一、我国首次利用显微操纵仪制备成功转基因小鼠（论文文献综述）
葛焰[1]（2021）在《利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起博模型》文中研究表明目的:电刺激是人工控制心脏搏动频率的标准技术,但在实验研究中,这种方法有较大的局限性,如局部电解效应、刺激频率和时长受限、只能对目标范围内的所有细胞进行刺激、不能选择性作用于心肌细胞等。另一方面,实验研究需要获得心肌细胞,传统的心肌细胞分离技术多采用特殊的灌流装置进行逆行大血管灌流来分离心肌细胞,需要的设备要求精密,对分离心肌细胞技术要求过高,需要进行专业培训,有大量需要克服的技术问题,这严重阻碍了实验进程。本研究对基于光遗传学的光控心脏起搏技术进行了实验论证,并且探索了一种更简便易行的心肌分离技术的方法。这在心肌电生理学特别是心律失常研究中有着非常重要的应用价值。方法:1、杂交繁殖转基因小鼠:（1）研究使用的αMHC-Cre转基因小鼠为αMHC启动子驱动的心肌特异性Cre重组酶表达小鼠,ChR2（H134R）-td Tomato转基因小鼠在通用型CAG启动子和ChR2（H134R）-td Tomato融合基因之间插入了两个LoxP位点和STOP终止序列,在没有Cre重组酶的情况下ChR2（H134R）-tdTomato不表达。将两种转基因小鼠杂交后,在心肌细胞中表达的Cre重组酶对两个LoxP位点进行剪切和重组,中间的STOP序列被切除,ChR2（H134R）-tdTomato融合蛋白得以表达。将实验小鼠分为实验组αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+组（8-12周）和对照组:αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+（8-12周）、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-（8-12周）;（2）转基因小鼠基因型鉴定;（3）小鼠心脏荧光表型鉴定。2、采用特定频率的蓝光刺激使心肌细胞特异性表达光激活阳离子通道channelrhodopsin-2（Ch R2）的转基因小鼠心肌细胞膜电位去极化,从而引发动作电位并控制心脏搏动。3、用一种简便的无需Langendorff灌流的方法分离成年小鼠心肌细胞。结果:1、通过将αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠进行杂交,本研究获得了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+（心肌特异性表达Cre和ChR2-tdTomato）、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-（心肌特异性表达Cre但不携带ChR2-tdTomato基因）和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+（不表达Cre,携带Ch R2-td Tomato基因但由于上游终止序列的存在而无法表达）三种基因型的小鼠。2、（1）转基因小鼠心脏荧光表型:在561 nm LED光源的激发下,αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠的心脏发出明亮的红色荧光且在其它部位没有荧光,说明ChR2-tdTomato融合蛋白在该基因型小鼠心脏中具有组织特异性的高水平的表达。在同样条件下,αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠心脏及其它部位均没有明显的荧光,说明ChR2-tdTomato没有表达。（2）心脏自主搏动小鼠的光控起搏心肌表达ChR2-tdTomato的αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在连接呼吸机和开胸后,在没有蓝光刺激的情况下,心脏自主搏动的频率约为4 Hz;当给予小鼠心脏2 Hz的蓝光刺激时,原先的自主搏动节律被打乱,出现明显的心律失常;当蓝光刺激频率与自主搏动频率相同时,心跳频率维持在4 Hz;当使用6 Hz蓝光刺激频率时,心脏搏动完全由光照支配,且表现为窦性心律;当蓝光刺激频率提高至8Hz时,心跳频率也随之变为8 Hz,但出现了短暂的心律失常;当使用10Hz的蓝光刺激时,小鼠心肌已不能承受如此快速的去极化,虽然心脏搏动仍较为规律,但心电图波形已出现严重的紊乱。当蓝光刺激撤除之后,无论之前使用了何种刺激频率,小鼠心脏均可以迅速恢复到4 Hz的自主搏动状态。（3）心脏停跳小鼠的光控起搏为了检测因缺血损伤而无法自主搏动的心脏对蓝光刺激的反应,本研究将αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠麻醉后不连接呼吸机直接开胸,待心脏停跳后进行蓝光刺激,发现当刺激频率为1-5 Hz时,蓝光刺激可以有效引发小鼠心脏的搏动,搏动频率与刺激频率完全一致。当蓝光刺激频率更高时（7.5-10 Hz）,由于可能存在的心肌损伤,小鼠心率仅能维持在4-5 Hz范围内,无法进一步提高。以上结果说明光遗传学技术具有起搏停跳心脏的能力,其起搏效果可能与心肌损伤的程度密切相关。（4）对照小鼠对蓝光刺激无响应:为了确认αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心脏的光控起搏是由心肌表达的ChR2引发的,本研究还对αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+两种不表达ChR2-tdTomato的对照小鼠进行了同样的实验,发现两种小鼠对5 Hz和10Hz的蓝光刺激均没有响应,心率一直维持在6Hz。（5）分离心肌细胞的光控收缩和ChR2电流记录:蓝光刺激和电刺激均可以引发αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心肌细胞的收缩,而αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠的心肌细胞对光刺激无响应。通过膜片钳技术也记录到了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+心肌细胞特有的光刺激电流,说明ChR2的表达是心脏光控起搏的决定因素。结论:1.心肌特异性表达光敏感通道ChR2的转基因小鼠可以使用蓝光照射进行心脏起搏,当蓝光刺激频率低于小鼠的自主心脏搏动频率时,蓝光刺激会对窦性心律形成干扰,造成暂时性的心律失常,去除蓝光照射后小鼠心跳恢复正常。2.当蓝光刺激频率等于或高于ChR2表达小鼠的自发心跳频率时,小鼠的心率完全由蓝光刺激支配,去除蓝光照射后恢复到自发搏动状态。3.表达ChR2的小鼠心脏在因缺血损伤失去自主搏动能力后也可由蓝光刺激进行起搏。4.不表达ChR2的对照小鼠心脏在任何情况下对蓝光刺激都没有响应。5.蓝光刺激可以激活小鼠心肌细胞上表达的ChR2通道,产生光电流并引起细胞收缩。6.简便的无需Langendorff灌流分离成年小鼠心肌细胞的方法比起传统的Langendorff灌流方法操作简单且获得心肌细胞状态良好。
赵腾[2]（2021）在《NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究》文中提出研究背景:N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体（NR）是脑内兴奋性神经递质-谷氨酸的主要受体。其作为一种配体门控型的离子通道,在突触内主要参与介导兴奋性突触后电流（EPSC）的产生及传递,在突触外还可参与γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元突触前GABA释放,进而影响抑制性突触后电流（IPSC）的产生。而构成神经元网络的兴奋性突触信号和抑制性突触信号的失衡是形成癫痫的重要原因。因此,NR应该是影响神经元网络兴奋/抑制平衡的关键因素。通过一些临床病例及细胞水平受体功能分析证实,NR功能增强型（Go F）基因突变和功能丧失型（Lo F）基因突变均可导致癫痫。而作为NR的亚基之一,GluN2A/GRIN2A突变的患者中78%表现为癫痫,是目前NR基因变异相关癫痫研究的重点。目前,Lo F型NR基因突变所致癫痫的发病机制尚不明确,在转基因动物水平进行在体、离体电生理及行为学研究,进而明确该型基因突变致病的特点和机制意义重大。另外,一些变构调节剂可以逆转部分基因变异所致的NR功能异常。通过细胞水平筛选并在动物水平干预,可能筛选出对Lo F型NR较为有效的正向变构调节剂（positive allosteric modulator s,PAMs）,从而为临床精准化治疗提供重要理论和实践支持。研究方法:本课题以临床报道及细胞水平受体功能分析证实较为典型的Lo F型突变GluN2A/GRIN2A-V685G为研究位点。首先利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行NR功能验证,并根据文献资料选择了孕烯醇酮硫酸酯（PS）、24（S）羟基胆固醇（24（S）-HC）、妥布霉素、花生四烯酸、D-丝氨酸、精胺以及谷氨酸、甘氨酸做为备选药物在细胞水平进行敏感药物筛选,选出1-2种最为敏感的药物作为干预药物。利用胚胎显微注射法制备GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠,而后将小鼠分为空白组（WT）、功能丧失型突变组（Lo F）、空白治疗组（WT+drug）、突变治疗组（Lo F+drug）。在行为学方面,观察各组小鼠自发癫痫发作的情况,进行癫痫等级评分。若无自发癫痫的表型,则在各组建立高热癫痫模型,评估癫痫发作的阈值（发作潜伏期）。应用新颖物体识别实验（NOR）以及新颖物体位置识别（NOL）实验评估各组小鼠的认知状况;应用悬尾实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验评估各组小鼠的抑郁行为状况。在体检测各组小鼠皮层脑电图异常放电水平,并将各组小鼠断头取脑,应用膜片钳技术检测海马CA1区锥体神经元突触后膜NR所介导的电流（EPSC）以及GABA能中间神经元所介导的m IPSC水平,同时检测全锥体神经元动作电位的变化。最后利用Real-time PCR和Western blot技术检测GluN2A亚基的表达情况。研究结果:本课题利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行了NR功能验证,结果显示转染GRIN2A-V685G突变c DNA的蛙卵表面NR电流较对照组明显下降,功能基本丧失。将备选药物应用到转染细胞,结果显示24（S）-HC可以部分逆转该突变的NR功能。结合相关文献,最终选择可以增加脑内及血清24（S）-HC水平且已经临床应用于抗HIV治疗的依法韦仑（efavirenz,EFV）作为干预药物。而后将动物分为了WT组、Lo F组、WT+EFV组、Lo F+EFV组。行为学评价显示,各组小鼠均未出现自发性癫痫发作,在建立高热惊厥模型后,Lo F组小鼠癫痫发作潜伏期较短,而Lo F+EFV组癫痫发作潜伏期则较Lo F组明显延长,各组小鼠的发作强度和发作时持续时间无明显差异。在认知功能评价中,各组在新颖物体识别实验（NOR）中无明显差异,在新颖物体位置识别实验（NOL）中,Lo F组与WT组差异也无显着性,但观察趋势可见Lo F组小鼠较WT组识别指数稍有降低。而Lo F+EFV组的NOL识别指数较Lo F组明显增高,差异有显着性,可见Lo F小鼠可能存在空间记忆能力减退,而EFV可以逆转这种趋势。在抑郁行为评估中,各组小鼠均未发现明显差异,且Lo F组和Lo F+EFV组小鼠在悬尾不动实验中不动时间反而更短。在体电生理学检测显示Lo F组小鼠的皮层脑电图出现癫痫样放电（seizure-like events,SLEs）的频率明显增加,而Lo F+EFV组则较少出现SLEs,说明EFV可以部分抑制突变小鼠的脑内异常放电。随后利用膜片钳进行突触内NR电流（EPSC）水平检测显示Lo F组电流幅度和最大电流面积均明显降低,Lo F+EFV组则较Lo F组明显升高,差异均有显着性。m IPSC水平检测显示各组电流的振幅峰值（peak amplititude）检测中未发现明显差异,但在电流发放频率（event frequency）检测中,Lo F组较WT组明显下降,而Lo F+EFV组则无下降。随后进行全细胞动作电位检测显示与WT组相比,Lo F组小鼠海马CA1区锥体细胞动作电位阈值有所下降,动作电位幅度值增加,动作电位输入电阻增加,相同电流刺激下动作电位根数明显增加,差异有显着性。而Lo F+EFV组较Lo F组在动作电位上述指标中有逆转的趋势,但差异无显着性。而后进行的Real-time PCR和Western blot检测显示各组在GluN2A表达中无明显差异。研究结论:（1）GRIN2A-V685G突变可使GluN2A亚基配体结合结构域（ABD）功能障碍,致谷氨酸效力丧失,进而导致NMDA受体功能障碍。（2）GluN2A/GRIN2AV685G转基因小鼠海马CA1区锥体神经元突触内NR介导的EPSC降低,而由突触外NMDAR参与的GABA能中间神经元所介导的m IPSC也下降。使神经元网络的兴奋/抑制平衡失调,最终导致锥体神经元兴奋性增高。（3）GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠容易出现癫痫发作,其皮层脑电图可见异常放电增多。（4）抗HIV药依法韦仑（EFV）可以通过增加脑内24（S）羟基胆固醇水平来部分恢复GluN2A/GRIN2A-V685G突变所致的NMDAR功能丧失,减少皮层的异常放电,抑制转基因小鼠的癫痫发作。
