培养的效果 |
| 4.3.2 加载液的效果 |
| 4.3.3 PVS2 处理时间的效果 |
| 4.3.4 其他百合品种上的应用 |
| 4.3.5 冷冻茎尖的成活细胞定位 |
| 4.3.6 再生植株遗传稳定性的 ISSR 鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 百合茎尖超低温保存后体细胞胚再生与茎再生研究 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 百合茎尖的小滴玻璃化法超低温保存体系 |
| 5.2.2 超低温保存后茎的直接再生途径 |
| 5.2.3 超低温保存后的体细胞胚再生途径 |
| 5.2.4 驯化和移栽 |
| 5.2.5 试验设计与数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 茎尖大小对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 5.3.2 不同浓度的 KT 对胚性愈伤组织诱导的影响 |
| 5.3.3 不同浓度的 TDZ 对胚性愈伤组织增殖的影响 |
| 5.3.4 其他百合品种上的应用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 百合胚性愈伤组织超低温保存的初步研究 |
| 6.1 材料和试剂 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 主要药品及试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 预试验 |
| 6.2.2 西伯利亚百合胚性愈伤组织的玻璃化法超低温保存 |
| 6.2.3 成活胚性愈伤组织的增殖 |
| 6.2.4 植株再生 |
| 6.2.5 试验设计与数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 预培养时间对胚性愈伤组织成活的影响 |
| 6.3.2 PVS2 处理时间对胚性愈伤组织成活的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）超低温保存秦巴山区三种濒危植物组织细胞技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 超低温保存技术研究进展 |
| 1.1.1 超低温保存技术 |
| 1.1.2 超低温保存技术的原理 |
| 1.1.3 植物细胞超低温保存技术的关键技术 |
| 1.2 超低温技术在食品领域中的应用 |
| 1.2.1 超低温冷冻粉碎技术 |
| 1.2.2 液氮速冻技术 |
| 1.2.3 超低温保存技术 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 第二章 秦岭冷杉种子胚的超低温保存技术研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 秦岭冷杉种子萌发特性测定 |
| 2.2.2 冷冻保护剂类型对种子胚细胞成活率的影响 |
| 2.2.3 秦岭冷杉种子胚超低温条件优化 |
| 2.2.4 种子胚细胞活力的检测 |
| 2.2.5 秦岭冷杉种子胚玻璃化保存后超微结构观察 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 种子萌发特性 |
| 2.3.2 单因素法筛选冷冻保护剂试验结果 |
| 2.3.3 秦岭冷杉种子胚超低温保存条件的优化试验结果 |
| 2.3.4 两种玻璃化保护剂处理秦岭冷杉后的超微结构比较结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 连香树定芽玻璃化超低温保存技术研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 主要设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 连香树定芽前处理 |
| 3.2.2 连香树定芽细胞玻璃化保存条件的优化 |
| 3.2.3 连香树定芽细胞相对存活率测定 |
| 3.2.4 连香树定芽细胞冻存后的微结构观察 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 玻璃化条件对连香树定芽细胞存活率的影响 |
| 3.3.2 超微结构变化和细胞活力高低的关系 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 中国红豆杉种子的超低温保存技术研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 中国红豆杉种子预处理 |
| 4.2.2 冷冻保护剂类型的优化 |
| 4.2.3 冷冻保护剂处理方式的优化 |
| 4.2.4 冷冻保护剂作用时间的优化 |
| 4.2.5 冷冻方式的优化 |
| 4.2.6 解冻方式的优化 |
| 4.2.7 冻存时间对中国红豆杉种子活性的影响 |
| 4.2.8 种子活力检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 冷冻保护剂对冷冻后中国红豆杉种子活力的影响 |
| 4.3.2 冷冻保护剂处理方式对冻存后中国红豆杉种子活力的影响 |