冯雪芹[3]（2020）在《孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉功能的影响及机制研究》文中指出研究背景:当今社会经济水平不断提高,营养过剩的孕妇随之增多。母体孕期的不良刺激将会显着增加子代出生后罹患成人疾病（如糖尿病、高血压和中风等）的风险。相关研究发现,孕期高糖饮食可升高子代雄性大鼠青年期的血糖水平,抑制肠系膜动脉血管平滑肌细胞上大电导钙依赖性钾通道（Large-conductance Ca2+-activated K+channels,BK）的功能,最终导致肠系膜动脉功能异常。在老龄化进程中,血管老化是引起各种器官衰老的重要病理基础,成为多种慢性退行性疾病共同的发病机制。目前胎儿期高血糖暴露对血管老化进程的影响尚不清楚。本课题将研究孕期母体高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉功能的影响及其机制,以期为高血压等心血管疾病预防的孕期营养干预奠定基础,为相关药物研发提供线索。方法:4月龄SPF级SD雌雄大鼠按照1:2进行配种,发现阴栓时视为孕期第一天。将孕鼠随机分为对照组和高糖组,每组20只。高糖组孕鼠自孕期第一天起给予20%蔗糖水和标准饲料至子代出生,对照组孕期给予正常饮水和标准饲料。两组孕鼠均自然分娩,给予雄性子代正常饮水饮食至20月龄,运用在体血压检测技术、微血管张力检测技术和肌源性张力检测技术,评估孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉结构与功能的影响。进一步运用膜片钳电生理检测技术,结合分子生物学技术等方法,探讨肠系膜动脉平滑肌细胞表型与重要离子通道功能改变参与其中的机制。结果:与对照组相比,1)孕期高糖饮食导致老年雄性子代大鼠体重显着增加（P<0.05）,空腹胰岛素水平升高,体内出现胰岛素抵抗;收缩压无显着差异,舒张压和平均动脉压显着升高,具有统计学意义。2)高糖组中基质金属蛋白酶2表达升高（P<0.05）,而其天然组织抑制剂1表达下降（P<0.05）,提示细胞外基质重塑;去氧肾上腺素介导的血管收缩反应和压力诱导的肌源性张力均减弱,提示血管功能发生改变,这种改变可能与肠系膜动脉中L-型钙通道的功能降低有关。3)血管平滑肌细胞的收缩型基因（如α-SMA等）表达显着降低。同时,胰岛素信号通路IR/IRS-1/PI3K信号通路表达下调,利用原代平滑肌细胞证明胰岛素信号通路和L-型钙通道均可调控血管平滑肌细胞的细胞表型。结论:孕期高糖饮食抑制了老年雄性子代大鼠肠系膜动脉上L-型钙通道和PI3K的功能和表达,从而改变了血管平滑肌细胞的细胞表型,最终导致肠系膜动脉功能减弱,发生动脉硬化。
王敏[4]（2019）在《核桃蛋白源生物活性肽改善学习记忆机制研究》文中研究表明食源性生物活性肽是极具发展前景的功能因子,具有丰富生物活性。核桃长期以来被认为具有改善学习记忆的功能,其健脑益智生物活性成分除不饱和脂肪酸、维生素外,蛋白质及生物活性肽也被认为是重要成分之一,但其作用机制仍需进一步探究。与核桃蛋白质相比,多肽因其分子量小、吸收率等优势而备受关注。本论文旨在从核桃蛋白酶解物中筛选具有改善认知功能的生物活性肽,通过体外稳定转染Aβ-E22G-mCherry质粒构建Aβ蛋白聚集细胞模型和体内学习记忆障碍小鼠模型评价其生物活性,探究核桃蛋白生物活性肽对学习记忆改善作用机制及不同给予方式对其功效发挥的影响。本论文首先采用D-半乳糖（D-gal）诱导的学习记忆损伤小鼠模型评价核桃蛋白酶解物（WPH）改善学习记忆能力,发现WPH可有效改善D-gal小鼠对空间和有害刺激的学习记忆能力。WPH具有显着提高D-gal小鼠血清中抗氧化酶（SOD和GSH-Px）活性、抑制脑组织中一氧化氮合酶（NOS）活性以及显着降低氧化产物（MDA和NO）含量的作用;体外Aβ蛋白聚集细胞模型证实WPH可显着抑制细胞内Aβ蛋白聚集（p<0.05）,以上结果表明WPH中含有具有改善学习记忆能力的生物活性肽。经高效液相色谱分析发现WPH中多肽分子量主要集中在1 500 Da以下;通过超高液相色谱和高分辨质谱联用从WPH中鉴定得到10条多肽片段,序列简写如下:ASACM（AM5）、PPKNW（PW5）、ASSAPE（AE6）、GGPATTC（GC7）、HCPF（HF4）、HSGPHA（HA6）、NGGSH（NH5）、WSREEQE（WE7）、MTDAN（MN5）和WPPKN（WN5）。结合多肽物理性质预测分析,从10条多肽中挑选4条（WN5、PW5、WE7和HF4）进行体外抗Aβ蛋白聚集活性初筛和验证,其中PW5肽的抗Aβ蛋白聚集活性最佳。利用APP/PS1转基因小鼠评价核桃蛋白肽PW5体内改善学习记忆能力的生物活性。行为学结果表明,PW5肽干预可有效改善小鼠在水迷宫和穿梭实验中对空间和有害性刺激的学习记忆能力。免疫组织化学染色结果显示,PW5肽干预后APP/PS1小鼠脑中Aβ淀粉样蛋白沉积（15.5±1.08,p<0.05）明显低于对照组Aβ淀粉样蛋白沉积（25.14±3.89）。16S rRNA检测结果表明,PW5肽可调整APP/PS1小鼠处于失调状态下肠道菌群的α和β多样性及组成。此外,PW5肽可促进血清中神经递质肾上腺素（NE）水平的上升以及乙酰胆碱（Ach）和丁酸水平的降低（p<0.05）。Pearson系数分析表明,血清神经递质和短链脂肪酸水平变化与肠道菌群中Lactobacillus、gnorankfErysipelotrichaceae、Flexispira等菌属的相对丰度变化存在显着相关性。在对PW5肽改善学习记忆功效的作用机制研究过程中,探讨了肠道菌群对AD发病的影响。研究发现,采用几种抗生素（氨苄西林、甲硝唑、万古霉素、新霉素、庆大霉素和红霉素）联合干预可有效杀灭3月龄APP/PS1小鼠肠道中的绝大部分菌群,使其接近无菌状态以便后续粪便移植研究;与同月龄（5月龄）未经干预的APP/PS1小鼠相比,短期抗生素干预对Aβ淀粉蛋白沉积形成无明显影响。在抗生素干预的基础上,通过移植老年（16月龄）APP/PS1小鼠的粪便菌群,可重构肠道微生物菌群多样性和组成,导致小鼠脑中（5月龄）Aβ斑块数量显着增加（p<0.05）。这些结果提示外界干预可通过调整肠道菌群的组成来实现预防、改善和治疗AD。结合行为学、免疫荧光染色、肠道菌群及代谢组学结果,PW5肽的作用机制可能是通过降低脑内Aβ淀粉样蛋白斑块并改变肠道微生物群和血清代谢物组成起到改善APP/PS1小鼠的学习记忆损伤作用。通过灌胃和腹腔注射PW5肽对APP/PS1小鼠进行干预,评价两种不同给予方式对其改善学习记忆损伤的影响。研究发现,PW5肽经口服给予后其改善APP/PS1小鼠认知功能障碍和减少Aβ蛋白沉积的效果明显优于腹腔注射。与腹腔注射方式相比,PW5肽口服可接触肠道菌群,对认知功能障碍的APP/PS1小鼠肠道菌群多样性、组成及功能均有很好的调整作用,使其整体组成远离未经干预的APP/PS1小鼠而更接近于野生型小鼠。本研究表明核桃蛋白具有改善学习记忆损伤的功效,并证实核桃蛋白源生物活性肽PW5肽经口服干预后其改善认知功能障碍的效果明显优于腹腔注射。基于本研究结果,不仅拓宽了核桃蛋白潜在的应用范围,提高其附加的经济、营养和医用价值;而且核桃蛋白源生物活性肽可进一步开发为改善学习记忆功能性食品或药品,在预防、改善和治疗认知障碍相关的多种疾病方面具有良好的应用前景。
郭飘[5]（2019）在《利用单细胞测序技术研究骨髓源细胞在肝癌起源中的作用》文中研究指明研究背景和目的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种致死率很高的恶性肿瘤,其死亡率位居全球癌症相关致死疾病的第三位。现有的诊疗手段并不能有效地改善HCC患者的预后,因此我们希望追根溯源,探寻启动HCC发生的细胞类型,为临床诊疗提供新的理论依据。研究表明,参与肝脏实质重塑的成熟肝细胞以及肝干/祖细胞均可以是HCC的起源细胞。骨髓来源的细胞(bone marrow-derived cells,BMDCs)也被证实能够进入受损肝脏参与肝细胞的再生。已有报道称BMDCs参与胃癌、皮肤癌、肺腺癌等多种恶性肿瘤的发生,但其在HCC起源中的作用尚不明确。因此,本课题旨在通过以下研究内容探讨BMDCs在HCC起源中的作用,从单细胞水平揭示HCC的发生及演变进程,为临床上HCC的诊疗提供新思路:构建经致死剂量照射和同种异体GFP+骨髓移植的二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导小鼠肝癌模型,分离获取肿瘤组织单细胞,分析其拷贝数变异（copy number alteration,CNA）模式,明确肝癌组织中的肿瘤细胞来源;基于CNAs构建系统发生树,探究HCC的进化模式;利用生物信息学分析方法评估DEN诱导形成的小鼠HCC和人HCC的相似性,为实现HCC基础研究向临床应用的转化提供新的理论依据。研究方法1.构建同种异体全骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型——通过鼠尾静脉将GFP转基因雄性C57BL/6小鼠的全部骨髓细胞移植入经致死剂量照射去除本身骨髓细胞的野生型雄性C57BL/6小鼠体内,在此基础上使用DEN诱导小鼠肝癌的形成。通过H&E染色和免疫组化染色明确肝脏所成肿瘤的性质。2.冰冻组织免疫荧光检测肝脏肿瘤组织中GFP和HCC特异性标志物磷脂酰肌醇聚糖3（glypican 3,GPC3）的表达情况。3.制备肿瘤组织单细胞悬液,镜下挑选单细胞,使用多重退火环状循环扩增技术进行单细胞全基因组扩增,构建DNA文库,进行低深度（0.3×）的全基因组测序。4.运用生物信息学分析方法检测单细胞的CNA模式,构建CNA事件矩阵,并以此为基础,绘制系统发生树。5.利用巢式PCR技术对肿瘤细胞基因组中的GFP序列进行验证。6.构建去除骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的骨髓(CD45+骨髓细胞)移植模型,在此基础上使用DEN诱导小鼠肝癌的形成,从单细胞水平探讨BM-MSCs对HCC发生的影响。7.流式细胞术检测CD45磁珠富集CD45+骨髓细胞的特异性。8.构建同种异性骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,利用免疫荧光联合荧光原位杂交技术检测HCC细胞的性染色体构成,进一步验证HCC细胞的来源。9.根据绘制的六只测序小鼠的肝癌系统发生树,探讨HCC细胞CNAs的进化模式。10.利用生物信息学分析方法在多只小鼠共享的CNA区域内寻找和人HCC突变基因相对应的同源基因,分析该模型形成的小鼠HCC和人HCC的相似性。研究结果1.成功构建了同种异体全骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,组织病理学检测证实肝脏所成肿瘤为HCC。2.冰冻组织免疫荧光结果表明肝癌组织中部分肿瘤细胞存在GPC3和GFP的共定位,初步提示BMDCs参与HCC的发生。3.单细胞CNA分析结果显示肝癌组织中存在GFP+和GFP-的肿瘤细胞。4.GFP+和GFP-的肿瘤细胞共享部分CNA区域,提示这些细胞很可能是同一起源,即均来自于骨髓;不同的肿瘤细胞也具有一些各自独特的CNAs,说明肿瘤细胞之间也存在明显的异质性。5.巢式PCR结果证实GFP+和GFP-的肿瘤细胞基因组里均存在GFP序列,进一步说明BMDCs是小鼠HCC的主要起源。6.成功构建了去除BM-MSCs的骨髓(CD45+骨髓细胞)移植后DEN诱导小鼠肝癌模型。结果显示CD45+骨髓移植组小鼠的成瘤率明显降低,说明BM-MSCs对HCC的发生十分重要。7.CD45+骨髓移植组小鼠的肝癌组织中仍存在GFP+和GFP-的肿瘤细胞,单细胞CNA分析结果显示这两群细胞具有高度相似的CNA模式,巢式PCR也证实它们的基因组里均包含GFP序列。流式细胞术检测结果发现CD45+的供体骨髓中混有少量CD45-的骨髓细胞,提示可能是未被完全去除的BM-MSCs启动了HCC的发生。测序结果也提供了另一种可能性,即BM-MSCs可能不是参与HCC起源的唯一骨髓细胞亚群。8.成功构建了同种异性骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型。通过检测GPC3+细胞即HCC细胞的性染色体情况,发现HCC细胞均来自于供体骨髓,并未发生供体骨髓细胞和HCC细胞的稳定融合,说明在本小鼠肝癌模型中,BMDCs直接参与HCC的起源。9.在本小鼠肝癌模型中,肿瘤细胞CNAs的进化模式并非单一,而是同时存在间断进化和渐进进化这两种模式。10.生物信息学分析表明多只小鼠共享的CNA区域内存在与人HCC突变基因相对应的同源基因,体现出本实验模型所形成的小鼠HCC和人HCC具有一定的相似性。研究结论本课题成功构建了骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,通过分析肝癌单细胞的CNA模式,发现BMDCs是HCC的主要起源细胞。我们推测化学致癌物DEN引起的肝损伤会募集BMDCs入肝,BMDCs通过转分化为肝细胞参与肝脏再生。长期暴露在这种化学致癌环境中,这些细胞更容易转变为肿瘤细胞而启动HCC的发生。在本研究模型中,BM-MSCs这一骨髓细胞亚群对HCC的发生十分重要。生物信息学分析结果表明在本小鼠肝癌模型中,渐进式和间断式的CNA进化模式同时存在;本实验模型里的小鼠HCC和人HCC具有一定的相似性。BMDCs是HCC起源细胞的发现会加深人们对HCC发病机制的认识和理解,有利于新的治疗靶点或治疗手段的产生。
张建斌[6]（2018）在《可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究》文中认为作为一个诱导基因表达调控系统,四环素（tetracycline,Tet）调控系统在基因工程中已开始应用于复杂的生物发生反应、机体的疾病及行为等。它已成为研究某一基因功能的有效工具,尤其在转基因小鼠的基因功能上,得到了广泛的应用。生长激素（growth hormone,GH）在不同物种中均具有促进性成熟,提高瘦肉率,改善饲料转化率等优点,但也存在副作用,在转生长激素基因的动物上尤为明显。这可能由于转GH基因动物,都是全身过表达GH基因,而且外源GH基因从胚胎期到成年都持续发挥生物学效应,其机体发育的异常很可能和GH在全身多个组织器官中的自分泌异常有关。在Tet调控系统中,诱导底物四环素的浓度与外源基因表达水平在一定范围内呈正相关,因此,可以通过控制四环素及其衍生物强力霉素（doxycycline,DOX）的有无、浓度高低来调控所导入的外源基因表达水平,进而认识所导入基因在不同水平及不同生长阶段的表达,了解其在动物生长发育中作用,进一步深入研究GH生物学功能。本研究采用分子生物学方法,构建了猪生长激素（porcine growth hormone,pGH）真核细胞可诱导表达载体,采用阳离子脂质体法转染到猪髋动脉内皮细胞（porcine iliac artery endothelial cells,PIEC）,在细胞水平上对Tet调控系统的诱导效率和表达水平进行了验证。然后利用该载体以原核显微注射方法,将外源基因片段（pTTGH）直接注射到原核期胚,制备转基因小鼠并用蛋白质组学的方法对其功能进行了研究。主要结果如下:（1）成功构建了重组表达载体（pTTGH）。在成功构建重组载体pTRE-GH12的基础上,应用PCR扩增出TRE-GH12基因序列片段。然后,通过酶（SalI）切位点将其连接到pCAGGS-rtTA载体上,构建pTTGH载体。通过对酶切、测序,结果证明构建的pTTGH载体符合要求。将构建好的载体用阳离子脂质体法转染到PIEC细胞。经遗传霉素（G418）抗性筛选后,将强力霉素添加到培养液中进行诱导。然后,通过荧光定量PCR在不同时间检测猪髋动脉内皮细胞内pGH mRNA的表达水平;配制不同浓度的强力霉素,将其加入细胞培养液内,在mRNA水平上测定猪生长激素的表达效率及表达水平。结果说明,将强力霉素添加到细胞培养液内,经过12、24、36、48和60h的检测,外源生长激素的mRNA表达水平分别比对照组高4.21、6.79、73.27、34.29和30.07倍。在培养基中添加不同浓度（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL）的强力霉素,pGHmRNA表达量分别是对照组的9.87、11.45、26.87、30.09、36.77、47.84、46.87、41.23、35.27和29.87倍,处理组与对照组差异极显着（P<0.01）。（2）将pTTGH质粒以原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠在3～10周龄期间通过饮水中添加诱导底物DOX进行诱导实验。结果表明,转基因小鼠体重在诱导期内持续增加,生长速度高于转基因小鼠无药物诱导组和非转基因对照组,转基因组小鼠血清中pGH水平远远高于对照组小鼠,差异显着（P<0.05）。ELISA方法测定血清样本中内源IGF-1的表达水平,结果表明,转基因小鼠血清中胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）水平明显上升,说明外源GH通过调节IGF-1调节动物机体的生长。通过对转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌、腿肌等组织进行形态学变化及病理学观察。苏木精和伊红染色法（hematoxylin-eosin,HE）切片结果表明:转基因小鼠加DOX诱导之后与同窝非转基因小鼠加DOX诱导之后相比,功能性器官肝脏、脾脏、肺脏、肾脏都没有发生可见病变。（3）通过对转基因小鼠和对照组小鼠大脑、肝脏和肌肉共6个组织样本,采用同位素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术进行质谱鉴定试验,再对获得的蛋白质组学数据进行生物信息分析,进而鉴定过表达GH转基因小鼠对机体的影响,进一步为GH高表达对大脑发育、能量代谢和生长性状的分子机制提供理论依据。转基因和对照组小鼠大脑组织共得到360个DEPs,转基因组高表达蛋白148个,低表达蛋白242个。肝脏组织共得到170个DEPs,转基因组高表达蛋白74个,低表达蛋白96个;肌肉组织比较共得到390个DEPs,转基因小鼠高表达蛋白156个,低表达蛋白234个。通过GO（Gene Ontology）注释和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway分析差异蛋白主要富集在RNA剪切过程、细胞间蛋白转运过程、mRNA加工过程及胰岛素信号通路、AMPK通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路等信号通路中。
陈宇庭[7]（2017）在《利用非天然氨基酸扩充脊椎动物的遗传密码子研究》文中提出地球上绝大多数生物体保守地利用标准的密码子编码20种天然氨基酸。虽然在少数细菌和真核生物细胞中出现少数密码子的自然变异,但在脊椎动物体内人工扩充遗传密码子来实现基因编码非天然氨基酸（Uaas）仍具有巨大挑战。扩充遗传密码子来实现基因编码Uaas是通过将氨酰tRNA合成酶与抑制子tRNA正交对（aaRSs/tRNAcuA）引入到活细胞内,解码“空白密码子”（一般指终止密码子或移码的密码子）来实现的。该技术是在大肠杆菌中建立起来的,随后逐步应用在酵母细胞、哺乳动物细胞以及构建密码子扩充的转基因非脊椎动物如线虫、果蝇,并在其体内实现Uaas的点特异整合。虽然,向小鼠的细胞与组织中瞬时引入aaRSs/tRNAcuA能在其内实现Uaas的点特异整合,但能否构建可遗传的遗传密码子扩充的转基因脊椎动物仍然是未知的。同时,脊椎动物的生物复杂性能否允许用于遗传密码子扩充的遗传材料的引入、维持及稳定传递也是未知的。我们首先决定将AzFRS/tRNACUA正交对基因整合到小鼠基因组上,该正交对能使琥珀密码子（UAG）编码非天然氨基酸,4-叠氮基-苯丙氨酸（AzF）。优化的RS（tRNA）4×质粒经线性化被直接注射到小鼠受精卵后,成功获得RS（tRNA）4×转基因小鼠,且RS（tRNA）4×基因可有效传递给下一代。接着,以Gapdh基因作为内参,用qPCR技术检测到F2代转基因小鼠中RS（tRNA）4×基因的拷贝数是15个。此外,利用免疫印迹实验技术在F2代转基因小鼠主要组织中均检测到AzFRS的表达。以上结果说明,RS（tRNA）4×基因已经被整合到小鼠基因组上且能稳定遗传。接着,我们评估了 RS（tRNA）4×转基因的整合对活体小鼠的潜在影响。通过HE染色分析,RS（tRNA）4×小鼠与野生型小鼠在主要组织的形态上均没有显着差异。然后,利用RNAseq分析了肝脏组织中基因表达情况。结果表明,与野生型小鼠相比,在转基因小鼠肝脏中只有少数基因的表达发生变化。为了检测这些基因表达变化是否对肝脏功能有影响,我们检测了肝脏代谢相关血液生化指标,转基因小鼠与野生型小鼠之间并没有显着差异。此外,我们还给转基因小鼠饲喂含或不含AzF的风味水,也没有发现两组小鼠的血液生化指标有差异。以上结果表明,RS（tRNA）4×基因整合到小鼠基因组,并未对其造成显着生理损伤。为了评估整合到小鼠基因组上的AzFRS/tRNAcuA正交对基因的功能,我们在成年转基因小鼠来源的原代细胞中进行了 AzF整合的实验。利用携带双荧光报告分子EGFP-amb-mCherry的慢病毒分别感染这些原代细胞,当培养基中添加AzF时,我们在分化的神经球细胞和骨髓细胞中均检测到了琥珀密码子的通读,但在成纤维细胞中并未检测到。接着,将额外的tRNACUA与EGFP-amb-mCherry共转染到成纤维细胞中,实现了 AzF的整合,说明AzFRS是有功能的而tRNACUA在成纤维细胞中表达受限制。以上结果表明,转基因小鼠的原代细胞中能够成功表达有功能的AzFRS/tRNACUA正交对。该正交对能使琥珀密码子编码AzF,实现AzF定点整合到报告分子中,但AzF的整合是具有细胞类型的依赖性,且部分受tRNACUA表达量的影响。我们也尝试扩充斑马鱼的遗传密码子。将一个全身普遍表达AzFRS/tRNACUA的质粒与To12转座子酶的mRNA注射到1细胞期的斑马鱼受精卵内,我们成功得到RS（tRNA）4×转基因斑马鱼。通过免疫印迹实验,检测到在F2代转基因斑马鱼的胚胎和成体鱼鳍组织中均有AzFRS的表达,这表明了转基因已成功稳定整合到斑马鱼基因组上。为了评定AzF能否在斑马鱼的体内整合,报告分子mCherry-eGFP（Y145amb）的mRNA被注射到1细胞期的F2代转基因斑马鱼胚胎中,然后将胚胎孵育在含2.5mMAzF的水中,在受精24h后（24hpf）,我们观察到胞核内含绿色荧光信号的细胞逐渐增多,表明琥珀密码子在斑马鱼体内已被通读。综上所述,我们首次报道成功构建了遗传密码子扩充的转基因小鼠和转基因斑马鱼。aaRSs/tRNACUA正交对能分别在小鼠活体外和斑马鱼体内使琥珀密码子编码Uaas。这样能基因编码Uaas的转基因脊椎动物,对于体内研究生理和病理过程以及产生新的特定功能将是非常重要的。