| 4.3.3 冷冻方式对冻存后中国红豆杉种子活力的影响 |
| 4.3.4 解冻方式对冻存后中国红豆杉活力的影响 |
| 4.3.5 保存时间对中国红豆杉种子活力的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）白首乌的组织培养及其生理生化分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物组织培养 |
| 1.1.1 植物组织培养的理论基础 |
| 1.1.2 植物组织培养操作程序的完善 |
| 1.1.3 植物组织培养的快速发展 |
| 1.2 组织培养技术在药用植物上的应用 |
| 1.2.1 在植物快速繁殖和脱毒上的应用 |
| 1.2.2 利用组织培养材料生产次生代谢产物 |
| 1.2.3 植物种质资源的保存 |
| 1.2.4 药用植物遗传改良与育种 |
| 1.3 药用植物组织培养存在的问题 |
| 1.3.1 组织培养机理有待于进一步研究 |
| 1.3.2 基因型限制仍是组织培养的一大难题 |
| 1.3.3 操作复杂，效率不高 |
| 1.3.4 降低成本，加快成果的应用推广 |
| 1.3.5 扩展植物组培次生代谢产物生产规模，加强生物制品的开发 |
| 1.3.6 组培中污染问题及控制 |
| 1.3.7 组培中褐化问题及控制 |
| 1.3.8 组培中玻璃化问题及控制 |
| 1.4 展望 |
| 1.5 白首乌的药用价值 |
| 1.5.1 药用成分 |
| 1.5.2 营养成分 |
| 1.5.3 药理作用 |
| 1.5.3.1 抗肿瘤和免疫调节作用 |
| 1.5.3.2 抗衰老作用 |
| 1.5.3.3 对心脏与肝脏的保护作用 |
| 1.5.3.4 促进毛发生长作用 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要药品、试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基本培养基的筛选 |
| 2.2.2 愈伤组织分化成苗建立再生体系 |
| 2.2.2.1 愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2.2 愈伤组织的继代培养 |
| 2.2.2.3 不定芽的诱导 |
| 2.2.2.4 再生苗的生根培养 |
| 2.2.3 顶芽和腋芽分化成苗途径 |
| 2.2.3.1 初代培养 |
| 2.2.3.2 继代培养 |
| 2.2.3.3 根的诱导 |
| 2.2.4 离体培养过程中生理生化分析 |
| 2.2.4.1 琼脂浓度对愈伤组织的影响 |
| 2.2.4.2 生理生化指标测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基本培养基对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2 愈伤组织分化成苗建立再生体系 |
| 3.2.1 愈伤组织的诱导 |
| 3.2.1.1 不同激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.1.2 不同激素组合对茎段愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.1.3 不同激素组合对种子愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.1.4 不同外植体愈伤组织的生长速度及形态特征比较 |
| 3.2.2 植物生长调节剂对愈伤组织继代的影响 |
| 3.2.3 不定芽的诱导 |
| 3.2.4 生根培养 |
| 3.3 直接诱导丛芽成苗途径 |
| 3.3.1 初代培养 |
| 3.3.1.1 细胞分裂素与生长素配比对初代培养的影响 |
| 3.3.1.2 不同外植体对初代培养的影响 |
| 3.3.2 继代培养 |
| 3.3.3 根的诱导 |
| 3.4 离体培养过程中生理生化分析 |
| 3.4.1 琼脂浓度对愈伤组织褐化和玻璃化的影响 |
| 3.4.2 不同类型愈伤组织比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同外植体的影响 |
| 4.2 生长调节剂的影响 |
| 4.3 愈伤组织玻璃化与褐化 |
| 4.4 不同类愈伤组织生理生化比较 |
| 4.5 两种再生体系比较 |
| 4.6 进一步研究设想 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 图版说明 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 |
（8）芍药属植物超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究及花粉库的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 引言 |
| 1.1 植物种质资源超低温保存技术研究进展 |
| 1.1.1 超低温保存基本原理 |
| 1.1.1.1 超低温保存理论 |
| 1.1.1.2 超低温保存技术原理 |
| 1.1.2 超低温保存技术研究进展 |
| 1.1.2.1 程序降温法(CONTROLLED-RATE COOLING) |