高菲[8]（2017）在《利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究》文中研究指明鸡是十分重要的发育生物学模式动物,制备鸡的遗传修饰动物模型意义重大。首先,可利用鸡的输卵管生物反应器生产药用蛋白;其次,可利用遗传修饰技术促进家禽分子育种,制备具有优良农业生产性状的新品种;最后,可结合遗传修饰技术制备基因敲除模型进而深入解析基因功能。然而,有关鸡的遗传修饰研究却进展缓慢。截止目前,制备鸡的遗传修饰动物模型主要面临以下问题:具备生殖系嵌合潜能的鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）体外培养难度大且缺乏高效的遗传修饰手段;纯合突变个体制备周期长,技术难度大且未能规模化制备;缺乏稳定的雄性不育受体鸡品系,进而使得获得高效生殖系嵌合体的难度加大。针对以上问题,本课题通过优化培养条件建立鸡PGCs稳定的体外培养体系;利用piggyBac转座子系统与CRISPR/Cas9技术相结合构建鸡的全基因组单链导向RNA（Single guide RNA,sgRNA）文库,规模化制备突变体;结合Tet-On与TMP双调控系统实现靶细胞凋亡,探索雄性不育受体鸡的制备。本研究从饲养层细胞的种类及处理方法、培养液组分等条件针对鸡的PGCs体外培养条件进行优化,最终建立鸡PGCs稳定的体外培养体系。本研究分别从白来航鸡胚胎的性腺组织、农大3号鸡胚胎的生殖新月区及性腺组织成功分离并体外培养获得39株PGC系。这些细胞系在体外可无限增殖,碱性磷酸酶呈阳性,具有正常的二倍体核型。RT-PCR结果显示,分离得到的PGCs可表达生殖细胞标志基因CVH和DAZL。免疫荧光染色结果进一步表明CVH和DAZL呈阳性,干细胞表面抗原SSEA-1和SSEA-4在PGCs中高表达,SSEA-3在PGCs中微弱表达。此外,利用piggyBac转座子系统成功实现了 PGCs的稳定转染,并通过开天窗显微注射法高效获得G0代生殖系嵌合体,随后通过传代实验成功获得G1代阳性个体。结合Southern Blot及Genome Walking技术针对G1代阳性个体进行分析,发现外源基因为单拷贝插入,插入位点位于鸡14号染色体Fam20C基因的第4个内含子中。本研究利用生物信息学方法针对鸡的全基因组编码基因进行sgRNA的靶点设计,利用芯片合成技术共合成93961条sgRNAs序列,共涵盖鸡的16821个基因,平均每个基因设计了 5-6个sgRNAs。结合Tet-On调控的CRISPR/Cas9和piggyBac介导的sgRNA文库成功制备稳定转染的PGC系。利用该细胞系成功制备了阳性的G0代嵌合体,且在细胞水平及个体水平灵活响应DOX调控。此外,对两只G0代嵌合体睾丸进行sgRNAs的深度测序,经分析发现,共检测到102个针对不同基因的sgRNAs,且每个sgRNA靶向的基因均匀分布在鸡的常染色体及性染色体上。针对雄性不育鸡品系的探究,本研究采用Tet-On与TMP双调控系统在PGCs细胞水平成功实现特异性细胞凋亡。综合以上实验结果,本研究通过PGCs体外培养条件的优化可成功制备遗传修饰的G0代嵌合体及G1代阳性个体。利用针对鸡的CRISPR/Cas9的sgRNA文库获得包含不同种类sgRNAs的G0代生殖系嵌合体,为今后规模化制备突变体鸡奠定基础。结合Tet-On和TMP调控系统在PGCs水平实现特异性细胞凋亡,为雄性不育受体鸡的培育提供新的思路。
宋绍征[9]（2016）在《转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究》文中研究说明自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了三代发展。人组织纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator, t-PA）是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,是一种良好的第二代溶栓药物。重组人纤溶酶原激活剂（recombinant human plasminogen activator, rhPA）是天然t-PA的重组突变体,属于新型第三代溶栓药物,具有较天然t-PA更加优越的溶栓功能。利用动物乳腺生物反应器来生产t-PA及其重组突变体,具有产量高、成本低、翻译后修饰、生物活性高等优于其它表达系统的特点。应用多种纯化技术相结合的策略,能够方便、快捷、高效地将目标蛋白从动物乳汁中分离纯化出来。现今,国内外已有很多关于以上研究内容的报道。本研究目的旨在：将构建正确而有效的rhPA乳腺特异性表达载体（F、E、K1区缺失重组体t-PA）应用到转基因兔中,研究其表达水平和活性功能,以期获得高效表达rhPA的转基因兔；研究各种分离纯化表达兔乳中rhPA的方法和策略,以期获得高纯度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型,以期获得最佳的动物溶栓效果；同时,还研究了rhPA单克隆抗体的制备和筛选方法,以期获得能够用作亲和层析配体的多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）。从而,最终获得一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下：1.采用常规分子生物学技术,分别以山羊p-酪蛋白基因（β-casein）、山羊p-乳球蛋白基因（BLG）和牛αs1酪蛋白基因（asl-casein）作为调控元件,以天然t-PA的F、E、K1区缺失体作为编码蛋白序列,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。经酶切图谱和测序比对结果显示,构建的载体与理论序列完全一致。2.通过胶原酶消化组织法建立山羊乳腺上皮细胞分离培养体系,电转染三种载体,经600μg/mL G418筛选两周后,挑取生长旺盛、状态较好的单克隆细胞集落,传代扩大培养。经PCR检测,PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三种载体分别获得了79株、66株、63株整合阳性单克隆细胞株,并应用51μM催乳素进行诱导表达。ELISA检测72h后细胞诱导上清液,25株转PCL25/rhPA基因细胞株高水平表达rhPA,3株转BLC14/rhPA基因细胞株表达rhPA,而转AP/rhPA基因细胞株未见表达。经纤维蛋白平板溶圈法（FAPA）检测,所有诱导表达上清液均具有体外溶栓活性功能。结果表明,在细胞水平,PCL25/rhPA和BLC14/rhPA载体能够有效地驱动rhPA基因特异性表达,且PCL25/rhPA载体的表达水平明显高于其它两种载体。从而,验证了构建的PCL25/rhPA载体是合理而有效的。3.将以上三个构建（PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA）经显微注射导入到兔受精卵中,共移植94只受体,妊娠71只,出生319只仔兔,PCR检测85只为转基因整合阳性兔,妊娠率为75.5%（71/94）,整合率为26.6%（85/319）。ELISA检测57只存活转基因兔（或后代）乳汁,共12只乳腺特异性表达rhPA （PCL25/rhPA11只,BLC14/rhPA1只）,表达水平约在5.2-630 μg/mL之间。SDS-PAGE电泳和Western Blot检测该12只兔乳,均出现约39KDa大小的目标特异性条带。FAPA结合ELISA测定表达产物的体外溶栓比活性,最高可达360倍左右（A29,与阿替普酶相比）。测交检测高表达水平的A29系转基因兔,1只F2代（A29F2-09）的所有后代仔兔均为整合阳性（100%,13/13）；Real-time PCR检测相对拷贝数,该只兔约是其它同系转基因兔的2倍。从而,证明了A29F2-09为纯合子转基因兔,且rhPA表达水平约1000μg/mL,明显高于非纯合子兔；不同系转基因兔拷贝数与表达水平间没有相关性。以上结果表明,PCL25/rhPA载体能够在转基因兔乳腺中高效表达活性rhPA;表达水平主要与整合位点有关；当整合位点一致时,表达水平随拷贝数的增加也相应地累积提高。4.通过传统弗氏佐剂和快速免疫佐剂两种方法免疫小鼠,结果显示在免疫小鼠血清效价、免疫原剂量和免疫周期上,快速免疫佐剂都大大地优越于弗氏佐剂（1010/109,20μg/1300μg,35d/70d）。通过电脉冲和化学PEG两种方法将免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,结果显示电融合效率明显高于化学PEG融合（166%/88.4%）。通过HAT和HT筛选及有限稀释法亚克隆后,共获得12株能够稳定分泌高效价抗体的杂交瘤细胞株（标号Cl-C12）。ELISA-elution检测,有3株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb,标号C1、C4、C8）,占单克隆抗体总数的25%（3/12）。小鼠腹腔诱导法大量制备抗体,C1、C4、C8株腹水效价分别是108、1010、108,且无交叉非特异性反应,能够为亲和层析所用。5.通过离心脱脂、35%饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等方法进行兔乳前处理,获得粗纯样品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱,偶联率高达96.5%。尝试五种不同的洗脱液（A:0.1mol/L甘氨酸,pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸,pH3.5；C:0.1mol/L甘氨酸,pH5.0; D:0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液,pH7.9; E:0.2M NaH2PO4-柠檬酸,pH2.2）,来探索最佳洗脱效果的条件,结果显示0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液（pH7.9）洗脱效果最佳,但pH较低的强酸缓冲液（A、B、E）也能够达到洗脱要求,而pH较高的C洗脱液则出现杂蛋白较多且回收率低。再尝试Chromdex75 prep grade凝胶过滤预装柱来进一步分离纯化目标蛋白rhPA,上样体积为1%和2.5%能够将目标蛋白完全分开,出现两个独立的峰；而上样体积为5%则不能够将目标蛋白完全分开,出现两个相互交叉重叠峰。经免疫检测及飞行时间质谱鉴定该纯化产物为目标rhPA。与BSA对照品相比,双向电泳结果显示,纯化产物的大小约39KDa（在35-40KDa之间）,等电点约7.1（BSA等电点约4.7）,纯度可达96%-99%或更高（BSA纯度96%-99%）。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构；FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。6.以HitrapTM CaptoTM Q-1mL离子交换柱去内毒素,经试剂盒测试,内毒素含量低于0.015EU/mL.分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%浓度的角叉菜胶,来探索诱导小鼠尾部血栓形成的最佳条件,结果显示以0.05%浓度的角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成条件最佳。以不同的“给药”浓度（低剂量组0.1mg/只、中剂量组0.4mg/只、高剂量组1.6mg/只及阿替普酶、生理盐水对照组）对小鼠血栓模型病进行治疗,结果显示纯化产物rhPA作为溶栓药物治疗小鼠尾部血栓,在效果和剂量上明显优越于阿替普酶,且rhPA高剂量组（1.6mg/只）在三次给药后（32h）能够完全治愈小鼠尾部血栓疾病。以上结果表明,我们构建的F、E、K1区缺失重组体t-PA （PCL25/rhPA载体）是合理、有效的,且能够在转基因兔乳腺中高效表达；表达产物rhPA能够相对单独地存在于兔乳中,且能够被分离纯化出来；纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性功能,且能够用于动物溶栓模型试验,具有较阿替普酶对照品更好的疗效。同时,也证明了我们所建立的这一整套技术体系是相对完善、可行的,在国内外较少见报道,为以后大量新型重组溶栓药物的研发提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了扎实的基础。
张玉蕊[10]（2014）在《苏氨酸合成相关基因在C2C12和NIH-3T3细胞及小鼠体内的表达和作用》文中研究表明在漫长的生物进化过程中,苏氨酸合成途径逐渐从动物体中消失,必须在饲料中添加足够的苏氨酸才能够保证动物的正常生长。欧洲饲料配方显示,苏氨酸是猪的第二限制氨基酸和鸡的第三限制氨基酸,除了能影响动物的生长速率外,它还能通过促进小肠黏蛋白和免疫球蛋白的合成,从而提高动物体的免疫性能。在细菌中,天冬氨酸激酶（AK）、天冬氨酸半醛脱氢酶（ASADH）、高丝氨酸脱氢酶（HDH）、高丝氨酸激酶（HSK）和苏氨酸合酶（TS）共同催化天冬氨酸到苏氨酸的合成。大肠杆菌中,AK有三种形式,AK I数量最多由thrA基因编码,AK I和AK Ⅱ具有AK和HDH两种酶活性。而在谷氨酸棒状杆菌中,由lysC编码的AK和hom编码的HDH均是单功能酶。在两种细菌中,ASADH、HSK和TS分别由asd、thrB和thrC编码。转基因技术的发展使得恢复动物体中某些已经消失的生理生化功能成为可能。本课题中我们尝试将细菌中苏氨酸合成酶的相关基因转移到小鼠细胞内,希望小鼠能够自身合成苏氨酸。我们构建了两套转基因系统pEF1α-IRES-GFP-E4F-his和pEF1α-IRES-GFP-M4F-his。大肠杆菌中苏氨酸合成所需要的酶基因构建的pEF1α-IRES-GFP-E4F-his载体不能在C2C12和NIH-3T3中表达,密码子优化合成后构建的pEF1α-IRES-GFP-M4F-his能够在上述两种细胞中表达却不能合成苏氨酸。我们将整个反应过程分为两部分分别研究,首先在反应体系中加入2mM的高丝氨酸,结果显示转基因细胞能够以高丝氨酸为底物大量合成苏氨酸。为了比较密码子优化是否能够促进外源基因的表达和功能,我们分别构建了pEF1α-IRES-GFP-E2F-his和pEF1α-IRES-GFP-M2F-his载体,分别转染C2C12和NIH-3T3细胞后,两种载体的表达没有明显的区别。它们均能使细胞大量合成苏氨酸,在C2C12细胞中,pEF1α-IRES-GFP-E2F-his合成苏氨酸的效率将近是pEF1α-IRES-GFP-M2F-his合成苏氨酸效率的两倍,而在NIH-3T3细胞中pEF1α-IRES-GFP-M2F-his合成苏氨酸的效率将近是pEF1α-IRES-GFP-E2F-his合成苏氨酸的3倍。为了验证小鼠细胞中以天冬氨酸为底物合成高丝氨酸的可能性,我们分别从辅酶,2A剪切效率和单功能酶等方面进行探讨。结果显示,2A连接肽能够高效剪切两种蛋白。在反应体系中加入NADPH后,不能增加苏氨酸的合成,但是HPLC图谱中发现了高丝氨酸的少量合成,证明添加NADPH可以启动天冬氨酸到高丝氨酸的合成过程。将谷氨酸棒状杆菌中天冬氨酸合成高丝氨酸途径的相关酶基因转入小鼠细胞中,无法检测到高丝氨酸的合成,说明单功能酶不能启动整个过程。利用pEF1α-IRES-GFP-M2F-his载体制备转基因小鼠,Southern blot的结果显示,转基因的阳性率很低（4.2%）。不仅低于同实验室正常转基因小鼠获得的阳性率,甚至比同种载体骨架构建的转基因小鼠的阳性率低了近3倍。Western blot、RT-PCR和小鼠饲喂实验结果显示,外源基因不能表达。分析原因可能是外源基因的表达对小鼠胚胎具有致死效应,存活下来的转基因阳性小鼠均是外源基因插入到特殊位点阻止了基因的表达。Inverse PCR检测外源基因插入位点,分别定位到14号染色体lacZ-tagged基因内部和4号染色体RP23-451D4内部。该项工作使得利用转基因技术使家畜自身合成必需氨基酸从而减少饲料的添加成为可能。
二、我国首次利用显微操纵仪制备成功转基因小鼠（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国首次利用显微操纵仪制备成功转基因小鼠（论文提纲范文）
（1）利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起博模型（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验材料与试剂 |
| 3 主要实验仪器 |
| 4 实验方法 |
| 5 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 心脏光遗传学 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 癫痫的病因学研究进展 |
| 2.1.1 癫痫相关的神经结构与功能 |
| 2.1.2 脑结构性病因与癫痫 |
| 2.1.3 感染性病因与癫痫 |
| 2.1.4 免疫性病因与癫痫 |
| 2.1.5 代谢性病因与癫痫 |
| 2.1.6 遗传性病因与癫痫 |
| 2.2 NMDA受体基因变异与癫痫的相关性研究进展 |
| 2.2.1 NMDA受体的结构及功能 |
| 2.2.2 NMDA受体的分布 |
| 2.2.3 NMDA受体基因变异与癫痫 |
| 2.2.4 NMDA受体基因变异的药物调节 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 细胞水平评估突变的NMDA受体功能及干预药物筛选 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G转基因鼠制备 |
| 3.2.1 基因信息 |
| 3.2.2 蛋白信息 |
| 3.2.3 转基因载体构建及目的基因片段的获得 |
| 3.2.4 显微注射 |
| 3.2.5 小鼠出生与检测 |
| 3.2.6 交配扩繁 |
| 3.3 转基因鼠癫痫发病机制及精准干预药物研究 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变对 NMDA 受体功能的影响 |
| 4.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变特异性功能增强剂的筛选 |
| 4.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠行为学改变 |
| 4.3.1 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠癫痫发作的特点 |
| 4.3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠认知功能变化 |
| 4.3.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠抑郁行为的表现 |
| 4.4 通过在体及离体电生理学检测探讨 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠癫痫发病的机制 |
| 4.5 依法韦仑(EVF)对 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠行为学、电生理的影响及应用前景 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉功能的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠代谢及血压的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、实验小结 |
| 讨论 |
| 第二部分 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管结构与功能的影响 |
| 第一节 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管结构的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二节 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管张力的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三节 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉肌源性张力的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、实验小结 |
| 讨论 |
| 第三部分 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞BK通道和L-型钙通道的影响 |
| 第一节 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞BK通道的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二节 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞L-型电压依赖性钙通道的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、实验小结 |
| 讨论 |
| 第四部分 孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜血管平滑肌细胞表型的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、实验小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 糖尿病及并发症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 博士期间撰写的文章、获奖及参与的科研项目 |
| 致谢 |
（4）核桃蛋白源生物活性肽改善学习记忆机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食源性生物活性肽研究进展 |
| 1.1.1 食源性生物活性肽 |
| 1.1.2 食源性生物活性肽的市场研究 |
| 1.1.3 食源性生物活性肽的制备研究进展 |
| 1.1.4 食源性生物活性肽的生物活性研究进展 |
| 1.1.5 食源性生物活性肽的给药途径研究进展 |
| 1.2 核桃及核桃生物活性肽研究进展 |
| 1.2.1 核桃活性成分及其生理功能研究进展 |
| 1.2.2 核桃生物活性肽的分离、纯化、鉴定研究进展 |
| 1.2.3 核桃生物活性肽的生物功能和应用研究进展 |
| 1.3 学习与记忆研究进展 |
| 1.3.1 学习与记忆的影响因素 |
| 1.3.1.1 神经递质对学习与记忆的作用 |
| 1.3.1.2 脑肽与学习记忆的关系 |
| 1.3.1.3 其他影响学习与记忆的因素 |
| 1.3.2 学习和记忆障碍相关的疾病研究 |
| 1.3.3 阿尔茨海默病 |
| 1.3.4 阿尔茨海默病的流行病学研究进展 |
| 1.3.5 阿尔茨海默病的发病机理研究进展 |
| 1.3.6 阿尔茨海默病的动物模型和体外细胞模型研究进展 |
| 1.3.6.1 动物模型 |
| 1.3.6.2 行为学评价方法 |
| 1.3.6.3 体外细胞模型 |
| 1.3.7 阿尔茨海默病的治疗研究现状 |
| 1.4 食源性生物活性肽在学习记忆功能方面的研究进展 |
| 1.4.1 核桃生物活性肽在学习记忆功能方面研究进展 |
| 1.4.2 其他食源性生物活性肽在学习记忆方面研究进展 |
| 1.5 本课题选题依据和研究内容 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 核桃蛋白酶解物改善学习记忆的功效评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂与耗材 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 核桃蛋白酶解物制备 |
| 2.3.2 核桃蛋白酶解物对D-gal诱导的学习记忆损伤小鼠的行为学影响 |
| 2.3.2.1 昆明小鼠 |
| 2.3.2.2 动物分组及给药 |
| 2.3.2.3 行为学之水迷宫 |
| 2.3.3 核桃蛋白酶解物对D-gal诱导学习记忆损伤小鼠的血清和脑组织中抗氧化生化指标的影响 |
| 2.3.3.1 血清、脑组织匀浆制备 |
| 2.3.3.2 血清生化指标检测 |
| 2.3.3.3 脑组织生化指标检测 |
| 2.3.4 核桃蛋白酶解物体外抗Aβ蛋白聚集活性研究 |
| 2.3.4.1 细胞培养 |
| 2.3.4.2 核桃蛋白酶解物溶液制备 |
| 2.3.4.3 细胞活力检测 |
| 2.3.4.4 体外抗聚集可视化观察分析 |
| 2.3.4.5 流式细胞仪检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 核桃蛋白酶解物对D-gal诱导的学习记忆损伤小鼠行为学的影响 |