| 1.1.2.2 脱水法(DEHYDRATION) |
| 1.1.2.3 玻璃化法(VITRIFICATION) |
| 1.1.3 超低温保存技术在其他领域的应用 |
| 1.1.4 超低温保存研究的热点问题——机理研究进展 |
| 1.1.4.1 如何实现超低温保存后的高存活率 |
| 1.1.4.2 超低温保存技术的可靠性问题 |
| 1.1.4.3 超低温能否真的实现永久保存 |
| 1.2 芍药属植物种质资源保存现状 |
| 1.2.1 芍药属种质资源 |
| 1.2.2 我国芍药属植物种质资源保存现状 |
| 1.2.2.1 牡丹、芍药种质资源的原生境保存现状 |
| 1.2.2.2 牡丹、芍药种质资源的迁地保存 |
| 1.2.2.3 牡丹、芍药种质资源的离体保存 |
| 1.3 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.3.1 研究目的及意义 |
| 1.3.1.1 研究目的 |
| 1.3.1.2 研究意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 研究技术路线 |
| 2 超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 化学药品及试剂 |
| 2.1.2.1 化学药品 |
| 2.1.2.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.1.4.1 花粉含水量测定 |
| 2.1.4.2 花粉萌发率的测定 |
| 2.1.4.3 花粉的超低温保存 |
| 2.1.4.4 可溶性蛋白质样品制备方法的选择 |
| 2.1.4.5 蛋白质含量测定 |
| 2.1.4.6 不同提取方法所获可溶性蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 2.1.4.7 可溶性蛋白质的双向电泳 |
| 2.1.4.8 凝胶染色 |
| 2.1.4.9 凝胶扫描、分析 |
| 2.1.4.10 差异表达蛋白质点的质谱鉴定 |
| 2.1.4.11 生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 花粉蛋白质双向电泳技术的优化 |
| 2.2.1.1 不同提取方法提取牡丹花粉可溶性蛋白质效果对比 |
| 2.2.1.2 不同等点聚焦参数对电泳效果的影响 |
| 2.2.1.3 IPG胶条PH范围及长度对双向电泳效果的影响 |
| 2.2.2 超低温保存对花粉差异表达蛋白质的影响 |
| 2.2.2.1 超低温保存‘凤丹白’、‘大藤锦’花粉萌发率 |
| 2.2.2.2 超低温保存对‘凤丹白’花粉可溶性蛋白质的影响 |
| 2.2.2.3 超低温保存对‘大藤锦’花粉可溶性蛋白质的影响 |
| 2.2.2.4 两个品种花粉超低温保存差异表达蛋白质对比分析 |
| 2.2.3 差异表达蛋白质的质谱鉴定结果 |
| 2.2.3.1 差异表达蛋白质的质谱鉴定结果 |
| 2.2.3.2 超温胁迫条件下差异表达蛋白质的功能分类 |
| 2.2.3.4 差异表达蛋白质的细胞内定位 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 稳定的双向电泳技术平台的建立 |
| 2.3.2 超低温保存对花粉蛋白质表达的影响 |
| 2.3.3 超低温保存可能的蛋白质作用机制 |
| 2.3.3.1 超低温保存花粉细胞骨架的稳定性 |
| 2.3.3.2 超低温保存花粉渗透调节 |
| 2.3.3.3 参与氧自由基清除的蛋白 |
| 2.3.3.4 参与糖代谢和能量代谢的蛋白 |
| 2.3.3.5 其它蛋白质的表达变化 |
| 2.4 小结 |
| 3 芍药属超低温花粉库的建立及应用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 花粉的采集 |
| 3.2.2 花粉萌发率的测定 |
| 3.2.3 花粉含水量的测定 |
| 3.2.4 花粉保存方法对比试验 |
| 3.2.5 人工杂交授粉试验 |
| 3.2.6 种子采收及播种 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 芍药属植物174个(种/品种)花粉萌发率测定 |
| 3.3.2 不同低温保存方法对花粉萌发率的影响 |
| 3.3.3 采集年份对花粉超低温保存效果的影响 |
| 3.3.4 LN2保存时间对花粉萌发率的影响 |
| 3.3.5 芍药属植物超低温花粉库的建立 |
| 3.3.6 超低温花粉库花粉授粉杂交结实率情况 |
| 3.3.7 超低温花粉库中花粉在杂交育种中的应用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 牡丹、芍药胚及休眠芽茎尖的玻璃化超低温保存研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料和试剂 |
| 4.1.1.1 试验材料 |
| 4.1.1.2 试剂 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 牡丹、芍药胚的玻璃化法超低温保存程序研究 |
| 4.1.2.2 胚的超低温保存技术程序试验设计 |
| 4.1.2.3 牡丹、芍药胚苗的再生与移栽 |