| 2.4.2 核桃蛋白酶解物对D-gal诱导学习记忆损伤小鼠的血清和脑组织的抗氧化活性影响 |
| 2.4.3 核桃蛋白酶解物对体外细胞模型中Aβ蛋白聚集活性的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 核桃生物活性肽分离纯化、结构鉴定及其体外抗Aβ蛋白聚集活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂与耗材 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 核桃生物活性肽分离和纯化 |
| 3.3.1.1 核桃蛋白酶解物的分子量分布检测 |
| 3.3.1.2 多肽分离纯化 |
| 3.3.2 核桃生物活性肽结构鉴定 |
| 3.3.3 核桃生物活性肽物理性质预测 |
| 3.3.4 核桃生物活性肽体外抗Aβ蛋白聚集活性评价 |
| 3.3.4.1 多肽溶液制备 |
| 3.3.4.2 细胞培养 |
| 3.3.4.3 细胞活力检测 |
| 3.3.4.4 体外抗聚集可视化分析 |
| 3.3.4.5 长时间活细胞成像观察 |
| 3.3.4.6 流式细胞仪检测 |
| 3.3.4.7 显微成像流式细胞仪检测 |
| 3.3.5 统计与分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 核桃生物活性肽分子量分布测定和分离纯化结果 |
| 3.4.2 核桃生物活性肽结构鉴定结果 |
| 3.4.3 核桃生物活性肽物理性质预测抗Aβ蛋白聚集活性 |
| 3.4.4 核桃生物活性肽体外抗Aβ蛋白聚集活性筛选 |
| 3.4.5 核桃生物活性肽PW5 体外抗Aβ蛋白聚集活性评价 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 核桃生物活性肽PW5体内改善学习记忆功效和机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂与耗材 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠的行为学影响 |
| 4.3.1.1 APP/PS1 小鼠 |
| 4.3.1.2 多肽PW5 干预 |
| 4.3.1.3 行为学检测 |
| 4.3.1.4 血清、脑组织制备 |
| 4.3.2 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠脑中Aβ淀粉蛋白的影响 |
| 4.3.2.1 固定、脱水、石蜡包埋 |
| 4.3.2.2 切片 |
| 4.3.2.3 石蜡切片常规脱腊复水 |
| 4.3.2.4 高温微波修复 |
| 4.3.2.5 免疫组化染色 |
| 4.3.2.6 显微镜下观察和图像分析 |
| 4.3.3 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠肠道菌群的影响 |
| 4.3.3.1 粪便收集和保存 |
| 4.3.3.2 提取微生物组总DNA和定量 |
| 4.3.3.3 PCR扩增 |
| 4.3.3.4 文库构建和上机测序 |
| 4.3.3.5 测序结果分析 |
| 4.3.4 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠血清代谢产物的影响 |
| 4.3.5 核桃生物活性肽PW5 对肠道菌群与血清代谢产物之间相关性的影响 |
| 4.3.6 肠道菌群对APP/PS1 小鼠Aβ淀粉蛋白的影响 |
| 4.3.6.1 APP/PS1 小鼠 |
| 4.3.6.2 抗生素配制和供体小鼠粪便制备 |
| 4.3.6.3 粪便移植及分组 |
| 4.3.6.4 肠道菌群研究 |
| 4.3.6.5 免疫荧光染色 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠行为学的影响 |
| 4.4.2 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠脑中Aβ淀粉蛋白沉积的影响 |
| 4.4.3 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠肠道菌群的影响 |
| 4.4.4 核桃生物活性肽PW5对APP/PS1 小鼠血清代谢产物的影响 |
| 4.4.5 核桃生物活性肽PW5 对肠道菌群和血清代谢产物之间相关性的影响 |
| 4.4.6 肠道菌群对APP/PS1 小鼠脑中淀粉蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 核桃生物活性肽PW5 不同给予方式对改善学习记忆功效的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂与耗材 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 核桃生物活性肽PW5 的两种不同给予方式 |
| 5.3.2 核桃生物活性肽PW5的两种不同给予方式对APP/PS1小鼠行为学的影响 |
| 5.3.3 核桃生物活性肽PW5 的两种不同给予方式对APP/PS1 小鼠脑中Aβ淀粉样蛋白沉积的影响 |
| 5.3.3.1 脑组织制备 |
| 5.3.3.2 石蜡切片、及切片染色前处理 |
| 5.3.3.3 免疫组织染色 |
| 5.3.3.4 染色结果和统计 |
| 5.3.4 核桃生物活性肽PW5的两种不同给予方式对APP/PS1小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.3.4.1 粪便样品收集 |
| 5.3.4.2 微生物组DNA提取、扩增 |
| 5.3.4.3 构建文库和上机测序 |
| 5.3.4.4 测序结果分析 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 比较PW5 肽的两种不同给予方式对APP/PS1 小鼠行为学的影响 |
| 5.4.2 比较PW5 肽的两种不同给予方式对APP/PS1 小鼠脑中Aβ淀粉蛋白沉积的影响 |
| 5.4.3 比较PW5 肽的两种不同给予方式对APP/PS1 小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）利用单细胞测序技术研究骨髓源细胞在肝癌起源中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、骨髓来源的细胞参与肝癌起源 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要引物序列 |
| 1.1.5 主要实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 成功构建骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型 |
| 1.2.2 冰冻组织免疫荧光初步提示肝癌的骨髓起源 |
| 1.2.3 分离获取小鼠肝癌组织单细胞 |
| 1.2.4 单细胞全基因组扩增后质检和测序用DNA文库质检 |
| 1.2.5 小鼠肝癌单细胞的CNA模式 |
| 1.2.6 小鼠单细胞的CNA事件矩阵和系统发生树的构建 |
| 1.2.7 小鼠肝癌单细胞基因组中GFP序列的存在情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 BMDCs参与多种实体瘤的发生 |
| 1.3.2 利用单细胞测序技术进行肿瘤研究的必要性 |
| 1.4 小结 |
| 二、参与肝癌起源的骨髓细胞类型研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要引物序列 |
| 2.1.5 主要实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 去除BM-MSCs对小鼠肝癌成瘤率的影响 |
| 2.2.2 冰冻组织免疫荧光初步提示肝癌的骨髓起源 |
| 2.2.3 全骨髓移植组小鼠肝癌单细胞的CNA模式 |
| 2.2.4 全骨髓移植组小鼠单细胞的CNA事件矩阵和系统发生树的构建 |
| 2.2.5 全骨髓移植组小鼠肝癌单细胞基因组中GFP序列的存在情况 |
| 2.2.6 全骨髓移植组小鼠肝癌揭示HCC发生早期的CNA模式 |
| 2.2.7 CD45~+骨髓移植组小鼠肝癌单细胞的CNA模式 |
| 2.2.8 CD45~+骨髓移植组小鼠单细胞的CNA事件矩阵和系统发生树的构建 |
| 2.2.9 CD45~+骨髓移植组小鼠肝癌单细胞基因组中GFP序列的存在情况 |
| 2.2.10 流式细胞术分析CD45 磁珠富集的特异性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BM-MSCs在 HCC发生发展过程中具有双向作用 |
| 2.3.2 BM-MSCs在临床肝癌治疗中的应用前景和局限性 |
| 2.4 小结 |
| 三、骨髓来源的细胞参与肝癌起源的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂耗材 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 主要实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 免疫荧光-荧光原位杂交技术检测细胞融合的可能性 |
| 3.2.2 小鼠肝癌单细胞CNAs揭示肝癌的进化模式 |
| 3.2.3 骨髓移植后DEN诱导形成的小鼠HCC和人HCC具有一定相似性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BMDCs相关细胞融合促进肿瘤进展 |
| 3.3.2 DEN诱导小鼠肝癌模型的临床相关性 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述原发性肝癌起源细胞的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 中英文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 Tet调控系统的构建 |
| 1.1 Tet-off调控系统 |
| 1.2 Tet-on调控系统 |
| 1.3 Tet调控系统的特点 |
| 1.4 Tet调控系统的前景展望 |
| 2 生长激素的研究 |
| 2.1 生长激素的发现 |
| 2.2 生长激素基因簇的组成 |
| 2.3 生长激素基因的表达 |
| 2.4 生长激素基因的调节 |
| 2.5 生长激素表达的发育阶段性调控 |
| 2.6 生长激素的生理生化作用 |
| 2.7 生长激素的作用方式 |
| 2.8 生长激素自分泌机制研究 |
| 2.9 生长激素的临床应用 |
| 3 猪生长激素的研究 |
| 3.1 猪生长激素基因的发现 |
| 3.2 猪生长激素基因的定位和分子结构 |
| 3.3 猪生长激素基因的保守性 |
| 3.4 猪生长激素基因的多态性 |
| 3.5 猪生长激素基因的分泌规律 |
| 3.6 猪生长激素生理学功能 |
| 3.7 猪生长激素在生产中的使用 |
| 3.8 猪生长激素的应用前景 |
| 4 GH参与肌肉发育的研究现状 |
| 5 利用转基因动物模型研究GH生理功能的现状 |
| 6 研究目的和意义 |
| 7 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 可控表达GH基因真核表达载体构建及功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物信息 |
| 1.6 试验方法 |
| 1.7 诱导表达pGH细胞系的建立 |
| 1.8 诱导型表达GH单质粒表达载体(pTTGH)的构建 |
| 1.9 诱导型表达GH单质粒表达载体(pTTGH)在细胞中的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 条件表达载体pTRE-GH的构建 |
| 2.2 诱导表达pGH细胞系的建立 |
| 2.3 诱导型表达GH单质粒表达载体(pTTGH)的构建 |