| 4.1.2.4 牡丹、芍药休眠芽茎尖的玻璃化法超低温保存程序研究 |
| 4.1.2.5 茎尖超低温保存技术程序试验设计 |
| 4.1.2.6 牡丹、芍药休眠芽茎尖的再生与成活率统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 牡丹、芍药胚的玻璃化超低温保存研究结果 |
| 4.2.1.1 牡丹、芍药胚的玻璃化超低温保存程序研究 |
| 4.2.1.2 超低温保存胚的再生 |
| 4.2.1.3 玻璃化超低温保存程序的适用性研究 |
| 4.2.2 牡丹、芍药茎尖的玻璃化超低温保存 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 超低温保存方法对材料保存效果的影响 |
| 4.3.2 材料大小对保存效果的影响 |
| 4.3.3 预培养对保存效果的影响 |
| 4.3.4 玻璃化溶液处理时间对超低温保存效果的影响 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 建议与展望 |
| 参考文献 |
| 图版 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（9）匍匐翦股颖离体再生体系的建立及玻璃化超低温保存技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩写词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 匍匐翦股颖概述 |
| 2 植物组织培养概述 |
| 2.1 组织培养及其理论基础 |
| 2.2 植物组织培养的应用及意义 |
| 2.2.1 植物育种 |
| 2.2.2 植物离体快繁和病毒脱除 |
| 2.2.3 植物次生代谢产物生产 |
| 2.2.4 在遗传、生理、生化和病理等研究上的应用 |
| 2.2.5 种质资源保存 |
| 3 玻璃化超低温保存的研究进展 |
| 4 玻璃化超低温保存原理 |
| 5 影响超低温保存的主要因素 |
| 5.1 材料的选择 |
| 5.2 冷冻前的预培养 |
| 5.3 装载 |
| 5.4 脱水 |
| 5.5 冻存 |
| 5.6 化冻及洗涤 |
| 5.7 再培养 |
| 5.8 材料生活力测定 |
| 6 玻璃化超低温保存技术在植物种质资源保存中的意义 |
| 6.1 保持细胞培养物的遗传稳定性 |
| 6.2 长期保存植物的种质资源 |
| 6.3 长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质 |
| 第二章 匍匐翦股颖离体再生体系的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 培养条件 |
| 2.2 无菌材料培养 |
| 2.3 形态观察与统计分析 |
| 2.4 试验设计 |
| 2.4.1 愈伤组织诱导 |
| 2.4.2 愈伤组织的继代培养 |
| 2.4.3 愈伤组织的分化培养 |
| 2.4.4 生根培养 |
| 2.4.5 再生植株的炼苗与移栽 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 愈伤组织的诱导 |
| 3.1.1 不同品种种子对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.3 不同浓度2,4-D 对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.4 不同浓度2,4-D 与6-BA 配比对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2 愈伤组织的继代与分化 |
| 3.2.1 不同激素浓度配比对愈伤组织继代的影响 |
| 3.2.2 不同浓度6-BA 对芽分化的影响 |
| 3.2.3 不同蔗糖浓度对愈伤组织分化的影响 |
| 3.2.4 不同继代时间对芽分化率的影响 |
| 3.3 再生植株的生根与移栽 |
| 3.3.1 再生植株的生根培养 |
| 3.3.2 组培苗的移栽 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 5.1 关于愈伤组织外植体的选择 |
| 5.2 关于外源激素的影响 |
| 5.3 关于愈伤组织继代增殖 |
| 第三章匍匐翦股颖愈伤组织玻璃化超低温保存技术研究 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 玻璃化超低温保存技术路线 |
| 2.1.1 正交试验 |
| 2.1.2 单因子试验 |
| 2.1.3 超低温保存后恢复生长 |
| 2.1.4 TTC 法检测细胞存活率 |
| 2.1.5 遗传稳定性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用正交试验优化超低温保存体系 |
| 3.2 单因子试验 |
| 3.2.1 预培养时间和培养基成分对匍匐翦股颖愈伤组织存活率的影响 |
| 3.2.2 不同装载液类型和装载时间对匍匐翦股颖愈伤组织存活率的影响 |
| 3.2.3 PV52 脱水时间对超低温后愈伤组织存活率的影响 |
| 3.2.4 在液氮中处理不同时间对愈伤组织存活率的影响 |
| 3.2.5 洗涤条件对愈伤组织存活率的影响 |