| 2.4 诱导型表达GH单质粒表达载体(pTTGH)在PIEC细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 可控表达pGH转基因小鼠模型的建立与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及饲养环境 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物信息 |
| 1.6 利用原核显微注射法进行转基因小鼠的制备 |
| 1.7 G0代转基因小鼠基因整合检测 |
| 1.8 后代转基因小鼠表达检测 |
| 1.9 转基因小鼠诱导试验 |
| 1.10 转基因小鼠血清中外源GH放免测定 |
| 1.11 转基因小鼠血清中IGF-1酶免测定 |
| 1.12 转基因小鼠血液生化及血常规检测 |
| 1.13 转基因小鼠组织学检查 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原核显微注射质粒基因的酶切和纯化 |
| 2.2 G0代转基因小鼠基因整合检测结果 |
| 2.3 G0代转基因小鼠基因表达检测结果 |
| 2.4 后代转基因阳性小鼠扩繁培育 |
| 2.5 后代转基因小鼠的整合检测结果 |
| 2.6 后代转基因小鼠表达检测结果 |
| 2.7 后代转基因小鼠的诱导试验 |
| 2.8 转基因小鼠血清中外源GH放免测定 |
| 2.9 转基因小鼠血清中内源IGF-1酶免测定 |
| 2.10 转基因小鼠血液生化及血常规检测 |
| 2.11 转基因小鼠组织学检查 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 转基因小鼠和非转基因小鼠的iTRAQ分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 质谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2 酶解肽段浓度测定 |
| 2.3 肽段SCX检测分级 |
| 2.4 蛋白质鉴定结果 |
| 2.5 定量分析 |
| 2.6 生物信息分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新与特色 |
| Abstract |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）利用非天然氨基酸扩充脊椎动物的遗传密码子研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 第二章 稳定遗传AzFRS/tRNA_(CUA)基因的转基因小鼠构建 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 3.1 异源aaRSs/tRNA_(CUA)正交对表达载体的优化构建 |
| 3.2 RS(tRNA)_(nx)质粒在HEK293T细胞中的正交性检测与比较 |
| 3.3 RS(tRNA)_(4x)表达质粒在MEF细胞中的功能正交性检测 |
| 3.4 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠的构建及鉴定 |
| 3.5 RS(tRNA)_(4x)基因在转基因小鼠中有效生殖传递及其拷贝数 |
| 3.6 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠的主要组织中均表达AzFRS |
| 第四节 小结 |
| 第三章 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠生理功能检测 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 3.1 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠与WT小鼠主要组织的HE染色无显着差异 |
| 3.2 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠与WT小鼠肝脏组织的转录组比较 |
| 3.3 RS(tRNA)_(4x)转基因小鼠与WT小鼠血液生化指标并无显着差异 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 转基因小鼠来源的原代细胞内基因编码AzF |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 3.1 AZF在转基因小鼠的神经细胞中的定点整合 |
| 3.2 AzF在转基因小鼠的骨髓细胞中的定点整合 |
| 3.3 AZF不能在转基因小鼠的成纤维细胞中定点整合 |
| 第四节 小结 |
| 第五章 遗传密码子扩充的转基因斑马鱼的构建 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果与讨论 |
| 3.1 利用Tol2转座子技术构建RS(tRNA)_(4x)转基因斑马鱼 |
| 3.2 AzF在RS(tRNA)_(4x)转基因斑马体内的定点整合 |
| 第四节 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 用于原核注射的载体RS(tRNA)_(4x)序列 |
| 附录Ⅱ 本论文中所用引物序列列表 |
| 附录Ⅲ 略缩词表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（8）利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡生殖系嵌合潜能干细胞概述 |
| 1.1.1 胚盘细胞和胚胎干细胞及应用 |
| 1.1.2 原始生殖细胞及应用 |
| 1.1.3 胚胎生殖细胞及应用 |
| 1.1.4 精原干细胞及应用 |
| 1.2 禽类遗传修饰方法的研究进展 |
| 1.2.1 病毒载体法 |
| 1.2.2 原始生殖细胞法 |
| 1.2.3 转座子高效转座法 |
| 1.2.4 定点基因组编辑法 |
| 1.2.5 体内直接转染法 |
| 1.2.6 制备鸡的遗传修饰模型的意义及应用前景 |
| 1.3 制备高效的生殖系嵌合体的研究进展 |
| 1.3.1 制备高效的生殖系嵌合体的前期探索 |
| 1.3.2 不育受体模型的研究意义及应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 2.1.2 实验鸡蛋和种母鸡 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 原始生殖细胞的分离 |
| 2.2.4 原始生殖细胞的体外培养 |
| 2.2.5 体外培养的原始生殖细胞的特征分析 |
| 2.2.6 G_0代嵌合体鸡的制备与鉴定 |
| 2.2.7 G_1代阳性鸡的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 单基因CRISPR/Cas9靶点的设计与突变分析 |
| 2.2.9 全基因组CRISPR/Cas9靶点的设计 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 利用piggyBac转座子系统制备遗传修饰鸡 |
| 3.1.1 PGCs的分离与培养 |
| 3.1.2 构建piggyBac转座子系统相关质粒 |
| 3.1.3 制备G_0代基因修饰的嵌合体公鸡 |
| 3.1.4 利用G_0代嵌合体获得G_1代遗传修饰鸡 |
| 3.2 利用CRISPR/Cas9技术规模化构建鸡的全基因组突变 |
| 3.2.1 利用CRISPR/Cas9技术在鸡的细胞中实现单基因编辑 |
| 3.2.2 利用生物信息学方法设计针对鸡的全基因组的sgRNA文库 |
| 3.2.3 结合Tet-On调控系统构建piggyBac介导的鸡的CRISPR/Cas9文库 |
| 3.2.4 制备CRISPR/Cas9文库的G_0代嵌合体 |
| 3.2.5 获得CRISPR/Cas9文库的G_1代突变体鸡 |
| 3.3 利用Tet-On与TMP双调控系统制备雄性不育鸡品系 |
| 3.3.1 Tet-On与TMP双调控系统质粒的构建 |
| 3.3.2 Tet-On与TMP双调控系统在PGCs中的应用 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 PGCs的体外培养 |
| 4.2 可调控的CRISPR/Cas9系统制备规模化突变体 |
| 4.3 利用双调控系统构建雄性不育受体模型 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附表S1 本论文中所用引物序列 |
| 附表S2 G_0代嵌合体中sgRNAs深度测序结果分析 |
| 附表S3 统计文库设计及二代测序检测到的sgRNAs在每条染色体上的分布情况 |
| 个人简历 |
（9）转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 溶栓药物与人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)及其重组突变体的研究进展 |
| 1 血栓的概述 |
| 1.1 血栓的形成 |
| 1.2 溶栓机理 |
| 2 溶栓药物及其市场发展前景 |
| 2.1 溶栓药物的发展历程 |
| 2.2 溶栓药物的市场发展前景 |
| 3 人组织纤溶酶原激活剂的概述 |
| 3.1 概念及溶栓原理 |
| 3.2 人组织纤溶酶原激活剂的发展简史 |
| 3.3 人组织纤溶酶原激活剂的结构与功能分析 |
| 4 重组突变体人组织纤溶酶原激活剂的研究 |
| 4.1 国外的研究情况 |
| 4.2 国内的研究情况 |
| 5 问题与展望 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1 乳腺生物反应器的概述 |
| 2 乳腺生物反应器的转基因技术 |
| 2.1 逆转录病毒载体法(retrovirus-mediated gene transfer) |
| 2.2 原始生殖细胞介导法(primordial germ cells,PGCs) |
| 2.3 精子载体法(sperm mediated gene transfer) |
| 2.4 胚胎干细胞技术(embryonic stem cell,ESC) |
| 2.5 体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transplantation,SCNT) |
| 2.6 显微原核注射法(pronuclear microinjection) |
| 3 乳腺生物反应器的目标动物选择 |
| 4 乳腺生物反应器的应用 |
| 4.1 转基因动物乳腺生物反应器模型的建立 |
| 4.2 改善乳汁成分,提高其营养价值 |
| 4.3 生产(重组)医药蛋白 |
| 4.4 利用乳腺生物反应器生产t-PA及其重组突变体 |
| 5 展望与问题 |
| 第三章 乳蛋白分离纯化的研究进展 |
| 1 蛋白分离纯化的概述 |
| 1.1 一般蛋白的分离纯化 |
| 1.2 乳腺生物反应器生产重组蛋白的分离纯化 |
| 2 乳蛋白常用分离纯化技术(层析技术) |
| 2.1 反相层析(Reversed phase chromatography,RPC) |
| 2.2 疏水层析(Hydrophobic interaction chromatography,HIC) |
| 2.3 离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC) |
| 2.4 凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography,GFC) |
| 2.5 亲和层析(Affinity chromatography,AC) |
| 3 t-PA及其重组突变体的分离纯化 |
| 4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 前言 |
| 第一章 乳腺特异性表达rhPA基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种及质粒 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 分子生物学试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 DNA分析软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规分子生物学的操作方法 |
| 2.2 质粒酶切反应 |
| 2.3 酶切产物的回收 |
| 2.4 连接反应 |
| 2.5 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)基因的PCR扩增与克隆 |
| 2.6 乳腺特异性表达载体PCL25/rhPA的构建 |
| 2.7 乳腺特异性表达载体BLC14/rhPA的构建 |
| 2.8 乳腺特异性表达载体AP/rhPA的构建 |
| 2.9 PCR检测插入rhPA基因片段的正反向 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增产物rhPA的T-A克隆 |
| 3.2 载体PCL25/rhPA的构建 |
| 3.3 载体BLC14/rhPA的构建 |
| 3.4 载体AP/rhPA的构建 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞(GMECs)中的初步验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械与仪器 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 山羊乳腺上皮细胞分离和培养 |
| 2.2 外源基因电转染山羊乳腺上皮细胞及筛选 |
| 2.3 抗性细胞株的PCR整合检测 |
| 2.4 山羊乳腺上皮细胞诱导表达rhPA的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 乳腺上皮细胞的分离纯化培养及生长特点 |
| 3.2 转基因乳腺上皮细胞单克隆细胞株的获得 |
| 3.3 ELISA检测乳腺上皮细胞诱导rhPA表达 |
| 3.4 FAPA检测诱导液体外溶栓活性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 rhPA转基因免的制备及其乳腺表达特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂及药品 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因的准备 |
| 2.2 转rhPA基因免的制备 |
| 2.3 转基因免的整合检测 |
| 2.4 转基因兔乳腺表达产物分析 |
| 2.5 转基因免的传代及纯合子培育 |
| 2.6 荧光定量PCR检测转基因免的拷贝数 |
| 3 结果 |
| 3.1 显微注射基因片段的回收 |
| 3.2 转基因兔的获得与传代 |
| 3.3 转基因免乳清的E LISA检测结果 |
| 3.4 转基因免乳清的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测结果 |
| 3.5 体外溶栓检测结果 |
| 3.6 Real-time PCR结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 rhPA单克隆抗体的制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株/系 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂及药品 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 细胞融合过程 |
| 2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.4 杂交瘤细胞株的克隆化 |
| 2.5 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的特异性鉴定、稳定性分析及建株 |
| 2.7 PR-mAb的筛选 |
| 2.8 rhPA单克隆抗体的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 两种不同方法的免疫小鼠血清效价检测结果 |
| 3.2 两种不同方法的细胞融合结果 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆(克隆化)及稳定性 |
| 3.5 杂交瘤细胞株的建立及其分泌抗体特异性检测 |
| 3.6 PR-mAb的筛选结果 |
| 3.7 腹水的制备及效价测定 |
| 3.8 腹水抗体的纯化及鉴定 |
| 3.9 纯化抗体效价浓度和特异性反应结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 转基因免乳中rhPA的分离纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 乳原料 |
| 1.2 主要器材 |
| 1.3 主要试剂及药品 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 转基因兔乳前处理 |
| 2.2 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rhPA |
| 2.3 凝胶过滤法进一步精纯 |
| 2.4 双向电泳鉴定纯化产物 |
| 2.5 飞行时间质谱鉴定纯化产物 |
| 2.6 圆二色谱分析纯化产物的二级结构 |
| 2.7 FAPA测定纯化产物(rhPA)的比活性 |
| 3 结果 |
| 3.1 乳样前处理的结果 |
| 3.2 亲和层析柱的制备 |
| 3.3 亲和层析洗脱条件优化结果 |
| 3.4 凝胶过滤不同上样体积优化结果 |
| 3.5 纯化产物的初步鉴定 |
| 3.6 双向电泳的结果与分析 |
| 3.7 飞行时间质谱与圆二色谱结果 |
| 3.8 纯化产物rhPA的比活性计算 |
| 4 讨论 |
| 第六章血栓模型与溶栓动物试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器和材料 |
| 1.3 主要试剂和药品 |
| 2 方法 |
| 2.1 纯化产物去除内毒素 |
| 2.2 内毒素检测 |
| 2.3 血栓动物模型的制备 |
| 2.4 溶栓动物试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 去内毒素及检测结果 |
| 3.2 血栓模型制备结果 |
| 3.3 溶栓动物试验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 全文结论与创新点 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文 |
（10）苏氨酸合成相关基因在C2C12和NIH-3T3细胞及小鼠体内的表达和作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苏氨酸研究概述 |
| 1.1.1 必需氨基酸简介 |
| 1.1.2 苏氨酸的理化性质及生物合成途径 |
| 1.1.3 苏氨酸的分解代谢 |
| 1.1.4 苏氨酸的生理功能及需求量 |
| 1.2 转基因动物概述 |
| 1.2.1 转基因动物制备方法 |
| 1.2.2 转基因动物的应用 |
| 1.3 本课题研究进展及意义 |
| 1.3.1 苏氨酸生产现状 |
| 1.3.2 动物合成苏氨酸进展 |
| 1.3.3 多顺反子载体构建 |
| 1.3.4 本课题研究意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体、菌株和细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 分析工具软件和网址 |
| 2.1.6 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态细菌的准备(CaCl_2法) |
| 2.2.2 感受态细菌效价测定 |
| 2.2.3 质粒DNA的转化 |
| 2.2.4 质粒小量提取 |
| 2.2.5 质粒大量提取 |
| 2.2.6 融合PCR |
| 2.2.7 PMD19-T vector连接 |
| 2.2.8 限制性内切酶切割DNA |
| 2.2.9 DNA片段的回收 |
| 2.2.10 外源基因与载体的连接 |
| 2.2.11 总RNA提取 |
| 2.2.12 反转录和PCR扩增 |
| 2.2.13 Western blot |
| 2.2.14 转基因小鼠的制备 |
| 2.2.15 鼠尾DNA提取 |
| 2.2.16 Southern blot |
| 2.2.17 细胞培养 |
| 2.2.18 HPLC检测氨基酸浓度 |
| 2.2.19 Inverse PCR |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 苏氨酸合成相关基因在小鼠细胞中的表达和作用 |
| 3.1.1 苏氨酸合成相关基因的密码子优化及合成 |
| 3.1.2 天冬氨酸合成苏氨酸表达载体的构建 |
| 3.1.3 载体在小鼠细胞中的表达分析 |
| 3.1.4 载体在小鼠细胞中合成苏氨酸的作用分析 |
| 3.2 小鼠细胞中以高丝氨酸为底物合成苏氨酸的分析 |
| 3.2.1 以高丝氨酸为底物合成苏氨酸的分析 |
| 3.2.2 以高丝氨酸为底物合成苏氨酸表达载体的构建 |
| 3.2.3 载体在小鼠细胞中的表达分析 |
| 3.2.4 载体在小鼠细胞中合成苏氨酸的作用分析 |
| 3.3 小鼠细胞中以天冬氨酸为底物合成高丝氨酸的分析 |
| 3.3.1 其他代谢途径在通路中的作用验证 |
| 3.3.2 基因表达量在通路中的作用验证 |
| 3.3.3 辅酶在通路中的作用验证 |
| 3.3.4 单功能酶合成高丝氨酸的作用分析 |
| 3.4 高丝氨酸合成苏氨酸通路在转基因小鼠中的表达和作用 |
| 3.4.1 转基因小鼠模型的构建和鉴定 |
| 3.4.2 转基因的表达分析 |
| 3.4.3 苏氨酸在小鼠生长中的作用分析 |
| 3.4.4 转基因的拷贝数及基因定位 |
| 第四章 分析和讨论 |
| 4.1 载体的构建 |
| 4.2 苏氨酸合成基因在小鼠细胞中的表达 |
| 4.3 HPLC检测氨基酸浓度 |
| 4.4 天冬氨酸合成高丝氨酸通路在小鼠细胞中的作用 |
| 4.5 外源基因在转基因小鼠中的沉默 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、我国首次利用显微操纵仪制备成功转基因小鼠（论文参考文献）
- [1]利用光遗传学技术构建小鼠光控心脏起博模型[D]. 葛焰. 西南医科大学, 2021(01)
- [2]NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究[D]. 赵腾. 吉林大学, 2021(01)
- [3]孕期高糖饮食对老年雄性子代大鼠肠系膜动脉功能的影响及机制研究[D]. 冯雪芹. 苏州大学, 2020(06)
- [4]核桃蛋白源生物活性肽改善学习记忆机制研究[D]. 王敏. 华南理工大学, 2019(06)
- [5]利用单细胞测序技术研究骨髓源细胞在肝癌起源中的作用[D]. 郭飘. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究[D]. 张建斌. 山西农业大学, 2018(06)
- [7]利用非天然氨基酸扩充脊椎动物的遗传密码子研究[D]. 陈宇庭. 华东师范大学, 2017(01)
- [8]利用piggyBac转座子及CRISPR文库规模化制备突变体鸡的研究[D]. 高菲. 中国农业大学, 2017(05)
- [9]转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）及其药效学研究[D]. 宋绍征. 扬州大学, 2016(02)
- [10]苏氨酸合成相关基因在C2C12和NIH-3T3细胞及小鼠体内的表达和作用[D]. 张玉蕊. 中国农业大学, 2014(03)