| 3.2.6 光照与植物生长调节物质对玻璃化超低温保存后愈伤组织生长的影响. |
| 3.2.7 超低温保存后匍匐翦股颖愈伤组织诱导再生成苗 |
| 3.3 遗传性状分析 |
| 3.3.1 超低温保存前后匍匐翦股颖愈伤组织过氧化物酶同工酶电泳图谱分析 |
| 3.3.2 超低温保存前后匍匐翦股颖再生植株染色体数目检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 玻璃化法超低温保存匍匐翦股颖愈伤组织过程中影响因素 |
| 4.1.1 预培养对成活率的影响 |
| 4.1.2 装载液类型和处理时间对细胞存活率的影响 |
| 4.1.3 PVS2 脱水时间对愈伤组织存活率的影响 |
| 4.1.4 洗涤条件对愈伤组织存活率的影响 |
| 4.1.5 生长停滞对愈伤组织恢复培养的影响 |
| 4.2 超低温保存前后对匍匐翦股颖愈伤组织遗传性状的影响 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（10）二乔刺槐愈伤组织超低温保存及植株再生（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 超低温保存的概念及其基本原理 |
| 1.1.1 超低温保存的概念 |
| 1.1.2 超低温保存的基本原理 |
| 1.2 超低温保存过程中细胞损伤机理 |
| 1.2.1 降温过程中细胞损伤机理 |
| 1.2.2 复温过程中细胞损伤机理 |
| 1.3 超低温保存方法分析 |
| 1.3.1 超低温保存方法的两种派别及其分支 |
| 1.3.2 超低温保存方法两派的异同 |
| 1.3.2.1 两派的相同之处 |
| 1.3.2.2 两派的不同之处 |
| 1.3.3 超低温保存方法两派的优缺点 |
| 1.3.3.1 慢冻法的优缺点 |
| 1.3.3.2 玻璃化法的优缺点 |
| 1.4 超低温保存冻存前后主要步骤的意义 |
| 1.4.1 材料的选择 |
| 1.4.2 预处理 |
| 1.4.3 使用冰冻保护剂 |
| 1.4.4 恢复培养 |
| 1.5 保存材料的遗传稳定性 |
| 1.6 近年国内外植物种质资源超低温保存研究情况分析 |
| 1.7 小结与展望 |
| 2 引言 |
| 3 二乔刺槐愈伤组织的超低温保存 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 保护剂处理 |
| 3.2.2 实际降温曲线的获得 |
| 3.2.3 程序化冻存 |
| 3.2.4 材料化冻 |
| 3.2.5 冷冻材料的恢复培养及植株再生 |
| 3.2.6 TTC法测细胞活力 |
| 3.2.7 成活率的计算方法 |
| 3.3 数据分析方法 |
| 3.4 试验仪器 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 冷槽与样品降温不同步对二乔刺槐愈伤组织活力的影响 |
| 3.5.2 保护剂种类及浸泡时间对愈伤组织活力的影响 |
| 3.5.3 温度段0℃→-10℃的降温方式对愈伤组织活力的影响 |
| 3.5.4 温度段-10℃→-40℃的降温方式对愈伤组织活力的影响 |
| 3.5.5 降温终点温度对愈伤组织活力的影响 |
| 3.5.6 液氮中保存时间对成活率的影响 |
| 3.5.7 暗培养时间对冻后愈伤组织恢复生长的影响 |
| 3.5.8 超低温保存后材料的恢复生长过程 |
| 3.5.9 植株再生情况 |
| 3.6 结论与讨论 |
| 3.6.1 程序降温仪实际应用中样品温度与冷槽温度的差异 |
| 3.6.2 控速降温超低温保存体系的建立 |
| 3.6.3 愈伤组织超低温保存后的恢复生长过程 |
| 3.6.4 结论与研究展望 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 图版与图版说明 |
四、水母雪莲愈伤组织超低温保存条件的初探（论文参考文献）
- [1]东北红豆杉细胞高效诱导紫杉醇工艺优化研究[D]. 李纯. 吉林大学, 2016(01)
- [2]防风愈伤组织超低温保存及其玻璃化现象研究[D]. 马晓菲. 山东农业大学, 2014(12)
- [3]水母雪莲黄酮合成酶FNSⅡ基因克隆和功能分析[D]. 王亚杰. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [4]百合（Lilium）离体植株再生及超低温保存研究[D]. 殷振芳. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [5]超低温保存秦巴山区三种濒危植物组织细胞技术研究[D]. 程利红. 西北农林科技大学, 2012(12)
- [6]玻璃化法超低温保存技术及其研究进展[J]. 石茹,王芳,王舰. 北方园艺, 2011(24)
- [7]白首乌的组织培养及其生理生化分析[D]. 徐飞. 山东农业大学, 2011(08)
- [8]芍药属植物超低温保存花粉的差异表达蛋白质研究及花粉库的建立[D]. 李秉玲. 北京林业大学, 2010(08)
- [9]匍匐翦股颖离体再生体系的建立及玻璃化超低温保存技术研究[D]. 李红民. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [10]二乔刺槐愈伤组织超低温保存及植株再生[D]. 程斐. 河南农业大学, 2009(06)